Hotspot选项中，填写特征区域在生成的引 物设计的参考基因组中的起始和终止位置。最后点击"Submit化巧ets"按钮提交并获得目 标微生物类群的特征区域的多重扩增引物序列。
[0化7] 利用设计的多重扩增引物对目标微生物类群利用BLASTN(Basic Local Ali即ment Search Tool,基本局部比对捜索工具Kversion 2.2.26)做比对分析，从中挑 选正反向引物中至少有一个具有特异性的引物。将挑选出来的引物再与非目标生物的基因 组做BLASTN比对分析，检查它们是否可W扩增非目标生物的基因组。本实施例中，非目标生 物为除目标微生物类群外的所有生物，非目标生物的基因组为NCBI(化tional center for biotechnology information，国家生物技术信息中屯、）的NT/NR库 (WWW.ncbi .nlm.nih.gov/)。判断引物可W扩增的标准为:扩增区长度不超过20化P，引物匹 配长度大于15bp且引物3'端的5个碱基W内没有碱基缺失或错配。若引物不能扩增任何非 目标生物，此时，引物所对应的目标微生物的特征区域的区分度ml = 3XLl/4,若引物可扩 增部分非目标生物，则将将该引物扩增的任一非目标生物的扩增产物与任一目标微生物类 群的特征区域进行比对，获得所有比对中，差异碱基数目的最小值为区分度ml,保留ml >3 的目标微生物类群的特征区域，进一步去掉含有简单重复序列或在基因组上为多拷贝的特 征区域。从保留的目标微生物类群的特征区域中，进一步优选目标微生物类群的特征区域 并选择目标微生物的特征区域。
[005引进一步地，目标微生物类群的特征区域的优选方法如下:将特征区域与非目标生 物的参考基因组做BLAST化k对，去掉与非目标生物存在95% W上同源性的特征区域，将剩 余的特征区域在目标微生物与目标微生物类群内其它微生物间利用软件muscle(版本： V3.6)按其默认参数进行比对，获得差异碱基数的最小值，即m2值。保留m2含2的目标微生物 类群的特征区域，从保留的特征区域中，任意挑选区分度ml与m2均较大的2个及2个W上的 特征区域同时作为目标微生物类群的特征区域和目标微生物的特征区域，其对应的多重扩 增引物同时作为第一多重扩增引物和第二多重扩增引物。
[0059] 按与寻找目标微生物类群的特征区域相类似的方法，获取参考微生物特征区域及 其对应的第=多重扩增引物，下面重点描述不同之处，相同之处不再重复描述。同样采用软 件Megablast(版本2.2.26)对参考微生物基因组与que巧序列（参考序列）进行比对分析， queiT序列为Agrobacterium 1:umefaciens K84的基因组序列。比对完成后，获得参考微生 物基因组中，仅在que巧序列中出现1次的单一序列。将单一序列与NCBI的NT/NR库比对，放 弃在非目标生物中存在同源序列的单一序列，从单一序列中随机挑选不重叠的IlObp长度 的作为特征区域，其两侧的序列作为引物设计区域。于多重扩增引物在线设计网页 https://ampliseq.com上设计特征区域的多重扩增引物，进一步筛选成功设计了多重扩增 引物的特征区域，具体方法如下：去掉含有简单重复序列或在基因组上为多拷贝的特征区 域，将剩下的特征区域与非目标生物的参考基因组做化ASTN比对，去掉与非目标生物存在 95% W上同源性的特征区域。从保留下来的特征区域中，随机挑选2个及2个W上特征区域 作为参考微生物类群的特征区域，其对应的多重扩增引物作为第=多重扩增引物。
[0060] 由生工生物工程(上海)股份有限公司逐一合成W上获得的第一多重扩增引物、第 二多重扩增引物和第=多重扩增引物中的每一重扩增引物、W及由每个多重扩增引物对应 的扩增的模板序列，模板序列是指每个多重扩增引物在填入Add化tspot选项的扩增区域。 按照美国赛默飞世尔公司的StepOne实时定量PCR仪的操作手册（Part Number 4376784Rev.E)检测每个多重扩增引物的扩增效率，仅保留扩增效率在95%~105%的多重 扩增引物，W减少扩增效率的差异对微生物定性与定量的影响。由于扩增效率影响较少，因 此，目标微生物类群与目标微生物的特征区域也可W不同，W方便更容易分别找到各自的 特征区域。将W上获得的第一多重扩增引物、第二多重扩增引物和第=多重扩增引物保留 下来的多重扩增引物按多重扩增引物在线设计网页ht化s://ampliseq.com上的合并程序 进行合并，获得混合多重扩增引物，混合多重扩增引物由美国赛默飞世尔公司合成后，W液 体形式提供。本实施例最终获得的特征区域相关信息见表1。表1中的起始位置与终止位置 是指特征区域在que巧序列上的参考基因组上的起始和终止位置。
[0061]表1本实施例提供的引物相关信息
[0064] 步骤四、向待测样品中加入参考微生物，获得混合样品，具体方法如下：
[0065] 参考微生物不存在于待测样品中，所W，可W将参考微生物作为内部参照，并与待 测样品中的微生物进行平行操作，对待测样品中的目标微生物类群与目标微生物进行定 量。参考微生物的加入量控制为大约可W提取IOng的混合样品的核酸(DNA)，W正常构建高 通量测序文库，同时，参考微生物的加入量又不至于使得参考微生物所占的比例过大，占用 过多的高通量测序数据量。本实施例的参考微生物为根癌农杆菌，混合样品的获取方法如 下:将浓度为20D(0D为菌液最大吸光度值)的参考微生物的菌液0.2mL置于1.5mL的离屯、管 中真空冷冻离屯、干燥后，加入IOOmg待测样品即水稻叶片中，加入液氮后研磨成粉状，即得 到待测样品与参考微生物的混合样品。通过血球板计数，计算获得加入混合样品的参考微 生物的量200万个。
[0066] 步骤五、提取混合样品的核酸，具体方法如下：
[0067] 在提取所述混合样品的核酸时，若待测样品中核酸的含量过低(低于lug),将影响 混合样品的核酸的提取，则可W在混合样品的核酸的提取过程中，加入混合多重扩增引物 不能扩增的外源核酸。所加入的外源核酸不存在与自然界中，因而不干扰微生物检测。外部 RNA对照协会设计了并验证了一套核酸序列，它们在自然界中不存在，可W作为本发明实施 例中的外源核酸，其序列可参考htt PS: //tools . Iifetechnologies . com/content/sfs/ manuals/cms_095047. txt。外源核酸的加入量为lug左右，该加入量可W保证混合样品的核 酸能够正常提取。在本实施例中，待测样品为水稻叶片，其核酸含量正常，因此，不需要向混 合样品中加入外源核酸。利用植物基因组DNA提取试剂盒(货号:DP305,生产公司：天根生化 科技(北京)有限公司）按其操作手册提供的方法提取获得的混合样品的核酸。
[0068] 步骤六、利用混合多重扩增引物和混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物， 具体方法如下：
[0069] 利用文库构建试剂盒2.0(由美国LifeTechnology公司生产，货号为4475345)多重 PCR扩增混合样品的核酸后，利用扩增产物构建高通量测序文库。该试剂盒包括W下试剂:5 XIon AmpliSeq?化Fi Mix、化化试剂、转换试剂、测序接头溶液和DNA连接酶。文库构建的 方法按该试剂盒的操作手册《Ion AmpliSeq? Library Preparation》（出版号： MAN0006735,版本:A.O)进行。多重PCR的扩增体系如下：5XI〇n AmpliSeq?化Fi Mix化1、 合成的混合多重扩增引物化1、提取的混合样品的核酸IOng和无酶水1化1。多重PCR的扩增 程序如下：99°C，2分钟；（99°C，15秒;60°C，4分钟）X 25个循环；10°C保溫。利用化化试剂消 化掉多重PCR扩增产物中多余的引物后，再进行憐酸化，具体方法为：向多重PCR的扩增产物 中加入化L化化试剂，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应:50°C，10分钟；55°C，10分钟；60 °C，10分钟；10°C保存，得到混合物a,混合物a为含有经过憐酸化的扩增产物溶液。将憐酸化 的扩增产物连接上测序接头，具体方法为：向混合物a中加入转换试剂化L、测序接头溶液化 L和DNA连接酶化L，混匀后，在PCR仪上按如下程序反应:22°C，30分钟；72°C，10分钟；10°C保 存，得到混合液b。利用标准的乙醇沉淀方法纯化混合液b后溶解于10化无酶水中。利用美国 Invi化igen公司生产的Qubit敏dsDNA HS Assay Kit(货号为Q32852)并按照其说明书进 行测定，获得混合液b的质量浓度后，将纯化后混合液b稀释至15ng/ml，得到浓度约IOOpM的 高通量测序文库。
[0070] 步骤屯、利用扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段，具体方法如下：
[0071] 利用获得的高通量测序文库和试剂盒Ion PI Template 0T2 200Kit v2(美国 invirtrigen公司生产，货号为4485146)进行测序前的ePCR化mulsion PCR，乳化聚合酶链 反应）扩增，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。利用ePCR产物和试剂盒Ion PI Sequencing 200Kit v2(美国invi:rtrigen公司生产，货号为4485149)在Rroton二代高通量 测序仪上进行高通量测序，操作方法按该试剂盒的操作手册进行。在本实施例中，高通量测 序量设置为IM测序片段(IM= 100万）。
[0072] 根据测序片段的引物，将高通量测序片段比对到对应的目标微生物类群的特征区 域、目标微生物的特征区域和参考微生物的特征区域。去掉比对不成功和特征区域不完整 的测序片段，比对不成功的测序片段多为非特异扩增产物，特征区域不完整的测序片段是 指没能将表1中的特征区域的起始位置到终止位置的序列检测完整。
[0073] 步骤八、根据高通量测序片段，对目标微生物类群和目标微生物进行定性和定量 分析，具体方法如下：
[0074] 本发明提供的微生物定性定量分析的基本原理是:特征区域代表了目标微生物类 群和目标微生物，若存在特征区域的测序片段，表明目标微生物类群或目标微生物存在，而 特征区域的测序片段的数量也代表了目标微生物类群和目标微生物的数量。与其它微生物 定性与定量检测不同，本发明实施例计算了微生物定性与定量的可靠性，同时