生物的特征区域与所述目标微生物类群的其它所述微 生物间差异碱基的最小值;Ll为所述目标微生物类群的特征区域的长度;L2为所述目标微 生物的标准基因型的长度;E为碱基错误率。
[0037] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明提供的方法不需要对微 生物进行预培养与增殖，耗时短，可同时检测多种微生物，通量高，计数时抽样量大，检测结 果精细，能够对分类单元进行区分，无需大量的DNA并避免了富集培养，检测结构无噪音且 准确，对于低含量微生物的定量准确度高，且对于微生物定性和定量的检测结果准确、分辨 率高、灵敏度高、有概率保障，检测过程简单、快速且流程规范。
【具体实施方式】
[0038] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一 步地详细描述。本发明中未标注说明的试剂均为常用市售试剂，在大多数生物技术公司均 可购买到且效果几乎无差别。
[0039] 实施例
[0040] 水稻白叶枯菌的鉴定
[0041] 本实施例从中国科学院海南陵水实验基地中，取自然感染了白叶枯病的水稻叶片 作为待测样品，通过本发明实施例提供的方法对所取的水稻叶片中的白叶枯菌进行定性、 定量检测。
[0042] 步骤一、确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、W及不存 在于待测样品中的参考微生物，具体方法如下：
[0043] 目标微生物类群的数目^ 1个，且每个目标微生物类群包括种目标微生物；目 标微生物可W为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生动物中 的至少一种。本实施例的目的是鉴定水稻白叶枯病，因此，只关屯、待测样品中的白叶枯菌， 该白叶枯菌属于细菌，其拉下学名为Xanthomonas oryzae pv.O巧zae，而已知参考基因组 的水稻白叶枯菌生理小种包括1(4〇：、魁。。、？乂0994、化5256和?乂086共5个生理小种，因此，运 5个生理小种构成本实施例的目标微生物类群。在运5个生理小种中，PX099A生理小种的致 病性最强，作为目标微生物。
[0044] 参考微生物可W为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和 原生动物中的至少一种。参考微生物不存在于待测样品中。参考微生物的作用是为待测样 品中的目标微生物类群和目标微生物的定量提供一个参照。由于根癌农杆菌存在于根中， 不存在于叶片中，所W不存在于待测样品中，因此，在本实施例中选取根癌农杆菌作为参考 微生物，根癌农杆菌属于细菌，其拉下学名为Agrobacterium tumefaciens K84。
[0045] 具体地，确定待测样品中的非目标生物的方法包括:将非目标生物确定为除目标 微生物类群之外的所有生物，若能获得目标微生物类群的特征区域，则非目标生物指除目 标微生物类群之外的所有生物，其中，所有生物是指具有参考基因组的生物，是非目标生物 的最严格的标准。在本实施例中，将非目标生物确定为目标微生物类群之外的所有己知生 物时，可W找到白叶枯菌的特征区域(特征区域的获取过程见后，结果见表1)，因此，本实施 例中的非目标生物可W为除白叶枯菌之外的所有生物的集合。
[0046] 将非目标生物确定为除目标微生物类群之外的所有生物，若不能获得目标微生物 类群的特征区域，则非目标生物指混合样品中，除目标微生物类群之外的其它生物，W缩小 非目标生物的范围，增加找到目标微生物类群的特征区域的可能性。在混合样品中，除目标 微生物类群之外的其它生物可根据经验确定，例如，本实施例中，混合样品包括水稻样品和 参考微生物，则混合样品不可能存在动物成份W及专性寄生于动物的微生物，因此，若将本 实施例中非目标生物确定为目标微生物类群之外的所有己知生物时，无法获得目标微生物 的特征区域，则非目标微生物可W确定为除白叶枯菌、动物、专性寄生于动物的微生物之外 的生物的集合。
[0047]步骤二、根据目标微生物类群的参考基因组序列、目标微生物的参考基因组序列、 参考微生物的参考基因组序列和非目标生物的参考基因组序列，获得目标微生物类群的特 征区域、目标微生物的特征区域和参考微生物的特征区域，具体方法如下：
[004引目标微生物类群的特征区域为目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核 酸序列；目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在参考基因组中为单一序列；目标微生 物类群的特征区域的两侧的序列在目标微生物类群内不同微生物间保守；目标微生物类群 的特征区域的区分度含3。非特征区域不为目标微生物类群的特征区域，非特征区域是指混 合多重扩增引物W混合样品的核酸为模板的扩增产物；区分度是指由同一混合多重扩增引 物扩增的任一目标微生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最小值，若 无非特征区域，则区分度=3 XL1/4,其中，Ll为目标微生物类群的特征区域的核酸序列长 度。
[0049] 具体地，目标微生物类群的特征区域用于代表目标微生物类群，目标微生物类群 的特征区域存在，则代表目标微生物类群存在，目标微生物类群的特征区域的测序片段的 数量，代表目标微生物类群的数量。理想的目标微生物类群的特征区域的多重引物只扩增 目标微生物类群的特征区域，不能扩增非目标生物。运就要求目标微生物类群的特征区域 的两侧序列，即引物设计区域在非目标生物中不同源，那么，非目标生物不能被扩增，也不 能产生非特征区域。此时，特征区域与非特征区域间只能随机产生相同碱基，碱基共4种，相 同与不同的概率分别为1/4和3/4,因此，区分度为3XL1/4。目标微生物类群的特征区域的 区分度含3是为了保证目标微生物类群的特征测序片段判断的假阳性率与假阴性率都较 低，其原理见表2。目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在目标微生物类群内不同微生 物间保守，就可W用相同的引物扩增目标微生物类群内的不同微生物，W排除扩增效率对 目标微生物类群不同微生物间的相对定量的影响。
[0050] 目标微生物的特征区域与目标微生物类群的特征区域同源；目标微生物的特征区 域的m2值含2，其中，m2值为目标微生物的特征区域与目标微生物类群内除目标微生物外的 其它微生物间的差异碱基数的最小值。本实施例中的其它微生物是指除目标微生物PX099A 生理小种外目标微生物类群白叶枯菌的另外4种生理小种:KACC、MAFFJLS256和PX086，m2 值为目标微生物(PX099A生理小种）的特征区域分别与运4种生理小种同源区域比较，所获 得的4种差异碱基数目中的最小值。目标微生物定性与定量分析时，重点是与目标微生物类 群内其它微生物进行区分。目标微生物与目标微生物类群亲缘关系往往较近，序列间相似 性高，因此，难W区分。在目标微生物定性与定量分析时，只关注了扩增子中与目标微生物 类群内其它微生物间有差异的标准基因型，减少了误差的来源，从而可W更好地将目标微 生物从目标微生物类群内区分出来。当m2含2时，判断测序片段为目标微生物的特征测序片 段的假阳性率与假阴性率都较低，因此，可W将目标微生物从目标微生物类群中区分出来， 其原理见表2。
[0051] 参考微生物的特征区域为参考微生物的参考基因组上的核酸序列;参考微生物的 特征区域的两侧的序列在参考微生物的参考基因组中为单一序列;参考微生物的特征区域 的两侧的序列在除参考微生物外的其它生物中不具有同源性。
[0052] 本实施例中，区分度是目标微生物类群的特征区域的唯一选择标准，根据检测目 的的不同，也可W将具有特定基因序列的微生物作为目标微生物类群，并且将特定基因序 列作为目标微生物类群的特征区域。例如，可W将具有特定致病基因的微生物作为目标微 生物类群，并将该致病基因作为目标微生物的特征区域，W便根据致病基因的类型，指导用 药。同样，耐药性基因作为特定基因序列也可W指导用药。
[0053] 步骤S、制备扩增目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增目标微 生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增参考微生物的特征区域的第=多重扩增引物， 将第一多重扩增引物、第二多重扩增引物和第=多重扩增引物混合得到混合多重扩增引 物。
[0054] 结合步骤二和步骤=具体方法如下：
[0化5] 在f tp: //f tp. ncbi . nlm. nih. gov/genomes/中下载目标微生物类群（白叶枯菌）中 的5种生理小种的基因组序列，采用软件Megablast(版本2.2.26)将它们的基因组与query 序列（参考序列）进行比对分析，本实施例中，query序列为PX099A小种的基因组序列。 Megablast软件比对的各参数设置为：参数-e设置为le-5;参数-P设置为0 ;参数-V设置为 5000;参数-m设置为1。比对完成后，获得在目标微生物类群的所有微生物间的同源序列，从 中挑选仅在que巧序列中出现1次的同源序列。WlWbp为窗口大小，WlObp为步长，在挑选 的同源序列内作窗口平移。对于每一次平移获得的窗口，比较获得至少在目标微生物类群 内两种微生物间存在差异的碱基，截取该窗口中从第一个差异碱基起至最后一个差异碱基 止的区域作为特征区域，并统计该特征区域内的差异碱基的数量。向特征区域的两侧各延 伸长度为160bp-特征区域长度的区域作为引物捜索区，在引物捜索区内，捜索存在长度大 于20bp且在目标微生物类群内所有微生物间没有任何碱基差异的区域，作为特征区域的引 物设计区，放弃缺乏引物设计区的特征区域。
[0化6] 登录多重扩增引物在线设计网页ht1:ps://ampliseq.com,在"Application type" 选项选择"DNA Hotspot desi即S (single-pool)"。若在本实施例中选择multi-poo I，则多 重PC时尋分多管进行，成本会有所增加。而选择single-pool的引物只需要一次多重PCR即 可，节省成本，但缺点是某些特征区域的引物设计可能失败，但由于基因组上的特征区域的 数目较多，少数特征区域引物设计失败不影响结果，所W，本实施例选择single-pool。将W 上获得的所有目标微生物类群的特征区域及其对应的引物设计区用100个碱基N(N代表A、 T、C和G四种碱基中的任意一种)连接起来，生成为一个引物设计的参考基因组。在"Select the genome you wish to use"选项中选择乂ustom"后，上传生成的引物设计的参考基因 组。DNA Type选项选择"Standard DNA"，在Add