氯丙烷和4ml I mol/L氢氧化钠溶液(I ml环氧氯丙烷和4ml氢氧化钠溶液在缓慢搅拌下，13小时内分5次加入，每次间隔2.6小时)，于60°C下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，得到的环氧活化磁珠。然后再加入4ml浓度5mol/L碳酸钠溶液、0.5 g EDDS-Na3,3mg NaBH4，在40°C下缓慢搅拌15小时。将连接了 H)DS的磁珠先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，即得到可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。该实施例制得的金属螯合磁珠在0.5mol/L硫酸锌溶液中每毫克能吸收0.01 lmmol Zn2+0
[0016]实施例3
在Iml 10mg/ml羟基磁珠中加入10 mol/L氢氧化钠溶液充分活化后，得到含活化后羟基磁珠和碱液的混合物I ;10mol/L氢氧化钠溶液加入量为可使混合物I的pH值达到13 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亚砜、I ml环氧氯丙烧和4ml浓度为1.5 mol/L氢氧化钠溶液(I ml环氧氯丙烷和4ml氢氧化钠溶液在缓慢搅拌下，12小时内分5次加入，每次间隔2.4小时)，于60°C下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，得到的环氧活化磁珠。然后再加入4ml 2mol/L碳酸钠溶液、I g EDDS-Na3,5mg NaBH4，在60°C下缓慢搅拌12小时。将连接了 H)DS的磁珠先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，即得到可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。该实施例制得的金属螯合磁珠在含0.5mol/L Cd2+的溶液中每毫克能吸收0.0lOmmol Cd 2+0
[0017]实施例4 在Iml 10mg/ml轻基磁珠中加入5 mol/L的氨水充分活化后，得到含活化后轻基磁珠和碱液的混合物I ;5 mol/L的氨水加入量为可使混合物I的pH值达到12 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亚砜、I ml环氧氯丙烧和4ml浓度为I mol/L氢氧化钠溶液(I ml环氧氯丙烷和4ml氢氧化钠溶液在缓慢搅拌下，12小时内分5次加入，每次间隔2.4小时)，于60°C下缓慢搅拌过夜后过夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，得到的环氧活化磁珠。然后再加入4ml浓度为2mol/L碳酸钠溶液、0.5 g的EDDS_Na3、5mg的NaBH4，在50°C下缓慢搅拌13小时。将连接了 H)DS的磁珠先用水洗，然后稀醋酸洗，最后水洗至中性，即得到可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。该实施例制得的金属螯合磁珠在0.5mol/L硫酸锰溶液中每毫克能吸收0.0lOmmol Mn'本实施例中采用的羟基磁珠为娃轻基磁珠，粒径为400-600nm。
[0018]相关实验
利用本发明提供的可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法制得的金属螯合磁珠，金属螯合力强，结合容量大，可移除蛋白质中的Cu' Zn' Mn' Cd 2+等金属离子，相对于同类产品具有更优秀的重金属移除效果。下面通过对比试验来进行证明。
[0019]取实施例2制得的可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠(简称磁珠-EDDS)作为试验组，与Sepharose-EDDS和磁珠-1DA进行对比，验证对蛋白中重金属离子Cu'Zn'Mn'Cd 2+的移除能力。
[0020]生长10天的小麦幼苗采用20 μ mol/L Cd 2+处理三天，取小麦根，用液氮充分研磨，然后加入4倍体积含lmmol/LPMSF的20mmol/L磷酸钠，pH 5.8。充分混勾后4°C下、15000g离心30min，收集上清，蛋白浓度测定参照Bradford(1976)方法，以BSA作为标准。
[0021]准确称取0.2g吸干过的上述三种金属螯合材料，置于1.5ml离心管中，加入Iml20mmol/L磷酸钠平衡4min，弃上清，随后加入I ml提取的蛋白，不断混悬，然后收集上清，测定其金属和蛋白含量。金属含量的测定用原子吸收分光光度法。
[0022]结果显示，经20ymol/L Cd2+处理的小麦根蛋白溶液中Cd为12.68 μ g/mg蛋白，Cu 为 2.26 μ g/mg 蛋白，Zn 为 4.51 μ g/mg 蛋白，Mn 为 4.33 μ g/mg 蛋白。磁珠-EDDS、Sepharose-EDDS和磁珠-1DA都能显著去除蛋白溶液中的Cd2+，移除率分别为98.72,93.43和89.55%,效果最好的是磁珠-EDDS ;磁珠-EDDS、Sepharose-EDDS和磁珠-1DA对蛋白溶液中的Cu'移除率分别为99.01,96.23,84.47%，效果最好的是磁珠-EDDS ;磁珠-EDDS、Sepharose-EDDS和磁珠-1DA对蛋白溶液中的Zn2、移除率分别为95.12 %、92.03 %、86.53%，效果最好的是磁珠-EDDS ;磁珠-EDDS、Sepharose-EDDS和磁珠-1DA对蛋白溶液中的Mn'移除率分别为96.33%,93.21%,66.25%，效果最好的是磁珠-EDDS，即本发明所制备的可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠。
【主权项】
1.一种可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、羟基磁珠的活化:在羟基磁珠中加入碱液进行活化，得到含活化后羟基磁珠和碱液的混合物I，备用；所述碱液的加入量为可使混合物I的pH值达到12-14 ; 步骤二、环氧化:按照混合物1、二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液的体积比为1:2:1: 4的比例，在上述步骤一所得混合物I中加入二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，混合后在60°C的温度下，搅拌12-14小时，使活化后羟基磁珠连接上环氧基，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到环氧活化磁珠，备用； 步骤三、在每1mg上述步骤二所得环氧活化磁珠中加入4ml浓度为l~5mol/L的碳酸钠溶液、0.1~1 g的乙二胺二琥珀酸三钠和l~5mg的硼氢化钠，混合后在40-60°C的温度下，搅拌10~15小时，除去溶液，将所得磁珠洗至中性后吸干，即制备出可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠。2.如权利要求1所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:所述碱液为氢氧化钠溶液或氨水。3.如权利要求2所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:所述氢氧化钠溶液或氨水的浓度为5-10 mol/Lo4.如权利要求1所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:步骤二中所述氢氧化钠溶液和环氧氯丙烷在12-14小时内分5次加入处于搅拌状态的含有活化后羟基磁珠的混合物中。5.如权利要求1所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:步骤一中所述轻基磁珠的表面功能基团为娃轻基。6.如权利要求5所述金属螯合磁珠的制备方法，其特征在于:所述羟基磁珠的粒径为400_600nm，在喊液中的浓度为10mg/mlo7.如权利要求1所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:步骤二和步骤三中洗至中性的方法为，先采用蒸馏水洗，再用稀醋酸洗，最后用蒸馏水洗至中性。8.如权利要求1所述可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，其特征在于:步骤二中所述氢氧化钠溶液的浓度为I mol/L。
【专利摘要】一种可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠制备方法，制备方法为，在羟基磁珠中加入碱液进行活化，得到含活化后羟基磁珠和碱液的混合物Ⅰ；所得混合物Ⅰ中加入二甲亚砜、环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，混合后在60℃的温度下，缓慢搅拌12-14小时，得到环氧活化磁珠；所得环氧活化磁珠中加入碳酸钠溶液、乙二胺二琥珀酸三钠和硼氢化钠，混合后在40-60℃的温度下，缓慢搅拌10~15小时，即制备出可从大分子中移除金属离子的金属螯合磁珠；该方法制备工艺简单，易于放大，将该磁珠加入溶液后可快速移除溶液及生物大分子中的重金属离子，方便对生物大分子的结构和功能进行分析。
【IPC分类】B01J20/22, B01J20/30, B01J20/28
【公开号】CN105107464
【申请号】CN201510516623
【发明人】张红晓, 宋玉峰, 王发园, 侯典云
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月21日