一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，该融合抗原氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，本发明还公开了所述融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。经实验验证，本发明的融合抗原较单片段HVR1抗原的交叉反应性有显著提高，与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符合率高达99％。由于HVR1是丙型肝炎病毒中的主要中和性抗原表位，因此，通过本发明抗原的应用，对于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测，实现对HCV感染全面检测目的，以及用于HCV疾病的转归和预后、干扰素疗效的预测等问题均可得到有效解决，具有极大的临床应用前景。
【专利说明】一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及丙型肝炎病毒抗原，尤其涉及一种丙型肝炎病毒第一高变区（HVR1) 融合抗原及其在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)感染最显著的临床特征就是引起慢性感 染，约有70%的丙肝有可能发展成慢性肝炎，20%发展成肝硬化，12%发展成肝癌，危害十 分地严重。全世界约有1. 7亿人携带HCV，预计我国HCV感染者4300万，而且每年的新发病 例数不断上升，感染率约为3. 2%。
[0003] 自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究工作，但因病毒 RNA在血液含量较低且非常不稳定，HCV基因组变异率较高（目前主要分为6种基因型： HCV1?HCV6)，病毒准种多，缺乏理想的体外感染细胞模型，导致预防性疫苗缺乏保护性抗 体，不能阻止患者再次感染，使得疫苗研究进展缓慢，至今未能研制出有效的丙肝疫苗，造 成了丙肝预防上的困难，发病率正呈逐渐上升趋势，流行范围也逐渐扩大。血液筛查是我国 目前主要采取来控制丙肝蔓延的手段。这使得研究开发丙型肝炎病毒检测试剂盒十分迫切 并具有重要的临床意义。
[0004] HCV基因组长约9. 6kb，编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体，在宿 主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白（C、El、E2、p7)和6种非结 构蛋白（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，其中E1、E2为包膜糖蛋白，是中和抗体的主要 革巴抗原。丙型肝炎病毒第一高变区（HVR1，hypervariable region 1)位于E2包膜蛋白的 N端，约27个残基，是HCV整个基因组中的变异最大的区域，并随着感染者体内免疫压力的 变化HVR1序列呈现出不同的动态变化。目前，克隆测序的HVR1序列已经多达上千种，呈 现出很强的多样性和复杂性。由于HVR1含有HCV重要的中和性抗原表位，感染者早期出 现抗 HVR1 抗体与疾病的自愈有关（Zibert A，Meisel H，Kraas W，et al. Early antibody response against hypervariable region 1 is associated with acute self-limiting infections of hepatitis C virus. Hepatology. 1997 ;25 (5) :1245-9.)。因此，对 HVR1 抗 体的检测较HCV其他区抗体检测更具有临床诊断意义。然而，由于HVR1变异的复杂性，对 HVR1抗体的检测目前主要通过对HVR1-RNA的钓取，合成相应的HVR1多肽进行检测。上述 方法可以直接检测到相应的变异株的HVR1抗体。但由于HCV感染者存在RNA间歇阳性及 早期病毒滴度低的特点，上述方法无法普遍应用于大多数HCV感染的HVR1抗体检测。
[0005] 进一步研究发现HVR1抗原并不是严格的株特异性，而具有一定的交叉活性，即一 条HVR1抗原可以和多份不同的HCV血清发生阳性反应。因此，可以通过获得一条能囊括大 部分变异株的HVR1抗原解决膜区抗原的变异问题。美国Chiron公司在即将推出的第四代 HCV免疫诊断试剂盒中，就加入了一段具有高交叉反应性的HVR1模拟肽，该抗原在临床HCV 患者的血清中的交叉范围为69%，但在献血员HCV阳性血清中的覆盖面只能达到39%，远 低于C区抗体的检测率（65%)。这显然是不能满足HCV诊断中对包被抗原的活性要求。 修冰水等研究获得了 12条重组HVR1肽抗原，用随机选择的27份我国HCV阳性血清进行交 叉反应性检测，发现每条重组HVR1均和不止一份的阳性血清有反应。选择其中4条适合我 国的交叉反应性较好的重组HVR1，其交叉反应率可覆盖27份阳性血清的25份（92. 5% ) (修冰水，凌世淦，宋晓国，张贺秋等丙型肝炎病毒第一高变区代表序列重组肽的交叉 性研究，军事医学科学院院刊，2002,26(2) :93-98。军事医学科学院基础医学研究所，专利 号：ZL 01141879. 6)。基于此，利用筛选丙型肝炎病毒主要基因型的HVR1区序列，通过基因 重组的方法，将筛选的基因型HVR1区抗原融合成一条融合多肽，获得了一条具有覆盖HCV 所有基因型、高交叉反应的HVR1融合抗原有着极大的临床应用和开发前景。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种丙型肝炎病毒第一高变区 (HVR1)融合抗原及其在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒中的应用。
[0007] 本发明所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，其特征在于：所述融合抗原氨基 酸序列如SEQ ID No. 1所示，具体描述是：
[0008] STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK GGGGSGGGGSGGGGSETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQNGGGGSGGGGSGGGGSGTHVTGGKAGHTIHGFTSLF TRGSAQNGGGGSGGGGSGGGGSSTHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYVSGGASGFNT HVFTGIFSSGASQK。
[0009] 上述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的氨基酸序列构建方法，其特征在于：将 筛选确定的如下6种丙型肝炎病毒HCV1?HCV6基因型第一高变区抗原，在其氨基酸序列 间加入柔性短肽序列，使其连接成为氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示的融合抗原；其中， [0010] 所述6种丙型肝炎病毒HCV1?HCV6基因型第一高变区抗原氨基酸序列如下：
[0011] ① STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK
[0012] ② TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK
[0013] ③ ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN
[0014] ④ GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN
[0015] ⑤ STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK
[0016] ⑥ TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK ;
[0017] 所述柔性短肽氨基酸序列如下：
[0018] GGGGS 或 GGGGSGGGGSGGGGS 或 AAY。
[0019] 为实现上述目的， 申请人:查找阅读了 HCV sequences database (http:// hepatitis, ibcp. fr.)，通过序列对比，筛选出6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原序 列。
[0020] 为了有利于多型别HVR1融合抗原基因在E. coli中获得高效的表达，本发明选择 大肠杆菌的偏好性密码子设计并合成多型别HVR1融合抗原基因。为了使获得的抗原具有 良好的生物活性，本发明在各个HVR1基因片段间加入GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY柔 性肽；为了便于基因克隆到表达载体，在融合基因两端引入BamHI和Xho I两个酶切位点， 以适合表达载体pET28a。双酶切后插入载体pET28a中，构建相应的表达质粒。构建后的表 达质粒需用PCR法鉴定，以证明多型别HVR1融合抗原基因片段已获正确插入。
[0021] 将获得的多型别HVR1融合抗原表达质粒，转化E. coli BL21后，通过IPTG诱导培 养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明多型别HVR1融合抗原已得到高效表达，再经过亲和 纯化和离子交换柱纯化，可获得高纯度的多型别HVR1融合抗原，即本发明所述的丙型肝炎 病毒第一高变区融合抗原。
[0022] 本发明所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体检 测试剂盒中的应用。
[0023] 在获得本发明所述的丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的前提下，利用该多型别 HVR1融合抗原以酶联免疫法为基础即可制作出的丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒，其 不仅可以有效的避开PCR法的弊端，同时又能够消除因 HCV在感染者体内变异造成的漏检 现象，并且具有操作简单、重复性好等特点，在临床上具有很大的应用和推广价值。
[0024] 实验结果证明，本发明提供的丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原（即多型别HVR1 融合抗原）与随机HCV感染者血清的交叉反应率高达99%。
[0025] 本发明经设计查找、筛选丙型肝炎病毒6种主要基因型的HVR1区序列，通过基因 重组的方法，将6种基因型HVR1区抗原融合成一条融合多肽，获得了一条具有覆盖HCV所 有基因型、高交叉反应的HVR1抗原。并在此基础上研制了一种基于HVR1融合抗原的检测 HVR1抗体检测试剂盒。研究证实，将6条HVR1序列通过加入柔性肽方法连接后获得的融合 抗原较单片段HVR1抗原的交叉反应性有显著提高，与丙型肝炎病毒RNA阳性患者的检出符 合率高达99%。由于HVR1是丙型肝炎病毒中的主要中和性抗原表位，因此，通过本发明抗 原的应用，对于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测，实现对HCV感染全面检测目的，以及用于HCV 疾病的转归和预后、干扰素疗效的预测等问题均可得到有效解决，具有极大的临床应用前 旦 -5^ 〇
[0026] 综上，与现有技术比，本发明技术具有以下突出特点：
[0027] (1)多型别HVR1融合抗原的筛选是通过生物信息学技术实现的
[0028] 由于HCV HRV1的变异性特别高，不可能一一对活性做出判断。本发明利用生物信 息学技术，根据HCV 6种基因型氨基酸序列同源性，对大量HVR1序列进行筛选，最终得到6 条分属于6种基因型的HVR1片段。
[0029] (2)多型别HVR1抗原融合抗原具有极高的阳性血清覆盖率
[0030] 本发明将HCV 6种基因型的具有高交叉反应性的HVR1序列，通过加入柔性肽方法 使各基因型HVR1抗原在空间上保持相对独立，最大限度保持了各基因型HVR1抗原的生物 活性，进而可以结合不同HCV基因型HCV感染者血清中的HVR1中和性抗体。在临床上适用 于检测不同HCV基因型HCV感染者筛查工作，不易造成漏检。
[0031] (3)多型别HVR1抗原融合抗原应用于丙型肝炎病毒HVR1抗体检测试剂盒的研制
[0032] 目前，我国主要采取血液筛查来达到控制HCV蔓延的目的。现行的血液检测主要 通过RT-PCR、酶联免疫法进行筛查。但由于HCV感染者存在RNA间歇阳性及早期病毒滴度 低的特点，且RT-PCR操作复杂，对样本质量要求高容易造成假阳性或假阴性结果，无法满 足大多数临床需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1 :纯化后的多型别HVR1融合抗原SDS-PAGE图
[0034] 其中：Μ为Mark，1为多型别HVR1融合抗原电泳条带。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1 :候选抗原表位的选择
[0036] 申请人:通过查找HCV sequences database (http://hepatitis, ibcp. fr.)，对HCV 6种基因型的共1700条HVR1序列进行分析，根据氨基酸序列的同源性，依次分筛选出6条 分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原序列。其中，所述6种丙型肝炎病毒HCV1?HCV6基因 型第一高变区（HVR1)抗原氨基酸序列如下 ：
[0037] ① STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK
[0038] ② TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK
[0039] ③ ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN
[0040] ④ GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN
[0041] ⑤ STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK
[0042] ⑥ TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK。
[0043] 实施例2 :多型别HVR1融合抗原即丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的克隆与表 达
[0044] 1.多型别HVR1融合抗原表达质粒的构建
[0045] 1. 1多型别HVR1融合抗原的合成及多型别HVR1融合抗原基因序列合成
[0046] 根据实施例1所述6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原氨基酸序列，委托上海 捷瑞生物工程有限公司分别合成各基因型HVR1多肽。
[0047] 利用基因重组方法，将实施例1所述6条分属于HCV 6种基因型的HVR1抗原氨基 酸序列加入柔性短肽（GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，优选GGGGSGGGGSGGGGS)使其连接 在一起（其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示），采用大肠杆菌偏好密码子，将氨基酸序列翻 译成核苷酸序列，分别在5'端和3'端引入BamHI和Xho I两个酶切位点，并委托上海捷瑞 生物工程有限公司合成上述多型别HVR1融合抗原序列的基因及本发明所述丙型肝炎病毒 第一高变区融合抗原序列的基因。
[0048] 1. 2多型别HVR1融合抗原表达质粒的构建
[0049] 1. 2. 1合成多型别HVR1融合抗原基因序列及表达载体pET28a的双酶切
[0050] 取以上合成基因产物及pET28a表达载体各30ul分别置于1. 5ml Eppendorf离心 管中，加入 10Xbuffer5ul、BamHI(10U/ul)和 Xho I(10U/ul)各 3ul，加入灭菌蒸馈水 4ul， 置37°C水浴酶切3小时。
[0051] 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：合成基因及pET28a表达载体双酶切后 产物按照TaKaRa DNA凝胶回收试剂盒产品说明书进行。
[0052] 1. 2. 2连接：于灭菌Eppendorf离心管中加入上述酶切后的载体和目的基因各 2ul、10XT4DNA Ligase buffer 2ul、T4 DNA Ligase(5U/ul)lul，加入灭菌蒸馈水至 20ul， 置16°C过夜。
[0053] 1. 2. 3转化：在超净工作台中，用无菌吸头吸取100ul感受态细胞（感受态细胞按 照《分子克隆》（科学出版社，第三版）的方法进行）悬液于Eppendorf中，加入上述连接产 物l〇ul，轻轻涡旋混匀，冰浴30分钟。立即转移到42°C水浴中放置2分钟，每管加入0. 5ml LB培养基，37°C温箱振荡培养60分钟，吸取培养液涂布与LB培养基上（含抗生素），置37°C 温箱倒置培养过夜。
[0054] 1. 2. 4阳性重组子的筛选：各挑取上述培养过夜的平皿中的单克隆菌落，接种于 5ml LB液体培养基（含抗生素）中，37°C温箱振荡培养5小时。保存各单克隆菌液并提取 质粒（按照《分子克隆》（科学出版社，第三版）的方法进行）。提取后的质粒用BamHI和 Xho I酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0055] 2多型别HVR1融合抗原的表达与纯化
[0056] 2. 1表达菌株的培养：取上述阳性表达菌株单克隆菌液20ul接种于100ml LB培养 基中，37°C温箱振荡培养过夜。次日，按照1 %接种比例转种于LB培养基，37°C温箱振荡培 养3小时，当0D_值达到0. 6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)诱导培养，终浓度lmmol/ L，37°C温箱振荡培养5小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
[0057] 2. 2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L，pH8. OTris缓冲液将沉 淀悬起，加入溶菌酶，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声破碎菌体。12000rpm，离心 10分钟，其上清，沉淀用lmol/L NaCl洗1次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M尿素 (用 20mmol/L，pH8. OTris 配制）溶解，加入 1%。DTT，于 4°C，12000rpm，离心 10 分钟，去沉 淀取上清。
[0058] 2. 3纯化：将上述包涵体溶解液过S-S印harose柱阶段梯度洗脱，用不同浓度的 NaCl (用平衡器配制）洗脱，收集0. 15M NaCl洗脱峰，再经Sephadex G50柱脱盐，收集第一 个洗脱峰。重组多型别HVR1融合抗原用SDS-PAGE鉴定。结果见图1。
[0059] 3多型别HVR1融合抗原活性鉴定
[0060] 首先将得到的HCV 1-6型基因型HVR1抗原多肽分别作活性鉴定。
[0061] 目前，我国HCV感染患者以HCV lb、HCV 2a型为主，为尽可能多的检测出HVR1抗 体，因此，初步进行HVR1抗原多肽试验组合计划是1型和2型HVR1多肽。我们用pH7. 4的 磷酸盐缓冲液分别将1型和2型HVR1多肽稀释到5. Oug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后， 对收集的50例HCV阳性血清（经HCV RNA检测确定）进行检测。结果如表1。
[0062] 结果表明，在50例样本中可以检出47例HVR1抗体阳性标本，还有3例未检出。这 说明我国HCV患者中还有其他基因型患者。单纯依靠1型和2型多肽检测容易造成漏检可 能。
[0063] 表1 :1型和2型HVR1多肽包被测定板检测血清结果
[0064]
【权利要求】
1. 一种丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原，其特征在于：所述融合抗原氨基酸序列如 SEQ ID No. 1所示，具体描述是： STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQKGGG GSGGGGSGGGGSETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQNGGGGSGGGGSGGGGSGTHVTGGKAGHTIHGFTSLFTRG SAQNGGGGSGGGGSGGGGSSTHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKGGGGSGGGGSGGGGSTTYVSGGASGFNTHVF TGIFSSGASQK。
2. 权利要求1所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原在制备丙型肝炎病毒HVR1抗体 检测试剂盒中的应用。
3. 权利要求1所述丙型肝炎病毒第一高变区融合抗原的氨基酸序列构建方法，其特征 在于：将筛选确定的如下6种丙型肝炎病毒HCV1?HCV6基因型第一高变区抗原，在其氨基 酸序列间加入柔性短肽序列，使其连接成为氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示的融合抗原；其 中， 所述6种丙型肝炎病毒HCV1?HCV6基因型第一高变区抗原氨基酸序列如下： ① STYATGGAAGRETSTWAGLFNPGAAQK ② TTYTTAGSAARATYTLTSLFKTGPKQK ③ ETHVTGGTAAHGALGITSLLSRGPKQN ④ GTHVTGGKAG HTIHGFTSLFTRGSAQN ⑤ STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK ⑥ TTYVSGGASG FNTHVFTGIF SSGASQK ; 所述柔性短肽氨基酸序列如下： GGGGS 或 GGGGSGGGGSGGGGS 或 AAY。
【文档编号】G01N33/576GK104193827SQ201410439852
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】陈振, 丁兆明, 王岩, 欧兰香, 王佳颖, 寇宗阳, 丁兴龙, 王恒, 朱之炜 申请人:山东莱博生物科技有限公司