量子点低密度脂蛋白纳米复合探针及制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料领域，涉及一种量子点低密度脂蛋白纳米复合探针及制备方法和应用。

背景技术：

量子点又被称为半导体纳米晶，是由少量的原子组成的尺寸在1～20nm的材料。由于量子限域效应和尺寸效应，量子点在受外界光激发后会发出不同波长的荧光。量子点因具有制备简单、荧光峰窄和光化学稳定性强等特点，相比于传统有机荧光染料，具有极大的优势。低密度脂蛋白是一种原生脂蛋白，直径在20～40nm左右，含有两亲磷脂单层和富含胆固醇酯的疏水核心。由于其同时具有小尺寸、高负载能力和天然的肿瘤靶向能力，因此在细胞应用方面具有广阔的应用前景。近年来研究的多功能纳米探针(例如荧光-药物输送、荧光-光热等)存在生物相容性差、制备复杂、成本高等缺点，不能很好地应用于生物探测、成像以及诊疗领域。因此，对于无毒且具有优异发光性能的生物相容性纳米探针的研制，具有重要的意义。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种具有极强的生物相容性、较高的荧光量子产率，制备方法简单易行以及制备可重复性高的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针及制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种量子点低密度脂蛋白纳米复合探针，其特征在于：所述量子点低密度脂蛋白纳米复合探针包括低密度脂蛋白、阳离子聚电解质以及水溶性量子点；所述低密度脂蛋白是核；所述水溶性量子点通过阳离子聚电解质偶联在低密度脂蛋白上。

一种量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

1)制备阳离子聚电解质的溶液、量子点分散液以及人低密度脂蛋白分散液；

所述阳离子聚电解质的溶液的具体制备方式是：将阳离子聚电解质加入到去离子水中进行稀释，形成阳离子聚电解质水溶液；在阳离子聚电解质水溶液中加入氯化钠溶液，搅拌后调节ph值，得到阳离子聚电解质的溶液；

所述量子点分散液的具体制备方式是：将表面修饰为巯基或羧基的水溶性量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液中，制备得到量子点分散液；

所述人低密度脂蛋白分散液的具体制备方式是：将人低密度脂蛋白粉末分散于磷酸盐缓冲液中，调节ph，得到人低密度脂蛋白分散液；

2)将步骤1)制备得到的阳离子聚电解质的溶液、量子点分散液以及人低密度脂蛋白分散液混合，通过库仑相互作用得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

上述步骤1)中的阳离子聚电解质是聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚丙烯酰胺；所述聚二烯丙基二甲基氯化铵的分子量以及聚丙烯酰胺的分子量均是任意；所述阳离子聚电解质的溶液中氯化钠的浓度范围为0.05～1mol/l；所述阳离子聚电解质的溶液的浓度是0.005～0.01mol/l，所述阳离子聚电解质的溶液的ph＝7.2～7.5。

上述步骤1)中量子点包括表面修饰为巯基、羧基官能团的所有一元、二元、三元、四元以及掺杂量子点；所述磷酸盐缓冲液是磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的ph为7.2～7.5；所述量子点分散液的浓度是1nmol/l～1mmol/l。

上述步骤1)中人低密度脂蛋白分散液的ph＝7.2～7.5。

上述步骤2)中人低密度脂蛋白分散液与阳离子聚电解质的溶液的体积比是1：0.1～1：50；所述阳离子聚电解质的溶液与量子点分散液的体积比是10：1～20：1。

上述步骤2)中混合的具体实现方式是：将阳离子聚电解质的溶液与量子点分散液混合后再与人低密度脂蛋白分散液混合；或者，将阳离子聚电解质的溶液与人低密度脂蛋白分散液混合后再与量子点分散液混合；所述混合的途径是逐滴加入或蠕动泵泵入。

一种量子点低密度脂蛋白纳米复合探针在生物和/或医学上的用途。

如上所述的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针作为荧光探针、药物或微纳米材料载体的用途。

如上所述的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针在肿瘤诊断及治疗时作为荧光探针、药物或微纳米材料载体的用途。

本发明的优点是：

本发明提供了一种量子点低密度脂蛋白纳米复合探针，包括低密度脂蛋白、阳离子聚电解质以及水溶性量子点；低密度脂蛋白是核；水溶性量子点通过阳离子聚电解质偶联在低密度脂蛋白上。本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针与传统的有机荧光染料相比，由于量子点具有超高的光化学稳定性以及超长的寿命，因此可以用于医学影像诊断；本发明采用的聚电解质辅助静电接枝法，与常规的化学键偶联法相比，具有偶联速度快、作用力强等优点；本发明采用的人低密度脂蛋白作为偶联载体，不仅具有较强的纳米粒子或药物负载能力，可以用于药物或者纳米功能粒子的负载和输运，从而进行多功能诊疗，而且具有较强的癌细胞靶向识别性，因此在肿瘤诊断、治疗等应用方面极具前景。本发明制备的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针具有极强的生物相容性、较高的荧光量子产率，且制备方法简单易行、可重复性高。

附图说明

图1是本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的合成示意图；

图2是本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的tem尺寸分布图；

图3是本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针对正常结肠细胞的存活率数据图；

图4是本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的光化学稳定性；

图5是本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针在肺癌上皮细胞的摄取照片。

具体实施方式

下面结合附图及其具体实施方式详细介绍本发明。但本发明的保护方位并不局限于以下实例，应包含权利要求书中的全部内容。

为了实现荧光探针的靶向性和发光性，本发明的目的之一是提供一种具有化学和发光稳定性的量子点-低密度脂蛋白复合探针(量子点低密度脂蛋白纳米复合探针)。本发明的另一目的是提供一种制备该量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的方法。

为实现本发明的目的，本发明的一个实施方案提供了一种高荧光量子产率、高化学稳定性的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针，其是由巯基或者羧基修饰的量子点和低密度脂蛋白通过阳离子聚电解质偶联，该量子点低密度脂蛋白纳米复合探针采用聚电解质辅助静电自主装制备，聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵(任意分子量)或者聚丙烯酰胺(任意分子量)。

根据本发明的一个实施方案的制备上述复合探针的方法可以由图1示意性示出。首先将阳离子聚电解质与低密度脂蛋白混合，然后与巯基或者羧基修饰的量子点混合。

根据本发明的一个实施方案制备复合探针的方法包括以下步骤：

1)制备阳离子聚电解质的分散液

提供阳离子聚电解质，加入去离子水稀释，然后加入氯化钠，调节其浓度。随后加入氢氧化钠调节其ph值。具体地，将阳离子聚电解质(包括任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚丙烯酰胺)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.005～0.01mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.05～1mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2～7.5之间。

2)制备量子点分散液：提供量子点粉末，加入到磷酸盐缓冲液中，调节量子点的浓度。具体地，将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(包括磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)中，将量子点的浓度调节到10^-3～10³μmol/l。

3)制备人低密度脂蛋白(ldl)分散液：提供人低密度脂蛋白粉末，加入到磷酸盐缓冲液中，调节溶液的ph。具体地，将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(包括磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2～7.5之间。

4)通过静电偶联制备探针：将步骤1)、2)以及3)得到的分散液混合，通过库仑相互作用得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。具体地，取1～10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入0.1～500ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入0.05～50ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

本发明给出了合成本发明的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的方法中许多参数的范围。应当理解，提及的参数范围是实施本发明的方法的优选工艺参数范围。不过，选择这些工艺参数范围的主要目的是有利于各步反应的进行，而不是对量子点的最终具体组成进行精确调节。本领域技术人员可以根据对发光波长的实际需要，调整各种元素之间合适的配比。

以下通过实施例对优选实施方式作具体阐释。

实施例中所用的人低密度脂蛋白为血清中分离；量子点为无毒量子点agins2；氯化钠，阳离子聚电解质(聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚丙烯酰胺)、磷酸盐缓冲液、磷酸钾缓冲液均购自sigma-aldrich试剂公司。

实施例1

1)将阳离子聚电解质(任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.05mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.05mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2之间。

2)将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，将量子点的浓度调节到1μmol/l。

3)将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2之间。

4)取10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入10ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入1ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

实施例2

1)将阳离子聚电解质(任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.07mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.07mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2。

2)将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，将量子点的浓度调节到1μmol/l。

3)将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2。

4)取10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入10ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入1ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

实施例3

1)将阳离子聚电解质(任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.05mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.07mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2。

2)将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，将量子点的浓度调节到1μmol/l。

3)将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.3。

4)取10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入10ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入1ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

实施例4

1)将阳离子聚电解质(任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.05mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.07mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.3。

2)将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，将量子点的浓度调节到10μmol/l。

3)将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.3。

4)取10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入10ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入1ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

实施例5

1)将阳离子聚电解质(任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚丙烯酰胺)加入到去离子水中，稀释到浓度为0.08mol/l，加入氯化钠溶液，使氯化钠的浓度为0.07mol/l，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2。

2)将量子点粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，将量子点的浓度调节到1μmol/l。

3)将人低密度脂蛋白粉末加入到磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)中，加入氢氧化钠溶液，将混合液的ph调节到7.2。

4)取10ml的人低密度脂蛋白分散液，逐滴加入10ml阳离子聚电解质的溶液，搅拌均匀。然后用蠕动泵加入1ml量子点分散液，混合均匀，然后离心洗涤，得到量子点低密度脂蛋白纳米复合探针。

实施例6

以与实施例1基本相同的方式，不同之处在于，在步骤1)中，将任意分子量的聚二烯丙基二甲基氯化铵替换为任意分子量的聚丙烯酰胺。

实施例7

以与实施例3基本相同的方式，不同之处在于，在步骤2)中，将磷酸钠缓冲液替换为磷酸钾缓冲液。

量子点低密度脂蛋白纳米复合探针性能表征：

使用动态光散射仪对实施例1得到的探针的尺寸进行表征，统计结果如图2所示。可以看到，探针的平均尺寸为27.8nm，尺寸分布符合正态分布。

采用本领域公知的方法对实施例2得到的探针进行细胞存活实验，如图3所示。可以看到，在孵育48h内，探针浓度为1μm以下时，细胞的存活率将近100％。当探针浓度高达6.3μm时，细胞存活率仍在60％以上。说明本发明得到的探针具有极低的细胞毒性和极佳的生物相容性。

以实施例3为例，测定实施例3得到的探针的光化学稳定性，结果如图4所示。在功率密度为100w/cm²的模拟日光灯的照射7h下，探针的荧光量子产率保持不变，几乎未衰减。说明探针具有极高的光化学稳定性。

采用本领域公知的方法对实施例5制得的探针对干细胞进行标记，荧光照片如图5所示。可以看到探针靶向性地标记到干细胞上，在紫外光的照射下，显示了明亮的荧光。

本发明所提供的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针由于通过物理静电吸引方式实现的量子点和ldl(低密度脂蛋白，lowdensitylipoprotein)之间的偶联组装，因此ldl的表面得以完整保存。癌细胞和癌干细胞高表达ldl受体，因此本发明的量子点-ldl荧光探针具有天然的癌细胞和癌干细胞靶向性。实验表明，ldl受体在癌干细胞中具有高于普通癌细胞的表达性。因此，通过将本发明的探针与癌干细胞共孵育，癌干细胞表面的ldl受体与量子点-ldl荧光探针的ldl配体结合，干细胞表面形成有被小窝，进而形成包裹量子点低密度脂蛋白纳米复合探针的有被小泡，从而进入癌干细胞内。此后，有被小泡进入细胞后，脱去外衣，与胞内体的小囊泡结合形成大的内体，其内容呈酸性，使ldl受体与探针的ldl配体分离，量子点低密度脂蛋白纳米复合探针进入细胞质。通过外界的激发光的照射，可以使得荧光探针中的量子点发出明亮的荧光。如果ldl中负载药物，那么由于细胞质内有丰富的溶酶体分解ldl，其内含的药物进入细胞中，从而进一步对单个癌干细胞进行化疗。因此本发明的量子点低密度脂蛋白纳米复合探针不仅具有荧光定位的功能，同时还可以实现对单个癌细胞或癌干细胞的精准治疗，以较小的剂量实现较好的治疗效果。

本发明量子点低密度脂蛋白纳米复合探针相对于现有技术而言，采用生物相容性的ldl作为荧光物种和药物的载体。通过不同的方式将荧光物种和药物分别负载于ldl的表面和内部，充分利用其结构和官能团，使其效用最大化。目前同领域实现荧光和化疗作用的大多采用人工合成的二氧化硅(sio2)多孔小球、金属有机框架(mofs)或者多孔碳材料，这些材料尽管具有较大的负载能力，但是对于生物体而言属于外来物。目前学术界研究表明，人工合成的纳米粒子对生物体具有极大的安全隐患。因此采用生物体内源性脂蛋白作为纳米载体，具有极大的优势和应用前景。