酶基因的重组表达载 体。其可通过本领域常规方法将本发明的氧化脱氢酶基因或其突变体的核酸序列连接于各 种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘 粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达 载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21a分别用Ndel和Xhol酶切，形成 互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的葡萄糖脱氢酶基因的重组表达 质粒PET21-GDH或其突变体表达质粒。
[0027] 本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。 可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规 的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的葡萄糖脱 氢酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E. coli)，更优选E. Coli BL21(DE3)。 将前述重组表达质粒PET21-GDH或其突变体转化至E.Coli BL21(DE3)中，即可获得本发明 优选的基因工程菌株，即E. Coli BL21 (DE3)/pET21-GDH或其突变体。转化方法可选择本 领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是： 42 °C，热击45秒。
[0028] 本发明的第五个方面是提供一种重组葡萄糖脱氢酶的制备方法，其包括如下的步 骤：培养本发明的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组葡萄糖脱氢酶。
[0029] 本发明中催化半缩醛进行氧化反应形成内酯的催化剂，可以是上述产生重组葡萄 糖脱氢酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者 用其加工的制品。这里"加工的制品"是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的葡 萄糖脱氢酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或 转化体的分离产品而得到的固定化制品。
[0030] 本发明的第六个方面提供了一种本发明的葡萄糖脱氢酶或重组葡萄糖脱氢酶在 催化半缩醛化合物进行氧化反应形成内酯中的应用。
[0031] 所述的半缩醛化合物较佳的为6-取代甲基-2, 4-二羟基-四氢吡喃衍生物，更 佳的是6-取代甲基-2, 4-二羟基-四氢吡喃，最佳的是（4R，6S)-6-取代甲基-2, 4-二羟 基-四氢吡喃，即式I所示的化合物：
[0032]
[0033] 其中，
[0034] X选自离去基团、叠氮基、具有1~6个碳原子的叠氮烷基、-CN、-〇H、或-〇)0札基 团；&选自具有1~6个碳原子的烷基或具有6~12个碳原子的芳基；
[0035] R为Η或羟基保护基，优选为H。
[0036] 优选地，R为Η、碳链长度为1~8个碳原子的烷基或苄基。
[0037] 优选地，尚去基团选自卤素、横酸醋基团、醜氧基；苯乙醜氧基、烷氧基、芳氧基、或 者R 2R3NCH2 ;其中R2、R3各自独立的选自Η、具有2~7个碳原子的烷氧羰基、具有8~14个 碳原子芳基烷氧基羰基、具有6~12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7~19个碳原子芳基 烷基、具有2~7个碳原子的烷基酰基或邻苯二甲酰亚氨基；
[0038] 更优选X为C1，R为H，即式I是6-氯代甲基-2, 4-二羟基-四氢吡喃，最优选为 (4R，6S)-6-氯代甲基-2, 4-二羟基-四氢吡喃。
[0039] 本发明所述的氧化脱氢反应的各条件可按照本领域此类反应的常规条件进行选 择，较佳地，所述的应用包括下述的步骤：合成半缩醛，同时或随后加入葡萄糖脱氢酶，使半 缩醛氧化成内酯。
[0040] 其中，所述的半缩醛化合物在反应液中的较佳的浓度为1~100g/L。本发明的 葡萄糖脱氢酶为催化有效量，较佳地为〇. 1~l〇g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲 液，只要其pH范围在5. 0~8. 0即可，如碳酸氢钠水溶液。碳酸氢钠水溶液的浓度较佳为 0. 05~0. lmol/L。任选地，所述反应液中还添加0~1. OmM的吡咯喹啉醌（PQQ)。所述的 氧化反应较佳地在振荡或搅拌条件下进行。所述的葡萄糖脱氢酶氧化反应的温度较佳为 10~40°C，更佳为25~37°C。所述的氧化反应的时间较佳的以反应过程中，产物浓度不再 持续提高的时间为准。葡萄糖脱氢酶氧化反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提 取内酯化合物。
[0041] 在一个具体的实施方案中，将收集的重组表达大肠杆菌菌体加入0. 05~0. 1M的 NaHC03缓冲液（pH 7. 2)中，所述的NaHC03缓冲液的量为1~3倍体积。反应后离心取上 清粗酶液。DERA酶加入浓度为0. 3~1M氯乙醛（或乙酰氧基乙醛、苄氧基羰基胺基丙醛） 和浓度为〇. 45~2. 5M乙醛，在10~30°C反应4~8h。反应结束后用乙酸乙酯萃取得到 半缩醛粗品，将该半缩醛粗品溶于10倍体积的NaHC0 3缓冲液（pH 7. 2)，加15~25%体积 的GDH发酵液；或在2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA)催化的反应体系中直接加入 15~25%体积的⑶Η发酵液，控制pH 6. 8~7. 0,在25~37°C反应得到相应的内酯。
[0042] 在另一个具体的实施方案中，将6-位被氯甲基、乙酰氧基或苄氧羰基氨基甲基取 代的四氢吡喃-2, 4-二羟基中加入5~15倍体积的NaHC03缓冲液（pH 7. 2)，再加入15~ 25%体积的GDH发酵液，反应得到相应的内酯。
[0043] 在第三种具体的实施方式中，在DERA-GDH发酵液中加入氯乙醛（或乙酰氧基乙 醛、苄氧基羰基胺基丙醛）和乙醛，控制pH 6. 8-7. 0,在25~37°C反应得到相应的内酯。
[0044] 本发明所用试剂和原料均可市售获得。
[0045] 本发明的积极进步效果在于：针对已报道的制备他汀类药物及其中间体的反应中 反应比较剧烈，后处理难以进行，或者对环境不友好，或者反应试剂价格昂贵，不适合工业 化大生产等缺点，提供一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化 合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方 法。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友 好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
【附图说明】
[0046] 图1是pWF-Ι的质粒图谱。
[0047] 图2是葡萄糖脱氢酶基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，Μ为DNA分子量标准。
[0048] 图3是葡萄糖脱氢酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。Μ为分子量标准，泳道1为 全菌蛋白裂解液。
[0049] 图4是醛缩酶和葡萄糖脱氢酶共表达质粒的表达图谱。Μ为分子量标准，泳道1为 全菌蛋白裂解液。
[0050] 图5是NADH氧化酶的表达图谱。
【具体实施方式】
[0051] 下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0052] 实施例1克隆葡萄糖脱氢酶（⑶Η)
[0053] 从华东理工大学米集土 壤样品 DNA (Chroma Spin ΤΕ-1000，Clontech Laboratories, Inc. , USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集1~4kb的片段，回收并连接到 pWF-l(质粒图谱见图1)的BamHI位点，得到质粒文库；将文库转化到E. coliJM109,涂布到 含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500 μ L LB (含100 μ g/mL氨 苄青霉素）的96深孔孔板，37°C培养4小时后加 ImM IPTG诱导，30°C继续培养过夜，然后 各取100 μ L深孔培养物到新的96孔板，离心收菌，用50mM Tris-HCl (pH 7. 0)重悬细菌， 加入