离子脂质体载体。
[0020]优选地，步骤一中所述肿瘤相关抗原WTl选自HLA-A0201限制性肿瘤相关抗原WTl表位肽9肽，或人工合成的、改造的或突变的WTl抗原肽。具体地，WTl蛋白序列从N端到C端(449AA)为:MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL[0021 ] 其中，表位肽9肽序列为:RMFPNAPYL
[0022]优选地，所述C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。
[0023]进一步地，上述步骤二中具体包括以下步骤:
[0024]步骤I，将外周血单个核细胞悬于基础培养基并加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养板，在37°C，5 % CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；
[0025]步骤2，向DC细胞中加入适量的所述步骤一得到负载有肿瘤相关抗原WTl的阳离子脂质体载体，共孵育培养6小时;然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤相关抗原WTl的成熟DC细胞。
[0026]进一步地，上述步骤三中具体包括以下步骤:
[0027]步骤I，将所述步骤二中获得的成熟DC细胞诱导T细胞，诱导后的T细胞与工程细胞混合培养，添加细胞因子培养；
[0028]步骤2，根据细胞密度隔天补加含有细胞因子的培养基，使细胞维持一定范围的密度生长，直到2-3周，收获细胞，得到WTl特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
[0029]优选地，上述阳离子脂质体包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖。更优选地，所述磷脂酰乙醇胺双分子层由磷脂酰乙醇胺阳离子脂和聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺分子组成。
[0030]优选地，上述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺与所述甘露糖形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。更优选地，上述阳离子脂质体在磷脂分子的极性基团上连接所述甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。
[0031]优选地，所述细胞因子选自人重组细胞因子IL-2、IL-12和IL-18细胞因子。
[0032]优选地，所述工程细胞为人工细胞转染了人4-1BBL和IL-21的K562细胞株。
[0033]本发明另一方面还提供根据上述制备方法所制备得到的特异性CTL;以及制备得到的特异性CTL在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0034]本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:
[0035]本发明采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤相关抗原制备抗原特异性T淋巴细胞。与常规抗原特异性T淋巴细胞制备技术相比，本发明制备肿瘤相关抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤相关抗原，以肿瘤相关为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤相关的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性;而且采用72小时快速成熟树突状细胞，比常规的7-8天收获成熟的DC能大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明肿瘤相关抗原WTl特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤相关，抗原性强且稳定性良好，便于操作，适合在临床肿瘤过续性免疫治疗上进行应用推广。
【附图说明】
[0036]图1为实施例二中72小时快速成熟树突状细胞成熟表型鉴定结果。
[0037]图2为实施例三中肿瘤相关抗原WTlCTL细胞毒性因子IFN-r检测结果。
[0038]图3为实施例四中扩增的肿瘤相关抗原WTl特异性CTL的Tcm表型检测结果。
【具体实施方式】
[0039]本发明提供了一种抗肿瘤相关抗原WTl特异性CTL的制备方法，包括以下步骤:
[0040]步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WTl的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体；
[0041]步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WTl负载于成熟DC细胞；
[0042]步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WTl特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。
[0043]本发明采用C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体作为抗原载体，包裹肿瘤相关抗原，用于抗原特异性T淋巴细胞的制备。所述阳离子脂质体，包括磷脂酰乙醇胺双分子层、聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺以及甘露糖;所述的C-型凝集素类型的糖为甘露糖或甘露糖苷。所述磷脂双分子球由磷脂酰乙醇胺阳离子脂和所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺分子组成;所述甘露糖在所述聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺一端形成甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。这种阳离子脂质体通过在磷脂分子的极性基团上连接甘露糖修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。所述肿瘤抗原是HLA-A0201限制性肿瘤相关抗原WTl表位肽9肽，包涵表位肽15肽及包涵表位肽30肽。所述的工程细胞跨膜表达人4-1BBL和IL-21的K562细胞株的人工细胞。
[0044]下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0045]实施例一抗肿瘤相关抗原WTl特异性CTL的制备方法
[0046]本发明的制备方法主要包括三大块步骤，本实施例为本发明通用的制备方法。
[0047]第一，C-型凝集素类型的糖修饰的阳离子脂质体抗原载体制作，具体操作如下:
[0048]首先制备甘露糖或甘露糖苷修饰的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。将甘露糖或甘露糖苷通过醛基-氨基或羟基-氨基缩合的方式连接于聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂的氨基上，从而得到甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂。而后将阳离子脂DOTAP和甘露糖或甘露糖苷的聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺磷脂分别溶于氯仿-甲醇(2:1)，并按照并按一定比例混合，将二者混合后得到混合液后置于圆底烧瓶中。用稳定的旋转蒸发仪将所述混合液旋转蒸干，使之形成一层均勾的薄膜，用真空干燥12小时去除残余的氯仿和甲醇后，添加含有肿瘤相关抗原WTl的PBS缓冲液或纯水放置4°C水浴超声水化3-5分钟，挤压薄膜后放置于4°C水化12小时。后经水浴超声1-3分钟，用注射器过滤聚碳酸酯膜一次，得到所述靶向树突状细胞(DC)上C-型凝集素受体的肿瘤相关抗原WTl阳离子脂质体载体，保存于4°C。
[0049]第二，72小时快速负载肿瘤相关抗原的树突状细胞的制备，具体操作如下:
[0050]将人外周血单个核细胞以3.0-5.0*106个/ml悬于基础培养基，加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养板，在37 °C，5 % CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导。
[0051 ]第二天，向DC细胞中加入适量的肿瘤相关抗原WTl，共孵育培养6小时。然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿瘤相关抗原WTl的成熟DC细胞。
[0052]第三，快速扩增抗原特异性T淋巴细胞和Tcm的制备方法，具体操作如下:
[0053]将肿瘤相关抗原WTl呈递的成熟DC诱导后的T细胞与工程细胞按照1:2-1:4的比例混合培养，添加 lug/ml ant1-human CD3 抗体，lug/ml ant1-human CD28 抗体，300IU/ml 的人重组细胞因子IL-2和lOng/ml human IL-12细胞因子，共孵育在37°C，5%⑶2，饱和湿度下培养。
[0054]根据细胞密度隔天补加含有300IU/ml的人重组细胞因子IL-2和10ng/ml humanIL-18细胞因子的培养基使细胞数目维持在1.3-2*106个/ml的密度范围，持续补充新鲜的培养基，直到两三周，收获细胞。
[0055]实施例二DC的成熟表型鉴定
[0056]本实施例中，从外周血中采集和分离单个核细胞，以3.0-5.0*106个/ml的密度悬于A頂-V无血清培养液，再向培养液中加