40，rs4530059，rs338882，rs10488710，rs6811238，rs722290，rs7041158， rs7520386，rs9866013，rs1498553，rs2270529，rsl478829，rsl523537，rs4364205， rs985492,rs12997453,rs740598,rs1736442,rsl294331,rs993934,rs10776839, rs315791，rs576261，rs2399332，rs2272998，rs7205345，rs2269355，rs1058083， rsl0773760，rs464663，rs221956，rsl336071，rs 1027895 和位于人类牙釉质蛋白基因 Amelogenin gene上的一个性别检测SNP位点，所述性别检测SNP位点在女性个体中为纯合 子T / T，在男性个体中为杂合子C / T，性别检测S N P位点的5 '侧翼序列为 TTTTACCTTCTTCTTTCT，3 ' 侧翼序列为 TTGTAGAACTCACATTCTCAGGC。2.根据权利要求1所述的55个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于所述55 个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列为： rsll09037，PCR引物SEQ ID NO. 1-2,延伸引物SEQ ID NO. 111; rs3780962，PCR引物SEQ ID NO. 3-4,延伸引物SEQ ID NO. 112; rs6591147，PCR引物SEQ ID NO. 5-6,延伸引物SEQ ID NO. 113; rs2342747,PCR引物SEQ ID NO. 7-8,延伸引物SEQ ID NO. 114; rs9951171，PCR引物SEQ ID NO. 9-10,延伸引物SEQ ID NO. 115; rsl3182883，PCR引物SEQ ID NO. 11-12,延伸引物SEQ ID NO. 116; rs100 92491，PCR引物SEQ ID NO. 13-14,延伸引物SEQ ID NO. 117; rs6955448,PCR引物SEQ ID NO. 15-16,延伸引物SEQ ID NO. 118; rs6444724,PCR引物SEQ ID NO. 17-18,延伸引物SEQ ID NO. 119; rs430046,PCR引物SEQ ID NO. 19-20,延伸引物SEQ ID NO. 120; rs321198，PCR引物SEQ ID NO. 21-22,延伸引物SEQ ID NO. 121; rsl59606，PCR引物SEQ ID NO. 23-24,延伸引物SEQ ID NO. 122; rs560681，PCR引物SEQ ID NO. 25-26,延伸引物SEQ ID NO. 123; rs214955，PCR引物SEQ ID NO. 27-28,延伸引物SEQ ID NO. 124; rsl3218440，PCR引物SEQ ID NO. 29-30,延伸引物SEQ ID NO. 125; rs9905977，PCR引物SEQ ID NO. 31-32,延伸引物SEQ ID NO. 126; rsl821380，PCR引物SEQ ID NO. 33-34,延伸引物SEQ ID NO. 127; rs279844,PCR引物SEQ ID NO. 35-36,延伸引物SEQ ID NO. 128; rs8078417,PCR引物SEQ ID NO. 37-38,延伸引物SEQ ID NO. 129; rs4606077,PCR引物SEQ ID NO. 39-40,延伸引物SEQ ID NO. 130; rs445251，PCR引物SEQ ID NO. 41-42,延伸引物SEQ ID NO. 131; rs987640，PCR引物SEQ ID NO. 43-44,延伸引物SEQ ID NO. 132; rs4530059，PCR引物SEQ ID NO. 45-46,延伸引物SEQ ID NO. 133; rs338882，PCR引物SEQ ID NO. 47-48,延伸引物SEQ ID NO. 134; rsl0488710，PCR引物SEQ ID NO. 49-50,延伸引物SEQ ID NO. 135; rs6811238，PCR引物SEQ ID NO. 51-52,延伸引物SEQ ID NO. 136; rs722290，PCR引物SEQ ID NO. 53-54,延伸引物SEQ ID NO. 137; rs7041158,PCR引物SEQ ID NO. 55-56,延伸引物SEQ ID NO. 138; rs7520386，PCR引物SEQ ID NO. 57-58,延伸引物SEQ ID NO. 139; rs9866013，PCR引物SEQ ID NO. 59-60,延伸引物SEQ ID NO. 140; rsl498553，PCR引物SEQ ID NO. 61-62,延伸引物SEQ ID NO. 141; rs2270529,PCR引物SEQ ID NO. 63-64,延伸引物SEQ ID NO. 142; rsl478829，PCR引物SEQ ID NO. 65-66,延伸引物SEQ ID NO. 143; rsl523537，PCR引物SEQ ID NO. 67-68,延伸引物SEQ ID NO. 144; rs4364205,PCR引物SEQ ID NO. 69-70,延伸引物SEQ ID NO. 145; rs985492，PCR引物SEQ ID NO. 71-72,延伸引物SEQ ID NO. 146; rsl2997453，PCR引物SEQ ID NO. 73-74,延伸引物SEQ ID NO. 147; rs740598,PCR引物SEQ ID NO. 75-76,延伸引物SEQ ID NO. 148; rsl736442，PCR引物SEQ ID NO. 77-78,延伸引物SEQ ID NO. 149; rsl294331，PCR引物SEQ ID NO. 79-80,延伸引物SEQ ID NO. 150; rs993934，PCR引物SEQ ID NO. 81-82,延伸引物SEQ ID NO. 151; rsl0776839，PCR引物SEQ ID NO. 83-84,延伸引物SEQ ID NO. 152; rs315791，PCR引物SEQ ID NO. 85-86,延伸引物SEQ ID NO. 153; rs576261，PCR引物SEQ ID NO. 87-88,延伸引物SEQ ID NO. 154; rs2399332,PCR引物SEQ ID NO. 89-90,延伸引物SEQ ID NO. 155; rs2272998，PCR引物SEQ ID NO. 91-92,延伸引物SEQ ID NO. 156; rs7205345,PCR引物SEQ ID NO. 93-94,延伸引物SEQ ID NO. 157; rs2269355,PCR引物SEQ ID NO. 95-96,延伸引物SEQ ID NO. 158; rsl058083，PCR引物SEQ ID NO. 97-98,延伸引物SEQ ID NO. 159; rsl0773760，PCR引物SEQ ID NO. 99-100,延伸引物SEQ ID NO. 160; rs464663，PCR引物SEQ ID NO. 101-102,延伸引物SEQ ID NO. 161; rs221956，PCR引物SEQ ID NO. 103-104,延伸引物SEQ ID NO. 162; rsl336071，PCR引物SEQ ID NO. 105-106,延伸引物SEQ ID NO. 163; rsl027895，PCR引物SEQ ID NO. 107-108,延伸引物SEQ ID NO. 164; 位于人类牙釉质蛋白基因 Amelogenin gene上的一个性别检测SNP位点，PCR引物SEQ ID NO. 109-110,延伸引物SEQ ID NO. 165。3. 根据权利要求1所述的55个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于同时复 合扩增包含55个SNPs位点的DNA片段。4. 利用如权利要求1所述的55个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒进行个体识别的 测试方法，其特征在于按照下列步骤进行： a) 提取DNA，得DNA提取液； b) 在扩增体系中加入步骤a)所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件 为:95°C、5min预变性;然后依次在95°C、30s，60°(：、3〇8,65°(：、3〇8，进行35个循环 ;再在65 °C保持7min;最终在4°C保存，获得扩增产物； c) 应用核酸外切酶I和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件：37 °C、lh，然后80 °C、15min，最终在4°C保存，得纯化后的扩增产物； d) 对纯化后的扩增产物进行延伸反应 将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应;所述的延伸反应的 条件:依次在96 °C、10s，58 °C、5s，60 °C、30s进行50个循环，最终保存在4°C，得延伸产物； e) 应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物 将虾碱性磷酸酶加入延伸产物中，在下列条件下进行纯化反应:37°C、lh，80°C、15min， 最终保存在4°C，得纯化后的延伸广物； f) 检测、确定产物， 将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混匀;然后95°C变 性3min，4°C迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定55个SNP基 因位点的基因型。
【专利摘要】本发明公开了一种55个SNP位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒，涉及包括核酸的测定或检验方法技术领域。试剂盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR缓冲液，核酸外切酶Ⅰ，虾碱性磷酸酶，延伸引物，SNaPshot反应混合液，Hi-Di甲酰胺和GeneScanTM Size Standards-120 LIZ；PCR引物和延伸引物由55个SNP基因位点的引物组成，分别针对包含55个SNP位点的DNA片段。采用本发明可以快速、准确地获得55个SNP位点的基因分型，并通过荧光自动分型设备检测分析，对人类生物检材进行个体识别，具有很大优势和潜力，具有很高的系统效能。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105695575
【申请号】CN201610109822
【发明人】丛斌, 李淑瑾, 王茜
【申请人】河北医科大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月26日