专利名称：一种多表位tk1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其应用，具体讲涉及一种高特异性、高灵敏度多表位TKl 抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用。
背景技术：
癌症是人类的死亡杀手，尽管有许多影像检测方法和治疗手段，例如化学治疗、 内分泌治疗、放射治疗和手术等，虽然已经有了很大的进步，但远远不可能达到完美的程度，伴有复发和转移的可能。因此，早期的发现，特别是早于癌前病变期的发现和早期的治疗是给予患者康复的最佳福音。癌症是一种细胞异常增殖的慢性疾病。癌细胞异常和失控的增殖是由于正常细胞中与增殖相关的基因发生了某种或多种突变所引起的，虽然基因表达异常，但尚未癌变，因此被称为癌前状态或癌前疾病。癌前疾病是指患这些疾病的人比其他人得癌症的机会要大大的增加，因而也被称为癌前疾病或癌前状态。而按照细胞病理学概念，一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，称为癌前病变。细胞癌变过程是分阶段发展和逐渐演变的。 从致癌因子攻击正常组织细胞到产生癌症，一般需要10年以上甚至更长的时间，进展速度与病程长短主要取决于肿瘤类型和个体差别。癌前疾病发展成癌症疾病的这个漫长的过程中，也分为轻，中，重等不同阶段。重度癌前病变是恶性肿瘤发生前的最后一个、也是最危险的时期。显然，防治癌前病变是预防肿瘤和肿瘤治愈最为关键的环节，为全世界所关注。然而，癌前病变发生的时间和部位都具有不确定性，而且病变尚处于细胞水平，无殊症状和体征，现行的检测手段难以及时检查发现。而现有体检中使用的常规血液检验(血液中的有形成分即红细胞、白细胞及血小板这三个系统的质和量进行检测与分析)和尿液检测，可提供血清或尿液蛋白质或酶等异常指标和相关疾病的信息；现有的常规物理学影像检测方法(B-超，X-光)，可观察到组织器官中的息肉或息肉增大，囊肿或可疑肿瘤的相关信息，但这些方法尚不能知道被检者组织器官中显示的息肉，囊肿或肿块的肿瘤细胞的异常增殖情况，很难评估是否有可能进程为恶性肿瘤。特别指出的是，但到目前为止，很少有可信的肿瘤生长相关标志物应用于体检筛查。2008年，美国信诺保健公司将现用肿瘤标志物(Tumor Markers)如何用于癌症的诊断和监督进行汇编，提出公认的准则和实践指南，对于肿瘤相关的血清标志物，进行了评估。 对于现有许多肿瘤标志物进行回顾研究，例如CEA，CA15-3, CA199和AFP等一系列标志物， 由于这类标志物不与肿瘤细胞的增殖直接相关，它们通常是不可能用单独一种肿瘤标志物的水平来检测和诊断癌症疾病，这类型标志物升高，可能预示有癌症，但它们的存在并不能诊断是癌症，这些标志物检测是需要结合其他诊断方式(例如活检、放射/成像)才能确认为癌症。二十世纪五十年代末，研究者发现胸苷激酶(TK，ATP thymidine5' -phosphotransferase, EC. 2. 7. 1· 21，简称 TK)，一种嘧啶补救途径的酶，催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现细胞质胸苷激酶(简称 TKl)和线粒体胸苷激酶(简称TK2)。胸苷激酶1 (简称TK1，也称为细胞质胸苷激酶)是与细胞周期调控密切相关的细胞周期类标志物，随后的大量基础研究和实验肿瘤学证明了 TKl表达是与细胞生长状态紧密联系的，因此TKl可以作为一种好的细胞增殖标记物来检测增殖细胞的增殖活性，因此将适用恶性肿瘤的增殖度检测。对血清胸苷激酶1值(STKl)进行分析，重要的是，体内正常细胞增殖不会导致血清胸苷激酶1水平的增加，因为正常的细胞分裂是按照细胞凋亡调控规律进行的，细胞内胸苷激酶1在细胞分裂之前已经被降解，但肿瘤细胞逃逸了细胞凋亡规律的调控，导致细胞异常分裂增殖，肿瘤细胞(包括S和G2期的细胞)中的胸苷激酶1被释放至体液。因此， 在细胞过度增生的情况下，STKl水平与肿瘤细胞增殖速度相关，并与疾病的轻重程度有关。 由于在总的血清TK中，TKl高于95%，TK2低于5%，因此STKl的活性检测同样适用于血清学，作为一优选的肿瘤细胞增殖标记物。采用人TKl抗体检测血清TKl浓度水平更能真实代表集体内是否存在异常增殖的细胞，因此，在近10多年里，按照抗体制备原理，一种TKl抗体已经试用于临床实践中。多个团队制备了不同的TKl抗体用于肿瘤疾病的鉴定和监控，但不适用于常规人群体检筛查。在这基础上，我们于2002年进一步筛选研究，选择了暴露在TKl蛋白质表面的抗原决定簇C端部分的这一关键免疫序列-31肽(195-225)制备了抗人TKl-IgY抗体(中国发明专利号 W0204 100760Α1，国际专利号 W 0 204100760Α1. 25/11-2004)。采用人 TKlC 端 31肽制备的抗人TKl-IgY抗体及利用其制备的血清免疫学和组织免疫学肿瘤检测试剂盒， 这抗体将同时检测有活性的TKl蛋白和非活性的TKl蛋白，也能检测TKl蛋白质与其他的分子形成的复合物。尽管这血清试剂盒-增强发光免疫点印迹法检测系统试用于体检筛查中，检测范围在0. 3-2ρΜ之间，但在0. I-IpM时，误差有时会大于30%，采用人群常规体检血清TKl和癌症患者血清TKl进行ROC值分析，ROC值曲线下面积为0. 96，特异性为0. 991， 最大似然法比例(+)为56. 04，证明抗体的特异性很好，可以用于人群体检筛查，但灵敏度在0. 51 %，需进一步制备检测灵敏度高、特异性和稳定性好的抗体来完善检测系统，以便更好的提高在0. I-IpM范围内的检测精确度。
发明内容
在采用人宫颈癌细胞的TKl单体上C端31肽(195-225)作为抗原的基础上，经多年实践，筛选出了暴露在TKl蛋白表面的多点位特别抗原决定族，包括N端部分的关键性免疫多肽序列23肽，C端20肽和C端部分的关键免疫序列观肽，应用上述关键免疫序列做特别抗原，采用母鸡免疫最终纯化并组合制备了抗人TKl-IgY抗体。与现有的国际商用抗人TKl-IgG抗体相比，所制备的抗体具有纯度高(> 99% )、产量高、高灵敏度、高特异性且无非特异性免疫交叉反应，并可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，便于商业运输、 保存和操作等优点。本发明的抗人TKl多表位抗体和TKl检测系统，能真实的反映细胞的增殖度，因而能在早于影像学检测的情况下，在体检人群中预警早期潜在的异常细胞增殖， 警示被检者可能进程为恶性肿瘤的风险。本发明提供的技术方案包括1、设计和筛选抗原
4
选择暴露的蛋白表面上N、C端的肽段。2、制备抗体利用上述关键免疫序列与KLH交联组成23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原分别去免疫母鸡制得。而利用母鸡免疫的优点在于(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在分子遗传差异性；( 鸡的TKl和人的TKl有种族差异性；C3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比较，IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子，即IgY) A4) IgY抗体不激活人补体系统，从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活；(5)类风湿因子 (RF)不与IgY抗体反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源，因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应，可导致病人和健康人血清的假阳性；(6)现在大多数乳腺癌患者，需要辅助治疗，许多患者接受化疗，例如赫赛仃、靶向治疗药、单克隆抗体，以后也还需抗激素治疗，特别是抗体治疗情况下，TKl-IgY抗体显示出比单抗体检测更具有优势。3、纯化抗体利用所述N端23肽，C端20肽，C端28肽序列分别与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，分别用本发明中的抗原决定簇制备的亲和层析柱来纯化抗体。所述纯化包括下述步骤第一步，初筛出免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度，即对每个免疫母鸡的卵黄液体进行分离，采用水萃取后得到抗体粗品，经亲和层析纯化得到初筛的高特异性和高灵敏度的抗人TKl抗体。根据免疫抗原的类型对亲和柱进行选择，混合后的粗品液是来源于23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原免疫的抗TKl-IgY抗体，亲和柱制备必须为N端23肽，C端20肽和C端28肽的亲和柱。第二步，制备组合免疫抗原的亲和柱，对初筛出的3种抗体进行组合的配比测试， 其特征在于组合抗原亲和柱配比选择。制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体的混合比例，计算出相对应的抗原决定簇，即23肽，20肽和观肽量的百分比。经亲和柱层析纯化测试后，选择最佳的配比组合方案。4、多位点抗体组合制备抗人TKl-IgY抗体，除另有说明外，本申请中的百分比为质量百分比。配比范围23肽免疫的单一抗体占25% 45%，20肽免疫的单一抗体占20% 40%, 28肽免疫的单一抗体占20% 55%。5、鉴定抗人TKl-IgY抗体的灵敏度和特异性1)确认制备抗体是否仅与人的TKl有特异性反应，第一步采用TKl阳性和阴性细胞株，西部印染法来鉴定抗体的特异性利用淋巴瘤阳性株CEM TKl+和阴性株CEM ΤΚΓ来鉴定。经天然胶电泳后进行TKl抗体西部免疫印染，CEM TKl阳性株有一条明显的TKl电泳带，CEM TKl阴性株没有显现任何带。确认抗体的是仅与TKl酶有免疫反应，是特异性抗体。2)确认制备的抗体是否仅与肿瘤患者的血清TKl有特异性反应，第二步采用选择已确认为健康无疾病者的血清和肿瘤患者阳性值的血清标本，用增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值，健康者应该低于检测阈值2pM 或不显示免疫反应。确认了抗体与健康无疾病者的血清无免疫交叉反应，是特异性抗体，并比较肿瘤患者血清中STKl的强度反应，对初筛出的不同抗体进行鉴定，筛选出灵敏度高和特异性好的抗体。3)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者中TKl有特异性反应，从2、步中筛选出灵敏度高和特异性好的抗体，采用初诊但未治疗肿瘤患者的血清和健康无疾病者的血清标本点样，进行天然胶电泳后，再用抗TKl抗体西部免疫印染，肿瘤患者的血清标本显示一条明显的TKl电泳带，健康无疾病者的血清标本没有显现任何带。确认抗体是仅与肿瘤患者的血清TKl酶有免疫反应，是特异性抗体。本发明是利用上述组合抗体在十万级的洁净环境下，将抗体进行分装，组装TKl 免疫检测试剂盒，并与化学发光分析仪结合，应用于人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警。该发明涉及早期预测，能在早于影像学检测癌症的情况下，用于检测多种类型的癌前疾病/早期潜伏肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病与异常细胞增殖，预警被检者可能进程为恶性肿瘤的风险。STKl检测进入体检套餐，筛选STKl升高的风险人群，与下列恶性肿瘤进程相关的疾病联合评估体内细胞异常增殖情况，包括癌前病症风险人群的定期动态观察；例如组织中/重度增生，息肉病变，中/重度溃疡或糜烂，病毒性肝炎阳性，例如乙肝135/145，难治型贫血疾病等等；定期监控相关疾病可能渐变为癌疾病风险进程，例如良性肿瘤，中/重度脂肪肝，超重，与肿瘤疾病相关的长期慢性炎症等等；肿瘤康复患者人群定期监控，风险预警；预警体内有无细胞异常增殖3-6个月STKl持续高水平者，但现无体征疾病.预警体内有细胞异常增殖，需与相关影像仪，肿瘤标志物，血清和尿液指标联合定期监控，观察细胞异常增殖变化。体检中心检测被检者STKl水平，建立健康者个体STKl的基础水平，例如无肿瘤疾病健康被检者，需取初次第1个月内的样品，分析STKl的水平，3个月中，进行3次重复检测，将3次的检测结果计算出平均值，得出健康者个体STKl的基础水平，无肿瘤疾病健康被检者一般在低于ΙρΜ，以后每年的常规体检期间，用检测的STKl值与个体的STKl的基础水平进行比较。可能进程为癌疾病风险的被检者的预测是按照个体的TKl的基础值与以后年检 TKl值，对两者的STKl水平比较。例如，现年检STKl值与个体STKl的基础比较，如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，但TKl的水平仍低于风险阈值，被检者评估为细胞异常增殖水平低，进程为癌疾病的风险低；如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，STKl的水平升高1-2倍，超过 2pM，被检者评估为细胞异常增殖水平升高，预警进程为癌疾病的风险升高。采用这方法对被检者进行定期检测，可以监控个体数年，以至数十年，判断被检者是否处在癌疾病低风险或高风险情况。因此，这发明给予被检者和体检中心医生的早期信息。如果是STKl升高，预警被检者有癌疾病进程的高风险；给医生将有可能建议相关的干预治疗方案，给予被检者远避风险和治愈的最佳机会和现有技术比，本发明的优点如下(1)本发明所制备的抗体具有纯度高(> 99% )、产量高、高特异性无非特异性免疫交叉反应且检测精度在可达到0. IpM0受试者工作曲线表示R0C曲线下面积值= 0. 96 (ρ < 0. 0001)，最大似然法比例(+)明显升高为236. 49，特异性高达0. 997，灵敏度高达 0. 737。(2)适用于人群体检筛查，可按照体检者不同的个体情况和血清TKl (STKl)水平的变化大于2pM，预示异常细胞增殖度，给个人和医生提供信息，进行合理的保健防范/干预治疗，远避风险，将可能极大提高患者治愈效果。(3)稳定性好，可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，更便于商业运输和保存并能降低试剂的潜在成本。
图1 :ABmart抗体分析测试TKl蛋白图谱。图2 (a) TKl抗体试剂盒点样结果图(b) STKl点印迹实验分析软件测试TKl抗体试剂盒点样数据(C)STKl点印迹实验分析软件测试TKl抗体试剂盒点样数据曲线3 (a)为CEM TKl+和CEM ΤΚΓ的西部印染结果。(b)为鉴定治疗前淋巴癌患者，治疗前/后的头颈癌患者，健康人血清的西部印染结果。图4 =CEM TK1\ CEM ΤΚ1_、宫颈内膜癌和结肠癌的TKl抗体染色结果图5 生物素-TKl-IgY抗体O步法)与三步法的比较6 体检中心提供的血清TKl检测的ROC图表图7 华瑞同康的抗TKl-IgY抗体与市售商用抗TKl-mAb抗体的实验比较图
具体实施例方式用以下实施例对本发明作详细描述实施例1 选择特异性多表位抗原如图1所示，用软件预测TKl无信号肽，无跨膜结构。图示单链TKl蛋白234氨基酸分布，指出氨基酸的亲疏水性氨基酸分布较均勻。图谱提供了可选方案1)从抗原性角度考虑，在蓝色曲线峰值高的地方选择的多肽较好；幻按照亲水性氨基酸的分布，选择亲水区域；幻选择负值所示疏水性较强的芳香族氨基酸。实例2 选择高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TKl-IgY抗体的抗原选择制备高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TKl-IgY抗体的抗原的选择由于人宫颈癌TKl的部分序列有与其它蛋白具有相同的表位，得到的抗体可能与其它非特异性蛋白有交叉反应，纯化困难，按照已公布公知的TKl序列(蛋白质文库)，选择暴露在蛋白质表面的特别肽，按照用软件预测得到的多肽的特异性程度大于85%的多肽片段列于下表， 筛选的TKl特异性强的抗原片段，设计了 TKlN端23肽，C端20肽和C端观肽作为半抗原。
权利要求
1.一种高特异性、高灵敏度的抗人TKl抗体，其特征在于所述抗体选择的TKl蛋白包括TK1蛋白质，具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TKl蛋白质，或TKl蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。
2.一种抗原表位，所述决定表位包括人宫颈癌细胞TKl单体N端23肽、C端20肽和C端观肽，其氨基酸序列分别如下=N端23肽(3-25) :CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL ； C 端 20 肽(206-225) CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ 禾口 C 端 28 肽(198-225) AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
3.一种利用权利要求2所述的抗原决定簇制备抗体的方法，其特征在于所述方法包括利用权力要求2所述的三段多肽免疫序列分别与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体， 采用水萃取制备抗体溶液，分别用所述的抗原决定簇制备的亲和层析柱纯化抗体，初筛出高特异性、高灵敏度的抗体。
4.一种利用权利要求3所述的方法所得的组合抗体制备的高特异性、高灵敏度的多表位抗人TKl-IgY抗体，其特征在于所述的抗体按质量百分数计包括所述23肽免疫的单一抗体为25% 45%，所述20肽免疫的单一抗体为20^-40%, 肽免疫的单一抗体为 20% 55%。
5.一种利用权利要求3所述的方法所得的组合抗体制备的高特异性、高灵敏度的多表位抗人TKl-IgY抗体，其特征在于所述的抗体按质量百分数计包括所述23肽免疫的单一抗体为25% 30%，所述20肽免疫的单一抗体为20% 25 %，观肽免疫的单一抗体为 50% 55%。
6.一种用权利要求3至5中任一权利要求所述的抗体，其特征在与所述的抗体选择的 TKl蛋白包括TK1蛋白质，具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TKl蛋白质，或TKl蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。
7.一种对权利要求4中所述的配位组合的抗人TKl-IgY抗体的检测方法所述检测方法包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法、抗体直接标记生物素方法。
8.一种利用权力要求4至5中任一权利要求所述的组合抗人TKl-IgY抗体与化学发光检测系统结合用于人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警的试剂盒。
全文摘要
发明提供了一种人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽、C端20肽和C端28肽组成的抗原决定簇制备的一种高特异性、高灵敏度的配位组合抗人TK1抗体以及其检测诊断系统在肿瘤诊断中的应用。抗原决定簇所包含的氨基酸序列为N端23肽(3-25)CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽(206-225)CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ、C端28肽(198-225)AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。本发明同时提供了应用该抗原制备抗体的方法，所提供的抗体试剂盒具有灵敏度高，特异性高，成本低廉等特点通过增强化学发光点印迹检测法和免疫组化检测及检测试剂盒能够在人群体检筛查中检测早期肿瘤和进行风险预警。
文档编号G01N33/573GK102504027SQ20111035397
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者周际, 斯文·斯库格, 李劲, 艾伦·何 申请人:周际, 斯文·斯库格, 李劲, 艾伦·何