供的检测方法通用性较强。本发明改变了已有方法中一次只能检 测少数几种微生物、只能将微生物区分到种、定量不准、检测结果无概率保障、需要预培养、 检测周期长、某些微生物不可培养因而不可检测、微生物可培养性不同而导致的定量失真、 定量粗糖等诸多问题，为微生物检测提供了一种全面、快速、精细的定性与定量检测新方 法D
【主权项】
1. 一种水稻微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括： 确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待 测样品中的参考微生物，所述待测样品为水稻； 根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参 考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述 参考微生物的特征区域； 制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物 的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物， 将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合 多重扩增引物； 向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品； 提取所述混合样品的核酸； 利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物； 利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段； 根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量 分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的数目2 1个，且每个 所述目标微生物类群包括2 〇种所述目标微生物； 所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生 动物中的至少一种； 所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生 动物中的至少一种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述确定待测样品中的非目标生物的方法 包括:将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目 标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物； 若不能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所 述目标微生物类群之外的其它生物。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群的特征区域为所述目 标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列;所述目标微生物类群的特征区域的 两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列;所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序 列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守;所述目标微生物类群的特征区域的区分度 >3； 所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源;所述目标微生物 的特征区域的m2值2 2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群内 除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值； 所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列;所述参考 微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列;所述参考 微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增 引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最 小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物以所述混合样品的核酸为模板的扩 增产物，且所述非特征区域不为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则 所述区分度= 3XLl/4,其中，L1为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在提取所述混 合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群和所述目标微生物的 定性分析方法如下： 将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基 数<nl时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其 中，nl为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数;若比对成功的所述目标 微生物类群的特征区域2 1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特 征测序片段； 将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比 对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型;在 所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱 基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生 物的标准基因型的差异碱基数<n2,其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容 错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物 的特征测序片段； 将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得 的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段； 若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5 2 α5，则判断所述待测样品中存 在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障;若所述目标微生物类群的特征测序片段存在 的概率Ρ5〈α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群； 若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率Ρ6 2 α6，则判断所述待测样品中存在所 述目标微生物，其中，α6为概率保障;若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率Ρ6〈α6， 则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物； nl使得Pl^al且Ρ3<α3,其中，Ρ1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的 所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概 率;Ρ3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群的特 征测序片段而产生的假阴性的概率;α?和α3为判断阈值； η2使得Ρ2<α2且Ρ4<α4,其中，Ρ2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的所述 高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率;Ρ4为一 条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而产生 的假阴性的概率;α2和α4为判断阈值； P5 = 1-BIN0M.DIST(S1，S1，P1，FALSE)，P6=1-BIN0M.DIST(S3，S3，P2，FALSE)，S1 为所 有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量的中 位数;S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数量的 中位数，FALSE为参数值;BINOM. DIST函数返回一元二项式分布的概率。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标微生物类群和所述目标微生物的 定量分析方法如下： 所述目标微生物类群的量Ml =MrXSl/S2,所述目标微生物类群的量的置信区间为 [Ml 1，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量;S2为所有的所述参考 微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数量的中位数;Mil和M12分别为Ml 值的置信区间的下限与上限； 所述目标微生物的量M2 = Ml X S3/S1，所述目标微生物的量的置信区间为[M21，M22 ]， M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限； Mil =M1 X (1-S4/S1) ,M12 = M1 X (1+S5/S1) ,M21 =M2 X (1-S6/S3) ,M22=M2 X (1+S7/ S3);其中，S4为假阳性的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量且S4 = CRITBIN0M (1^少1，〇9)，其中，1^为计算51的所述目标微生物类群的特征区域的所述多重扩增引物所 扩增的所述非特征区域的所述高通量测序片段的数量;S5为假阴性的所述目标微生物类群 的特征测序片段的数量且S5 = CRITBIN 0M(S1，Ρ3，α9)，其中，α9为概率保障;S6为假阳性的 所述目标微生物的特征测序片段的数量且S6 = CRITBINOM(Sl，P2，al〇)，S7为假阴性的所述 目标微生物的特征测序片段的数量且37 = 〇?几8預(麗(53，？4，€[10)，其中，€[10为概率保障;〇 RITBINOM函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，PI =BINOM. DIST(nl，ml，1-E，TRUE)，P2 = BINOM.DIST(n2，m2，l-E，TRUE)，P3=1-BINOM.DIST(nl，L1，E，TRU E)，P4=卜BINOM.DIST (112丄2 3，11?1^)，其中，1111为所述区分度;所述1112为所述目标微生物的特征区域与所述目标 微生物类群的其它所述微生物间差异碱基的最小值;LI为所述目标微生物类群的特征区域 的长度;L2为所述目标微生物的标准基因型的长度;E为碱基错误率。
【专利摘要】本发明公开了一种水稻微生物定性与定量的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；设计目标微生物类群与目标微生物的特征区域；设计特征区域的多重扩增引物；在待测样品中加入参考微生物与外源核酸后，提取待测样品中的微生物的核酸；利用设计的多重引物扩增微生物核酸，扩增获得特征测序片段；利用特征测序片段定性、定量分析待测样品中微生物。本发明不需要对微生物进行预培养与增殖，可以一次性地对待测样品中的多种已知微生物进行高通量、高准确度、高分辨率的检测，检测过程简单、快速且流程规范。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/06, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105603082
【申请号】CN201610063949
【发明人】翟文学, 李甜甜, 彭海, 周俊飞, 陈利红, 李论, 胡长峰, 高利芬, 章伟雄, 张静, 卢龙, 陈斌, 李丽丽
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所, 江汉大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月29日