法对上述毛状根的总DNA进行分子检测。结果表明，转基因毛状根根系中检测到和阳性对照 (PCAMBIA2300+: :SmMYB75质粒为模板)大小相当的PCR产物;而以农杆菌C58C1空菌侵染丹 参所得的毛状根的基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，结果说明SmMYB75基因已经 整合到丹参基因组中。
[0082] 本实施例将所述的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的植物表达 载体的发根农杆菌菌株C58C1，利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经 PCR检测为阳性克隆的转基因毛状根。转基因丹参毛状根的获得为筛选高产丹酚酸的毛状 根提供了直接素材。
[0083] 本实施例中选择发根农杆菌C58C1是一种优选实施方式，在实际选择上，发根农杆 菌的菌株不限于C58C1，可以根据具体情况选择其他菌株。
[0084] 实施例8
[0085] 定量PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
[0086] 8.1.毛状根液体培养
[0087]选择实施例7中生长快、分枝好的毛状根，在超净工作台上剪取2-3cm用无菌蒸馏 水冲洗掉其表面上的琼脂后接入装有lOOmL的1/2MS液体培养基继代一次，60天后收获，取 适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箱纸包装好进入液氮中冷冻后保存于-80 °C用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹参酮丹酚酸含量的提取。
[0088] 8.2. RNA的提取及cDNA第一链的合成
[0089]方法同实施例1中的步骤1.1 [0090] 8.3引物的设计和合成
[0091]根据丹参基因 SmMYB75及丹参酮与丹酚酸生物合成相关基因的编码序列分别用 Primerf.O设计引物用于检测丹参毛状根中相关基因的表达情况，看家基因 Actin用来作为 内参。所用引物由上海生工生物工程公司合成。
[0092] 定量PCR的引物如下：
[0093]
[0094] 8.4.转基因丹参毛状根的定量PCR检测
[0095]以相同量的上述cDNA(稀释10倍)第一链为模板，分别用上述设计的引物进行定量 PCR扩增。参照美国Applied Biosystem公司生产的Biosystem StepOne仪器的说明书进行 定量PCR操作，采用全式金公司的定量PCR试剂盒。定量PCR反应体系如下：
[0096]
[0097] PCR反应条件：94°C 5分钟，40个循环（94°C变性30秒，60°C退火30秒，72 °C延伸30 秒），72°C10分钟。目的基因及看家基因各做三次重复。
[0098] 定量PCR结果显示：相比空载体根系，SmMYB75基因在过表达根系中的表达量明显 提高，但不同克隆之间的表达量有一定的差异，其中表达量较高的为克隆9、14、18、19、23号 (见图6)。与此同时，SmMYB75在丹参毛状根中过表达后，丹酚酸代谢途径中的关键酶基因的 表达量均明显提高，说明SmMYB75能促进丹酚酸生物合成途径中相关基因的表达(见图7)。 [0099] 据文献报道，MYB转录因子可通过结合下游靶基因启动子上的顺式作用元件来调 控下游靶基因的表达。对丹酚酸合成途径中的关键酶基因启动子进行分析，发现受SmMYB75 响应的基因启动子上含有MYB的顺式作用元件，因此推测SmMYB75通过结合启动子上的顺式 作用元件来调控关键酶基因的表达，从而调控丹酚酸的合成。
[0100] 实施例9
[0101] 利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹酚酸含量
[0102] 9.1.毛状根中丹酚酸含量的提取
[0103] 将实施例4收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取O.lg毛状根粉末于 50mL离心管中，加入10mL乙醇：水（4:1，v/v)，超声20min，8000rpm，离心10min，吸取上清萃 取液于旋转蒸发仪中70°C真空干燥，残余物重新用2mL的双蒸水溶解，将样品用0.22μπι的滤 膜过滤后待测。
[0104] 9.2.毛状根中丹酚酸含量的HPLC测定
[0105] 精密称取丹酚酸Α、丹酚酸Β、迷迭香酸和咖啡酸标准品用甲醇分别配置成浓度为 ImM的标准品贮备液，保存于-20 °C备用。
[0106] 色谱条件:色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈:水(30:70)，水用磷酸调节PH 为2 · 03，检测波长281nm，柱温35 °C，流速lmL/min。
[0107] 将上述标准品贮备液分别取5μ1，10μ1，20μ1，30μ1，40μ1在相应色谱条件下进样， 四种水溶性成分完全分离，且峰型良好，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Υ)对标准品 浓度(X，mg/mL)进行回归分析。
[0108] 上述0.22μπι滤膜过滤后的丹酚酸粗提物各取10yL，用高效液相色谱仪检测，记录 各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品水溶性成分的含量。
[0109] 在本发明中，除咖啡酸的含量无明显的上下调关系外，相对于对照组，迷迭香酸、 丹酚酸A、丹酚酸B三种丹酚酸的含量明显上调，总丹酚酸的含量也明显提高。其中，表达量 最高的转基因毛状根中丹酚酸的含量(167.25)为对照组(73.7)的2.26倍(见图8)。
[0110] 本发明采用转SmMYB75基因的代谢工程策略获得了高产丹酚酸的丹参转基因毛状 根根系，为大量生产丹酚酸、缓解丹酚酸药源紧缺问题提供了一种新型有效方法。
[0111] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
[0112] <110>上海师范人学 <120>转基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法 <160>21 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211>645 <212> DNA <2)3> ]、[智、Siihiu miliiniThizu) <400> 1 ATGGGAAGAT CCGCTTGCTG CTCAAAAGTG GGCTTGCGTA GAGGCCCTTG GTCTACCAAA 60 GAGGACTCCC TTCTCGCCTC CTACATCCAG CAACACGGCG AAGGCCAATG GCGATCCCTC 120 CCCAAGSAAG CC.GGGCT.GCT i3：G:GGTGCGGA Α???ΘΟΤΘΟΑ. GATTQAGATC3 GATGKACTST 1.80 CTGCGGCCGG GGATCAAGCG AGGGAACATA AGCGAGGATG AAGAGGATCT GATTGTGAGG 240 CTGCACCGCC TCCTCGGCAA CCGATGGTCC CTCATCGCAG GCCGATTGCC AGGTCGAACC 30Q GACAATGAGA TTAAGAACTA CTGGAACACG CATCTCCTCA AGAAGCTCAA TACCGCCGCC 36Q GCCGCCGCCG ACAAGAAAAA GATTAAGAAG CCGCCGAAGA AATCAGCTGC TGCTGCGGCG 42Q GCATCCCAAG ATATGAAAAA TAGCAAAGTC TACGCGCCCA AACCCATGAG AGTCTCCTCG 480 CGGAGCGACA GCGACGACAG CTTGGGGAGC AGCGACGGCG CGCCGGAGGT GCTeGTeTCC 540 GCCTGGCCGG AGGTGGAGGA TCCGGCGGCG CTCTACCACT TCTCGGATTC CTTCGCCGST 60G GACATGTGGG AGAAAGTCTA CGCCGAGTAT ATGCAGCTTC TTTAA 645 ^210>2 <211 >22： <212> DNA <213》SmMYB:75-460QF 引物序列 <400> 2 AAACCCATGA GAGTCTCCTC G( 22 <2103 <211>24 <212〉DNA <213> S:mMYB75-622QR 写丨物序列 <400> 3 TTAAAGAAGC TGCATATACT C GGC 24 <210>4 <21!>22 <212>DNA <213> SmAclin-IOlIQF 引物i:':歹L <400> 4 AGGACCGAGC AGCATGAAGA TT 22
[0113] <21()>5 <21]>22 <212>DMA <2 ] 3> SmActin-121OQR 引物)列 <400 5 AGCAAAGCAG CGAACGAAGA GT 22 <210>6 <211>22 <212> DNA <2 丨 3> SmPALl-i938QF 引物序列 <4〇()> 6 GATAGCGGAG TGCAGGTCGT AC 22 <2