牛妊娠相关糖蛋白pag特异性单克隆抗体细胞株及其应用
【专利摘要】一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株，其特征在于：所述菌株的登记入册保藏编号为CGMCC No. 12034，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年1月27日。菌株PAG109在检测牛怀孕妊娠的应用，可以用来快速检测牛怀孕妊娠。CGMCC No.1203420160127
【专利说明】
牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及到一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体 细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] 早期妊娠诊断是提高奶牛繁殖率和产奶量的重要措施。一般人工受精或配种后， 需要及时进行早期妊娠诊断，避免母牛早期妊娠缺失造成的生产损失。传统的牛早孕诊断 检测主要依靠初诊和超声波仪器来进行，在准确性和时效性上有一定缺陷，并且两种诊断 均对操作人员或者牧场兽医有较高要求，一般饲养人员难以掌握。养殖实践中通过加强妊 娠母畜的管理、保证顺利分娩，同时对未妊娠母畜及时补配或进行必要处理可缩短产仔间 隔并明显提高繁殖效率。因此开发无创且快速简便的妊娠诊断技术已成为必然趋势。
[0003] 奶牛妊娠后，胎盘滋养层双核细胞在于母体子宫上皮细胞融合时，会释放出多种 信号蛋白，其中常见的并且被广泛研究的有妊娠相关糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins, PAG)，牛早孕因子（early pregnancy factor, EPF)、妊娠特异性蛋白B (pregnancy specific protein B, PSPB)等，其中PAG是研究和应用最为广泛的蛋白。根据 Zo 1 i等（1991)的报道，根据分子量大小，PAG可分为PAG 1、PAG2、PAG3、PAG4等，而根据其建立 的放射免疫测定方法，对配种后35天的奶牛妊娠确诊率达到93.03%，空怀率确认为97.90%， 表明PAG完全可以作为牛妊娠诊断检测的标志物。随着技术的发展，以PAG为检测目标的检 测方法越来越多，如美国IDEXX Laboratories公司生产的牛怀孕检测试剂盒，可用于检测 牛血清或EDTA血浆中的怀孕早期相关蛋白的酶联免疫吸附试验(ELISA)，其整体采用双抗 体夹心法，操作繁琐，耗时超过2小时，在牧场现场检测时有极大缺陷，不便于使用；而美国 Biotracking LLC公司生产的BioPRYN同样是以ELISA为原理，操作与IDEXX产品类似。
[0004] 由于任何免疫学检测方法的关键都是特异性抗体。为了解决现有方法的缺陷，满 足基层检测需求，有必要制备高灵敏度、稳定性好的抗体，尤其是来源广泛且成本低廉的单 克隆抗体。
【发明内容】
[0005] 本申请的目的在于提供一种高灵敏度、稳定性好的抗体，尤其是来源广泛且成本 低廉的牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株。
[0006] 本发明还要解决技术问题为提供上述牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细 胞株的应用。
[0007] 本发明通过如下技术方案实现： 一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心登记入册的编号为CGMCC No. 12034。
[0008] -种PAG特异性单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体是由权利要求1所述的 杂交瘤细胞株CGMCC No. 12034分泌产生的。
[0009] 进一步，制备该单克隆抗体所用的基因片段如SEQ ID No.1所示，免疫蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 进一步，所述的PAG特异性单克隆抗体在检测或分离PAG蛋白中的应用。
[0011] 进一步，所述的牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株或权利要求2所述 的PAG特异性单克隆抗体在制备检测PAG蛋白试纸条中的应用。
[0012] 本发明的另外一个目的在于提供一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细 胞株的制备方法，其特征在于： 步骤一:重组质粒构建 根据GenBank公开的PAG基因序列设计引物，其上游引物PAG-F为SEQ ID No. 3所列的序 列，其下游引物PAG-R为SEQ ID No. 4所列的序列，所述PAG基因序列的编号为M73962.1，并 弓丨入BamH I和Hind III酶切位点;PAG基因片段以pUC-bPAG质粒为模板，用PCR方法扩增； 纯化的PCR产物与表达载体pFastBac HT-B双酶切后，用T4 DNA连接酶4°C连接过夜，连接产 物转化感受态细胞，制备阳性重组质粒，并转座DHlOBac感受态细胞，筛选阳性克隆后，提取 Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒，鉴定后纯化备用； 步骤二:蛋白纯化鉴定 将重组杆状病毒以Μ0Ι 0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清；目 的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行，纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试 剂盒测定蛋白含量后分装，_80°C保存备用； 步骤三:抗体制备 1. 小鼠免疫 将纯化的PAG蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，按照100yg每只的剂量皮下多点 免疫6周龄Balb/C小鼠，2周后将PAG蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合，按照100yg的剂量 以同样方式持续免疫，后续免疫照此进行;第三次免疫8-10天后开始采血测定;待血清效价 较高后，以150yg的纯化PAG蛋白腹腔加强免疫； 2. 细胞融合与筛选 将腹腔加强免疫后的小鼠处死，采集脾细胞与SP2/0细胞以常规方式进行细胞融合，并 以特殊处理的无血清培养基进行培养；以纯化的PAG蛋白包板，所述PAG蛋白包板为2yg/孔， 以间接ELISA测定效价;阳性孔以有限稀释法持续筛选直到获得单克隆为止;将获得的单克 隆细胞株持续培养后，腹腔免疫经过液体石蜡油处理的小鼠，体内法制备腹水； 3. 抗体纯化 将制备的腹水无菌采集后经离心、饱和硫酸铵沉淀纯化后过蛋白G亲和柱亲和纯化，透 析脱盐浓缩后备用。
[0013] 本发明的另外一个目的在于提供一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细 胞株的制备方法，其特征在于： 采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶与PAG蛋白单克隆抗体偶联制备亲和纯化柱，纯化胎盘 血清羊水中的PAG蛋白，具体操作如下： (1)将纯化的抗体置于含0.5M NaCl的0.1M NaHC03中透析平衡后，测定蛋白浓度。
[0014] (2)称取lg溴化氰活化的琼脂糖凝胶，用20ml ImM HC1重悬浸泡15min，完毕转入 G3漏斗，再用200ml ImM盐酸淋洗3次，然后用15mL偶联缓冲液淋洗，完毕滤干； (3) 将其继续转入准备好的抗体溶液中，保证每ml凝胶抗体浓度为5-10mg;完毕整体转 入带盖试管中，4度振荡过夜； (4) 完毕冷冻离心2000rpm，5min，测定上清中抗体浓度，确定偶联效率； (5) 沉淀加入15ml乙醇胺封闭液封闭，室温下振荡2.5h，完毕2000rmp离心5min后弃去 上清;沉淀继续用l〇ml偶联液和10ml醋酸缓冲液冲洗3-4次;将沉淀用10ml pH7.0 PBS重 悬，300rpm离心3min，备用； (6) 将偶联好的凝胶装入经过润洗的空柱，继续加入PBS重悬，静置lOmin，随后封闭，持 续以10ml pH7.0PBS、10ml双蒸水、10ml pH7.0 PBS润洗，静置lOmin后加入含有0.03%叠氮 纳pH7.4 PBS封存； (7处46纯化:取采集的血清或羊水样本离心后经0.45以111滤膜过滤，加入纯化柱中，流速 约10ml/h，带样品全部进入后，封住下端，静置2h，随后用0.01Μ PBS洗脱未结合的蛋白，直 至洗脱液〇D280〈0.05; (8)加入0.1M pH 2.2甘氨酸-HC1缓冲液洗脱，流速lml/min，收集洗脱液，并以NaHC03 中和，；柱子继续用0.01M pH7.4 PBS持续洗涤，平衡后加入含有0.03%叠氮纳pH7.4 PBS长 期封存;洗脱液通过SDS-PAGE电泳检测纯度，并透析、浓缩冻干保存。
[0015] 本发明的目的还在于提供了牛妊娠相关糖蛋白（PAG)特异性单克隆抗体细胞株的 应用。即通过该细胞株体内或者体外培养的方式生产牛妊娠相关糖蛋白（PAG)特异性单克 隆抗体。利用生产的抗体可以进一步用于纯化各类生物样本中的牛妊娠相关糖蛋白（PAG)， 以及定性、定量检测该蛋白含量。
[0016] 此外，本发明还提供了一种利用牛妊娠相关糖蛋白（PAG)特异性单克隆抗体建立 的牛怀孕妊娠试纸条的制备，其具体如下： 步骤一:胶体金标记PAG单克隆抗体的制备： 采用梓檬酸还原法制备得到20-40nm范围的纳米金颗粒溶液，调节pH值至9.0备用；取 一定量的纳米金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的PAG单克隆抗体以PBS按照 1:2000的比例稀释后加入纳米金溶液中搅拌反应60分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反 应液中，使PEG的最终浓度约为1%，置于冷冻离心机，在4°C的条件下，上慢速，所述慢速为 11000~13000rpm，离心10分钟后弃去上清液;将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多 余上清液;最后将沉淀物以PBS缓冲液重新悬浮，使最终的单克隆抗体蛋白浓度约为50yg/ ml左右，保存于4 C备用； 步骤二:胶体金试纸条的组装 将纯化的PAG单抗用pH为7.2的roS稀释至2mg/ml，以lul/cm2的量包被于纤维素膜上作 为检测线，即为T线;将羊抗鼠二抗用PBS，其pH为7.2，稀释至200yg/mL，然后以lyg/cm2的量 包被于纤维素膜上，作为质控线，即为C线，将金标PAG单抗稀释至lmg/mL，以20yL的量喷涂 在玻璃纤维上作为金标垫，将包被好的纤维素膜、、金标垫、样品垫、吸水垫粘贴在背板上， 经切条机切条后即可用于检测。
[0017] 本发明的有益效果为：牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株为高灵敏 度、稳定性好的抗体，尤其是来源广泛且成本低廉的单克隆抗体，非常适合于基层检测使 用，牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株的制备方法可以定性、定量检测牛妊娠 相关糖蛋白PAG的含量。
[0018] 保藏说明 参据的生物材料(株）:PAG109 科学描述： 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏机构简称:CGMCC 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 保藏日期:2016年1月27日 分类命名：杂交瘤细胞株 保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 12034。
【附图说明】
[0019] 图1:重组PAG蛋白表达鉴定图 图2:重组PAG蛋白纯化鉴定图 背板1;金标垫2;样品垫3;硝酸纤维膜4;吸水垫5;质控线6;检测线7。
【具体实施方式】
[0020] 以下为结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，并不对 本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本发明的保护范围之内，本发 明实施例所用试剂，如未特殊说明，均购自生化试剂供应商，所用实验技术，如未特别说明， 均为常规技术。
[0021] 本发明的技术原理如下： (1)通过重组表达的方式获得重组PAG蛋白并纯化:通过对GenBank公布的PAG序列进行 筛选，以如SEQ ID No.l的序列为基础，构建了PAG重组表达质粒(命名为PAG-001)，重组质 粒转座DHlOBac细胞获得的Bacmid转染SF9细胞在昆虫杆状病毒系统中表达，通过亲和层析 方式纯化得到了纯化的重组牛PAG蛋白。
[0022] (2)利用重组PAG蛋白制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株：以纯化的PAG 蛋白为免疫抗原，以常规方法免疫Balb/C小鼠，多次免疫后测定血清效价，并加强免疫。随 后取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，经过筛选得到了能分泌PAG特异性单克隆抗体的 杂交瘤细胞株，命名为PAG106，抗体亚型鉴定为IgGl，分别以Wes tern和ELISA鉴定抗体的 特异性和灵敏度。
[0023] (3)利用制备的单克隆抗体纯化牛胎盘血液中的PAG蛋白：将PAG106细胞株培养后 腹腔免疫小鼠，制备腹水，经亲和纯化后，与琼脂糖凝胶偶联，制备抗体亲和纯化柱，以此纯 化采集的孕牛胎盘血清、羊水等，获得纯化的PAG蛋白。
[0024] (4)利用制备的单克隆抗体检测孕牛血清中的PAG蛋白：以双抗体夹心胶体金层析 免疫为基础，将PAG单抗用胶体金标记后，建立奶牛血清中PAG含量的快速检测方法，为奶牛 早孕的临床诊断提供方法和手段。
[0025] 实施例1:牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体的制备 一、重组质粒构建 根据GenBank公开的PAG基因序列设计引物，其上游引物PAG-F为SEQ ID No. 3所列的序 列，其下游引物PAG-R为SEQ ID No. 4所列的序列，所述PAG基因序列的编号为M73962.1，并 弓丨入BamH I和Hind III酶切位点。PAG基因片段以pUC-bPAG质粒为模板，用PCR方法扩增。 纯化的PCR产物与表达载体pFastBac HT-B双酶切后，用T4 DNA连接酶4°C连接过夜，连接产 物转化感受态细胞，制备阳性重组质粒，并转座DHlOBac感受态细胞，筛选阳性克隆后，提取 Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒，鉴定后纯化备用。 [0026]二、蛋白纯化鉴定 将重组杆状病毒以Μ0Ι 0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目 的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行，纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试 剂盒测定蛋白含量后分装，_80°C保存备用。
[0027] 三、抗体制备 1. 小鼠免疫 将纯化的PAG蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，按照lOOyg每只的剂量皮下多点 免疫6周龄Balb/C小鼠，2周后将PAG蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合如何，按照100yg的 剂量以同样方式持续免疫，后续免疫照此进行。第三次免疫8-10天后开始采血测定。待血清 效价较高后，以150yg的纯化PAG蛋白腹腔加强免疫 2. 细胞融合与筛选 将腹腔加强免疫后的小鼠处死，采集脾细胞与SP2/0细胞以常规方式进行细胞融合，并 以特殊处理的无血清培养基进行培养。以纯化的PAG蛋白包板(2yg/孔），以间接ELISA测定 效价。阳性孔以有限稀释法持续筛选直到获得单克隆为止。将获得的单克隆细胞株持续培 养后，腹腔免疫经过液体石蜡油处理的小鼠，体内法制备腹水。
[0028] 3.抗体纯化 将制备的腹水无菌采集后经离心、饱和硫酸铵沉淀纯化后过蛋白G亲和柱亲和纯化，透 析脱盐浓缩后备用。
[0029]四、抗体鉴定 1. Western Blot鉴定 以孕牛血清、无关蛋白和阴性血清等做为对照，将纯化PAG蛋白按照常规Western Blot 方法鉴定。表明抗体能识别孕牛血清中的PAG、纯化的PAG，而与其它对照蛋白无反应。
[0030] 2. ELISA鉴定 (1)特异性:分别以纯化的PAG蛋白、牛血清白蛋白BSA、牛免疫球蛋白IgG等包板，加入 3000倍稀释的纯化PAG单克隆抗体，测定抗体对这些蛋白的交叉反应。结果表明抗体仅与 PAG反应，而与其它杂蛋白无反应(〈1%)。
[0031] (2)灵敏度:用PAG单抗包板，加入梯度稀释的PAG蛋白，洗板后，在加入辣根过氧化 物酶标记的PAG单抗，再次洗板，继续加入TMB底物，以1M硫酸中止反应后用酶标仪读取 450nm处吸光度值，根据PAG蛋白的最低浓度作为抗体灵敏度，结果表明，抗体对PAG蛋白灵 敏度至少为0. lng/ml(如下表）。
[0032]表1单克隆抗体灵敏度测定结果
3.亚型鉴定 采用商品化的小鼠单抗亚型检测试剂鉴定试剂盒鉴定抗体亚型，结果表明为IgGl亚 型，结果见下表。
[0033] 表2 PAG106单抗亚型鉴定结果 4.细胞株保藏
将经过鉴定的分泌优选抗体的杂交瘤细胞株PAG106冻存于液氮罐，并于2016年'月17 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 12034， 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0034]实施例2:牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体分离纯化PAG蛋白 采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶与PAG蛋白单克隆抗体偶联制备亲和纯化柱，纯化胎盘 血清羊水中的PAG蛋白，具体操作按照试剂说明并略有调整，如下： (1)将纯化的抗体置于含0.5M NaCl的0.1M NaHC03中透析平衡后，测定蛋白浓度。 [0035] (2)称取lg溴化氰活化的琼脂糖凝胶，用20ml ImM HC1重悬浸泡15min，完毕转入 G3漏斗，再用200ml ImM盐酸淋洗3次，然后用15mL偶联缓冲液淋洗，完毕滤干。
[0036] (3)将其继续转入准备好的抗体溶液中，保证每ml凝胶抗体浓度为5-10mg。完毕整 体转入带盖试管中，4度振荡过夜。
[0037] (4)完毕冷冻离心2000rpm，5min，测定上清中抗体浓度，确定偶联效率。
[0038] (5)沉淀加入15ml乙醇胺封闭液封闭，室温下振荡2.5h，完毕2000rmp离心5min后 弃去上清。沉淀继续用l〇ml偶联液和10ml醋酸缓冲液冲洗3-4次。将沉淀用10ml pH7.0 PBS 重悬，300rpm离心3min，备用。
[0039] (6)将偶联好的凝胶装入经过润洗的空柱，继续加入PBS重悬，静置lOmin，随后封 闭，持续以l〇ml pH7.0PBS、10ml双蒸水、10ml pH7.0 PBS润洗，静置lOmin后加入含有0.03% 叠氮纳PH7.4 PBS封存。
[0040] (7 )PAG纯化:取采集的血清或羊水样本离心后经0.45μπι滤膜过滤，加入纯化柱中， 流速约10ml/h，带样品全部进入后，封住下端，静置2h，随后用0.01Μ PBS洗脱未结合的蛋 白，直至洗脱液0D280〈0.05。
[00411 (8)加入0.1M pH 2.2甘氨酸-!1(：1缓冲液洗脱，流速11111/1^11，收集洗脱液，并以 NaHC03中和，。柱子继续用0.01M pH7.4 PBS持续洗涤，平衡后加入含有0.03%叠氮纳pH7.4 PBS长期封存。洗脱液通过SDS-PAGE电泳检测纯度，并透析、浓缩冻干保存。
[0042]实施例3:利用牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体检测孕牛血清中的PAG试 纸条的制备 一、胶体金标记PAG单克隆抗体的制备： 采用梓檬酸还原法制备得到20-40nm范围的纳米金颗粒溶液，调节pH值至9.0备用。取 一定量的纳米金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的PAG单克隆抗体以PBS按照 1:2000的比例稀释后加入纳米金溶液中搅拌反应60分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反 应液中，使PEG的最终浓度约为1%，置于冷冻离心机（4°C)上高速离心（速度为11000~ 13000rpm)10分钟后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液。 最后将沉淀物以ros缓冲液重新悬浮，使最终的单克隆抗体蛋白浓度约为50μg/ml左右，保 存于4°C备用。
[0043]二、胶体金试纸条的组装 所有生产用材料除了需要标记C线和T线的纤维素膜外，其余均可以在市场上采购到。 将纯化的PAG单抗用pH为7.2的PBS稀释至2mg/ml，以lul/cm2的量包被于纤维素膜上作为检 测线，即为T线;将羊抗鼠二抗用PBS，其pH为7.2，稀释至200yg/mL，然后以lyl/cm2的量包被 于纤维素膜上，作为质控线，即为C线，将金标PAG单抗稀释至lmg/mL，以20yL的量喷涂在玻 璃纤维上作为金标垫，将包被好的纤维素膜、、金标垫、样品垫、吸水垫粘贴在背板上，经切 条机切条后即可用于检测。
[0044]虽然上面的举例了一些特定实施例来说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅 局限于其中的各种细节。相反地，在等价于权利要求书的范畴和范围内可以不偏离本发明 精神地在各种细节上做出各种修改。
【主权项】
1. 一种牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心登记入册的编号为CGMCC No. 12034。2. -种PAG特异性单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂 交瘤细胞株CGMCC No. 12034分泌产生的。3. 根据权利要求2所述的PAG特异性单克隆抗体，其特征在于，制备该单克隆抗体所用 的基因片段如SEQ ID No. 1所示，制备该单克隆抗体的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。4. 权利要求2所述的PAG特异性单克隆抗体在检测或分离PAG蛋白中的应用。5. 根据权利要求1所述的牛妊娠相关糖蛋白PAG特异性单克隆抗体细胞株或权利要求2 所述的PAG特异性单克隆抗体在制备检测PAG蛋白试纸条中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105838679SQ201610225967
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】杨春江, 于在江, 马孝斌, 秦堃, 赵荣茂, 莫勋, 李妍
【申请人】北京瑞鹰生物技术有限公司