本发明涉及中药材指纹图谱的构建方法，尤其是涉及化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法及利用指纹图谱鉴别化橘红种类的方法。
背景技术：
：：化橘红，即化州橘红，是芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮。前者习称“毛橘红”，后者习称“光七爪”“光五爪”。是在夏季果实还没有成熟时采收，放置于开水中略烫后，将果皮剥下，除去中果皮，割成5～7瓣，去除掉果瓤后，将其压制成形并干燥。主要种植于丘陵地带。主产于广东、广西、四川、湖南、湖北、浙江等地，医药著作记载的化橘红是指化州当地所产的橘红。2016年5月，化橘红入选广东岭南中药材第一批立法保护品种，被评为为“中国四大南药”和“十大广药”之一。不同种类的化橘红有效成分含量不一样，功效也就不一样，并且在价格上也相差较远，以正毛化橘红效果最佳。目前我国市场上化橘红的质量混乱，产地信息不明，以假充真、以次充好的现象普遍存在，很多不良商家为了谋取暴利，用光橘红、橘红或者副毛化橘红冒充正毛化橘红，不仅损害了消费者利益，让许多不懂得辨别化橘红的消费者上当受骗，也损害了种植优良品种的农民们的利益。现在对化橘红种类的鉴别主要依靠外观加以判断，存在很大的主观性，缺乏系统、科学、有效的鉴别方法。技术实现要素：有鉴于此，有必要针对上述化橘红种类依靠外观鉴别判断，而存在主观性大，缺乏系统、科学、有效的鉴别方法的问题；提供一种化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法以及化橘红种类的鉴别方法。本发明一种化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：1)供试品的制备：精密称取化橘红样品，采用固相微萃取方法提取挥发性成分；2)指纹图谱的测定：将已吸附挥发性成分的固相微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪，测定，即得到化橘红挥发性成分的指纹图谱；所述采用固相微萃取方法提取挥发性成分的过程中，挥发性成分被固相微萃取头吸附前，样品加热的条件恒定，加热温度为40～90℃，加热时间为10～30min；挥发性成分被固相微萃取头吸附时，吸附条件恒定，吸附温度为40～90℃，吸附时间为10～30min；所述气相色谱-质谱联用仪中气相色谱的测定条件为：色谱柱为毛细管柱；采用分流或不分流方式进样；进样口温度为200～280℃；载气为高纯氮气，流量为0.5～3.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度为40～80℃，保持0～10min，于5～60min内程序升温至210～280℃，保持0～20min。在其一个实施例中，所述气相色谱-质谱联用仪中气相色谱的测定条件中，程序升温方式为：初始温度为45～60℃，保持1～5min；以2～5℃/min速度升温至140～180℃，保持1～5min；以5～10℃/min速度升温至220～260℃，保持3～10min。在其一个实施例中，所述气相色谱-质谱联用仪的测定条件为：气相色谱的测定条件为：色谱柱为rtx-1ms石英毛细管柱或rtx-5ms系列石英毛细管柱；采用不分流方式进样；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气，流量1.0～2.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度50℃，保持1min；以3℃/min速度升温至150℃，保持3min；以5℃/min速度升温至240℃，保持5min；质谱的测定条件为：采用的离子源为ei，离子源温度为220～250℃，接口温度为250℃，质量扫描范围为35～500amu，采集方式为scan。在其一个实施例中，所述固相微萃取头为carboxen/pdms固相微萃取头、pdms固相微萃取头、pdms/dvb固相微萃取头、polyacrylate固相微萃取头、dvb/car/pdmsstableflex固相微萃取头、dvb/caronpdms固相微萃取头中的一种。在其一个实施例中，所述化橘红样品为化橘红粉末、化橘红切片或化橘红饮片。本发明一种化橘红种类的鉴别方法，包括以下步骤：1)化橘红指纹图谱的构建a)各种类的化橘红挥发性成分的制备：精密称取各种类的化橘红样品，采用固相微萃取方法分别提取各种类的化橘红的挥发性成分；b)各种类的化橘红挥发性成分的指纹图谱的测定：分别将已吸附各种类的化橘红的挥发性成分的固相微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪，测定，即得到各种类的化橘红挥发性成分的指纹图谱；c)将各种类的化橘红挥发性成分的指纹图谱导入《中国药典》中的中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行处理，构建各种类的化橘红的指纹图谱；2)供试品的制备：精密称取待鉴别的化橘红样品，采用固相微萃取方法提取挥发性成分；3)供试品指纹图谱的测定：将已吸附待鉴别的化橘红样品的挥发性成分的固相微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪，测定，即得到待鉴别的化橘红样品的挥发性成分的指纹图谱；4)鉴别判断：将待鉴别的化橘红样品的挥发性成分的指纹图谱与各种类化橘红指纹图谱比较，选择相关系数不小于0.9且最大的，即为对应种类的化橘红。所述采用固相微萃取方法提取挥发性成分的过程中，挥发性成分被固相微萃取头吸附前，样品加热的条件恒定，加热温度为40～90℃，加热时间为10～30min；挥发性成分被固相微萃取头吸附时，吸附条件恒定，吸附温度为40～90℃，吸附时间为10～30min；所述气相色谱-质谱联用仪中气相色谱的测定条件为：色谱柱为毛细管柱；采用分流或不分流方式进样；进样口温度为200～280℃；载气为高纯氮气，流量为0.5～3.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度为40～80℃，保持0～10min，于5～60min内程序升温至210～280℃，保持0～20min。在其一个实施例中，所述气相色谱-质谱联用仪中气相色谱的测定条件中，程序升温方式为：初始温度为45～60℃，保持1～5min；以2～5℃/min速度升温至140～180℃，保持1～5min；以5～10℃/min速度升温至220～260℃，保持3～10min。在其一个实施例中，所述气相色谱-质谱联用仪的测定条件为：气相色谱的测定条件为：色谱柱为rtx-1ms石英毛细管柱或rtx-5ms系列石英毛细管柱；采用不分流方式进样；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气，流量1.0～2.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度50℃，保持1min；以3℃/min速度升温至150℃，保持3min；以5℃/min速度升温至240℃，保持5min；质谱的测定条件为：采用的离子源为ei，离子源温度为220～250℃，接口温度为250℃，质量扫描范围为35～500amu，采集方式为scan。在其一个实施例中，所述固相微萃取头为carboxen/pdms固相微萃取头、pdms固相微萃取头、pdms/dvb固相微萃取头、polyacrylate固相微萃取头、dvb/car/pdmsstableflex固相微萃取头、dvb/caronpdms固相微萃取头中的一种。在其一个实施例中，所述化橘红样品为化橘红粉末、化橘红切片或化橘红饮片。相对现有技术，本发明具备以下有益效果：1、本发明化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法中，对固相微萃取的条件、相色谱-质谱联用仪的测定条件进行优化，使获得的指纹图谱准确性高。2、通过本发明化橘红种类的鉴别方法，可以简单、快速、系统、准确、客观地鉴别化橘红种类。附图说明图1为本发明一实施例正毛化橘红挥发性成分的指纹图谱(5～10min)；图2为本发明一实施例副毛化橘红挥发性成分的指纹图谱(5～10min)；图3为本发明一实施例无毛化橘红挥发性成分的指纹图谱(5～10min)。具体实施方式为了便于本领域技术人员理解，下面将具体实施例对本发明化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法及化橘红种类的鉴别方法进行进一步描述。实施例一：正毛化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法1仪器及试药1.1仪器岛津gcms-qp2010ultra气相色谱-质谱联用仪，rtx-1ms(30m×0.25mm，0.25μm)石英毛细管柱。1.2试药正毛化橘红10批次2方法与结果2.1供试品的制备精密称取适量样品，如0.50g，将样品打成粉末状，置于专用的固相微萃取瓶中，密封；对样品进行加热，加热温度为80℃，加热时间为30min；待固相微萃取瓶中样品温度恒定后，将固相微萃取头(50/30um,dvb/car/pdms,stableflex固相微萃取头)插入固相微萃取瓶中，吸附温度为80℃，吸附时间为30min。2.2指纹图谱的测定将已吸附挥发性成分的固相微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，测定，即得到化橘红挥发性成分的指纹图谱。气相色谱-质谱联用仪的测定条件为：气相色谱的测定条件为：色谱柱为rtx-1ms石英毛细管柱；采用不分流方式进样；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气，流量1.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度50℃，保持1min；以3℃/min速度升温至150℃，保持3min；以5℃/min速度升温至240℃，保持5min；质谱的测定条件为：采用的离子源为ei，离子源温度为220℃，接口温度为250℃，质量扫描范围为35～500amu，采集方式为scan。2.3指纹图谱的构建将上述测定的10批次正毛化橘红样品的挥发性成分的指纹图谱导入《中国药典》中的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行处理，构建正毛化橘红的标准指纹图谱，结果参见图1。实施例二:副毛化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法1.1仪器岛津gcms-qp2010ultra气相色谱-质谱联用仪，rtx-1ms(30m×0.25mm，0.25μm)石英毛细管柱。1.2试药副毛化橘红10批次2方法与结果采用与实施例一相同的构建方法构建副毛化橘红的标准指纹图谱，结果参见图2。实施例三：无毛化橘红挥发性成分指纹图谱的构建方法1.1仪器岛津gcms-qp2010ultra气相色谱-质谱联用仪，rtx-1ms(30m×0.25mm，0.25μm)石英毛细管柱。1.2试药无毛化橘红10批次2方法与结果采用与实施例一相同的构建方法构建无毛化橘红的标准指纹图谱，结果参见图3。实施例四：未知种类的化橘红种类的鉴别方法1仪器及试药1.1仪器岛津gcms-qp2010ultra气相色谱-质谱联用仪，rtx-1ms(30m×0.25mm，0.25μm)石英毛细管柱。1.2试药未知种类的化橘红2方法与结果2.1供试品的制备精密称取适量样品，如0.50g，将样品打成粉末状，置于专用的固相微萃取瓶中，密封；对样品进行加热，加热温度为80℃，加热时间为30min；待固相微萃取瓶中样品温度恒定后，将固相微萃取头(50/30um,dvb/car/pdms,stableflex固相微萃取头)插入固相微萃取瓶中，吸附温度为80℃，吸附时间为30min。2.2指纹图谱的测定将已吸附挥发性成分的固相微萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样口，测定，即得到化橘红挥发性成分的指纹图谱。气相色谱-质谱联用仪的测定条件为：气相色谱的测定条件为：色谱柱为rtx-1ms石英毛细管柱；采用不分流方式进样；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气，流量1.0ml/min；采用程序升温方式：初始温度50℃，保持1min；以3℃/min速度升温至150℃，保持3min；以5℃/min速度升温至240℃，保持5min；质谱的测定条件为：采用的离子源为ei，离子源温度为220℃，接口温度为250℃，质量扫描范围为35～500amu，采集方式为scan。2.3鉴别判断将该未知种类的化橘红样品的挥发性成分的指纹图谱与实施例一、二、三所构建的正毛化橘红、副毛化橘红、无毛化橘红的标准指纹图谱比较，选择相关系数不小于0.9且最大的，即为对应种类的化橘红。以上所述实施例仅表达了本发明的部分实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，如固相微萃取头采用carboxen/pdms固相微萃取头、pdms固相微萃取头、pdms/dvb固相微萃取头、polyacrylate固相微萃取头dvb/caronpdms固相微萃取头中的一种，气相色谱的测定采用分流方式进样，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12当前第1页12