一种含有枯草菌素的生物饲料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种含有枯草菌素的生物饲料及其制备方法，制备方法包括：配制发酵培养液，含淀粉0.1～0.2％、葡萄糖0.4～0.6％、尿素0.1～0.2％、磷酸氢二钾0.2～0.4％、磷酸二氢钾0.1～0.2％、硫酸镁0.04～0.06％、酵母膏0.01～0.03％，pH值调为7.0～7.2；均为质量百分含量；将上述发酵培养液在100～120℃下灭菌10～20分钟，冷却至30～40℃后，先添加化合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为30～50μg/g，再按4～6％的接种量接入枯草芽孢杆菌发酵培养18～24小时，控制pH值为7.0～7.2；发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。添加本发明活性枯草菌素的饲料提高了围产前期奶牛血清IgM、IgA和IgG含量，进而可以提高围产前期奶牛抵抗疾病的能力。
【专利说明】
一种含有枯草菌素的生物饲料及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物饲料领域，涉及抗菌肽，具体涉及一种含有枯草菌素的生物饲料 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 枯草芽孢杆菌基我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来 越多的研制成微生物制剂。其制剂是无毒、无残留、无污染的"绿色"添加剂，具有广阔的发 展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。枯草 芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较 强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促 进生长起到重要作用。目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高 等问题。笔者对枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行了研究，以期提高枯草芽孢杆菌 的产量并降低生产成本。
[0003] 抗菌肽是一类由动植物和微生物机体经诱导产生的、具有杀菌活性并与机体先天 性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽。经过近四十年的研究，已有1500种肽被证实具 有高效的抗菌活性和免疫调节活性，并在医药、食品、农业等领域得到广泛应用。在国外，医 药上有多黏菌素和短杆菌肽S、达托霉素和恩夫韦地四种药品进入市场，另有十几个药品进 入临床试验阶段。作为食品防腐剂的乳链菌肽已经在50多个国家被广泛应用;将抗菌肽基 因转入农作物，是培育作物抗病新品种的有效途径。
[0004] 枯草菌素是从枯草芽孢杆菌中分离到的一种抗菌肽。枯草菌素可以用于生物饲料 的添加剂，可以提高牲畜的抗病菌能力，提高免疫力。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供一种高活性的枯草菌素，以用于生物饲料的添加剂， 显著改善牲畜的抗病菌能力，提高免疫力；
[0006] 本发明的第二目的在于提供一种含有上述高活性枯草菌素的生物饲料。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] -种活性枯草菌素，通过如下步骤制备而成：
[0009] 步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.1~0.2 %、葡萄糖0.4~0.6 %、尿素 0.1~ 0·2%、磷酸氢二钾0·2~0·4%、磷酸二氢钾0· 1~0·2%、硫酸镁0·04~0·06%、酵母膏0·01 ~0.03%，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分含量；
[0010] 步骤S2,将上述发酵培养液在100~120 °C下灭菌10~20分钟，冷却至30~40 °C后， 先添加化合物此丨6仰〇1^1111，使其在培养液中的浓度为30~5(^8/^，再按4~6%的接种 量接入枯草芽孢杆菌发酵培养18~24小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0011] 步骤S3，发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0012] 进一步地，所述的活性枯草菌素通过如下步骤制备而成：
[0013] 步骤SI，配制发酵培养液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氢二钾 0.3 %、磷酸二氢钾0.15 %、硫酸镁0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百 分含量；
[0014] 步骤S2,将上述发酵培养液在110°C下灭菌15分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为40yg/g，再按5%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养21小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0015] 步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0016] 进一步地，所述的活性枯草菌素通过如下步骤制备而成：
[0017]步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4 %、尿素0.1 %、磷酸氢二钾 0.2%、磷酸二氢钾0.1 %、硫酸镁0.04%、酵母膏0.01 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分 含量；
[0018] 步骤S2,将上述发酵培养液在100°C下灭菌20分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为30yg/g，再按4%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养24小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0019] 步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0020] 进一步地，所述的活性枯草菌素通过如下步骤制备而成：
[0021 ]步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氢二钾 0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.06%、酵母膏0.03%，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分 含量；
[0022]步骤S2,将上述发酵培养液在120°C下灭菌10分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为50yg/g，再按6%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养18小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0023]步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0024]上述活性枯草菌素作为生物饲料添加剂的用途。
[0025]进一步地，上述活性枯草菌素在生物饲料中的添加量为80~120g/100kg。
[0026] 本发明的优点：
[0027] 本发明提供的活性枯草菌素生物活性高，添加到饲料中后，可以显著改善围产前 期奶牛的免疫功能。本发明与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0029] 本发明中，未做特别强调的试验方法和试剂均为本领域常规试验方法和试剂。化 合物Heteroclitin J的制备方法参见文献:Compounds from Kadsura heteroclita and related anti-HIV activity,Phytochemistry,69(2008)1266-1272〇
[0030] 实施例1:活性枯草菌素的制备
[0031] 步骤SI，配制发酵培养液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氢二钾 0.3 %、磷酸二氢钾0.15 %、硫酸镁0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百 分含量；
[0032]步骤S2,将上述发酵培养液在110°C下灭菌15分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为40yg/g，再按5%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养21小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0033]步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0034]实施例2:活性枯草菌素的制备
[0035]步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4 %、尿素0.1 %、磷酸氢二钾 0.2%、磷酸二氢钾0.1 %、硫酸镁0.04%、酵母膏0.01 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分 含量；
[0036]步骤S2,将上述发酵培养液在100°C下灭菌20分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为30yg/g，再按4%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养24小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0037]步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0038]实施例3:活性枯草菌素的制备
[0039]步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氢二钾 0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.06%、酵母膏0.03%，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分 含量；
[0040] 步骤S2,将上述发酵培养液在120°C下灭菌10分钟，冷却至30~40°C后，先添加化 合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为50yg/g，再按6%的接种量接入枯草芽孢杆 菌发酵培养18小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0041] 步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0042] 实施例4:实施例1的对比，不添加化合物Heteroclitin J
[0043]步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.15%、磷酸氢二钾 0.3 %、磷酸二氢钾0.15 %、硫酸镁0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百 分含量；
[0044] 步骤S2,将上述发酵培养液在110°C下灭菌15分钟，冷却至30~40°C后，按5%的接 种量接入枯草芽孢杆菌发酵培养21小时，控制pH值为7.0~7.2;
[0045] 步骤S3,发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。
[0046] 实施例5:效果实施例，对围产前期奶牛免疫功能的影响
[0047] 一、材料与方法
[0048] 1、材料:按照实施例1~4的方法制备活性枯草菌素1~4。
[0049] 2、方法
[0050] 2.1试验动物及分组
[0051]选取30头处于干奶期（产前4周）、体况评分相近（3.25~3.75)、胎次相近（3~4 胎）、预产期相近的中国荷斯坦奶牛。随机分成5组，每组6头。对照组采用基础饲粮饲喂。试 验组1~4分别在基础饲粮的基础上分别添加100g/100kg的实施例1~4制备的活性枯草菌 素1~4。
[0052] 2.2饲养方法
[0053]奶牛集中饲养于同一栋棚舍式拴系牛舍中，试验期为3周，预饲期1周，从预产前4 周(产前28d)开始，持续到分娩当天。试验期间采用常规饲养及免疫，自由采食、自由饮水。 [0054] 2.3样品的收集与处理
[0055]分别在产前14、7d和分娩当天，尾静脉采集血液20ml，其中取5ml用一次性真空采 血管(EDTA)收集，用于测定全血白细胞和淋巴细胞含量;5ml用一次性真空采血管(肝素)收 集，用于淋巴细胞转化试验；另取l〇ml用一次性真空采血管(无抗凝剂)收集，3000rpm离心 15min，分离制得血清，-20°C冷冻保存。测定血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA) 和免疫球蛋白G(IgG)的含量。
[0056] 2.4检测指标和方法
[0057]饲料中干物质（DM)、粗蛋白（CP)、中性洗涤纤维（NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙 (Ca)、磷(P)的含量测定采用《饲料分析与质量检测技术》方法。血清中免疫球蛋白IgM、IgA 和IgG采用免疫透射比浊法检测。
[0058] 3、数据处理
[0059]试验数据采用SPSS20.0软件进行方差分析，差异显著性进行Duncans多重比较，表 中数值表示为Mean 土 SD。
[0060] 二、结果
[0061] 活性枯草菌素对围产前期奶牛免疫功能的影响见表1。
[0062]由表1可知，试验组1~3分别在分娩前14、7、0天的血清IgM、IgA和IgG均高于对照 组，与对照组相比差异显著(P<〇.〇5);试验组4在分娩前14、7、0天的血清IgM、IgA和IgG与 对照组无显著性差异(P>〇.05)，提高不明显。
[0063] 表1对围产前期奶牛免疫功能的影响
[0064]
[0065] 结果表明，添加本发明活性枯草菌素的饲料提高了围产前期奶牛血清IgM、IgA和 IgG含量，进而可以提高围产前期奶牛抵抗疾病的能力。
[0066] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种活性枯草菌素，其特征在于，通过如下步骤制备而成： 步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.1~0.2%、葡萄糖0.4~0.6 %、尿素0.1~0.2 %、磷 酸氢二钾0.2~0.4%、磷酸二氢钾0.1~0.2 %、硫酸镁0.04~0.06 %、酵母膏0.01~ 0.03%，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分含量； 步骤S2,将上述发酵培养液在100~120 °C下灭菌10~20分钟，冷却至30~40 °C后，先添 加化合物Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为30~50yg/g，再按4~6%的接种量接 入枯草芽孢杆菌发酵培养18~24小时，控制pH值为7.0~7.2; 步骤S3，发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。2. 根据权利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通过如下步骤制备而成： 步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.15 %、葡萄糖0.5 %、尿素0.15 %、磷酸氢二钾 0.3 %、磷酸二氢钾0.15 %、硫酸镁0.05 %、酵母膏0.02 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百 分含量； 步骤S2,将上述发酵培养液在110°C下灭菌15分钟，冷却至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为40yg/g，再按5%的接种量接入枯草芽孢杆菌发 酵培养21小时，控制pH值为7.0~7.2; 步骤S3，发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。3. 根据权利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通过如下步骤制备而成： 步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.1 %、葡萄糖0.4%、尿素0.1 %、磷酸氢二钾0.2%、 磷酸二氢钾〇. 1 %、硫酸镁〇. 04%、酵母膏0.01 %，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分含量； 步骤S2,将上述发酵培养液在100 °C下灭菌20分钟，冷却至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为30yg/g，再按4%的接种量接入枯草芽孢杆菌发 酵培养24小时，控制pH值为7.0~7.2; 步骤S3，发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。4. 根据权利要求1所述的活性枯草菌素，其特征在于，通过如下步骤制备而成： 步骤S1，配制发酵培养液，含淀粉0.2 %、葡萄糖0.6 %、尿素0.2 %、磷酸氢二钾0.4 %、 磷酸二氢钾〇. 2%、硫酸镁0.06%、酵母膏0.03%，pH值调为7.0~7.2;均为质量百分含量； 步骤S2,将上述发酵培养液在120°C下灭菌10分钟，冷却至30~40 °C后，先添加化合物 Heteroclitin J，使其在培养液中的浓度为50yg/g，再按6%的接种量接入枯草芽孢杆菌发 酵培养18小时，控制pH值为7.0~7.2; 步骤S3，发酵结束后，将发酵培养液冷冻干燥得到活性枯草菌素。5. 权利要求1~4任一所述活性枯草菌素作为生物饲料添加剂的用途。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于:添加量为80~120g/100kg。
【文档编号】C12P21/00GK105838762SQ201610298651
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】肖方方, 方华, 季春源, 孙中超, 季伟, 崔林
【申请人】江苏盐城源耀生物科技有限公司