选是化合物A)的治疗获益。这患者响应的可能性为最 高。出于相同原因，也可治疗罹患其他肿瘤类型的患者，只要相较于对照组在其癌症样本中 选自表1的生物标记物的差异性表达下调。一旦开始Wnt抑制剂治疗，则抑制剂的有效性可 通过Axin2、LEFl和/或NKDl的差异性表达与对Wnt抑制剂敏感的癌症样本中的表达的比 较监测。通常，如果Wnt抑制剂有效，则Axin2、LEFl和/或NKDl的表达达成下调。Axin2、 LEFl和/或NKDl的不足的下调表达指示需要调整剂量，或可必需将Wnt抑制剂与另一种抗 肿瘤药剂组合。
[0219] 基因表达的测量
[0220] 基因表达的检测可通过任何适宜方法进行，包括（例如）检测由基因转录的mRNA 的量或由自基因转录的mRNA的逆转录所产生的cDNA的量或由基因编码的多肽或蛋白质 的量。这些方法可在样本上通过样本基础地或经改动达成高通量的分析进行。例如，使用 Affymetrix? U133 微阵列芯片。
[0221] 在一个方面，基因表达通过与会与该生物标记物的适宜探针特异性杂交的探针杂 交来检测并定量化。也可利用本领域中已知的方法将这些探针附着至用于高通量筛选试 验中的固体载体。例如，WO 97/10365和美国专利案第5, 405, 783号、第5, 412, 087号和第 5, 445, 934号公开可包含一或多种本文所公开序列的高密度寡核苷酸芯片的构造。利用公 开于美国专利案第5, 405, 783号、第5, 412, 087号和第5, 445, 934号中的方法，在衍生的玻 璃表面上合成本发明的探针。经光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，选择性地通过光 解经由光刻遮罩去除保护，并与第二个经保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去除保护 过程直到完成期望的探针。
[0222] 在一个方面，基因的表达水平是通过使核酸样本暴露于探针修饰芯片来确定。提 取的核酸是例如通过萤光标签优选在扩增步骤中进行标记。经标记样本的杂交适宜以严苛 水平进行。使用检测装置定量地测定探针-核酸杂交的程度。参见美国专利案第5, 578, 832 号和第5, 631，734号。
[0223] 或者，可利用已知的技术测定基因拷贝数、转录或翻译中的任何一者。例如PCR 的扩增方法可能是有用的。PCR的一般程序教示于MacPherson等人，PCR:A Practical Appr〇ach(牛津大学出版社下的IRL出版社（1991))中。然而，用于各应用反应的PCR条件 是以经验方式确定。许多参数会影响反应的成功。其中包括退火温度及时间、延伸时间、Mg2+和/或ATP浓度、pH以及引物、模板和脱氧核糖核苷酸的相对浓度。在扩增之后，可通过琼 脂糖凝胶电泳，接着利用溴化乙锭染色剂和紫外光照射进行目测，以检测所得DNA片段。
[0224] 在一个实施方式中，通过检测一或多个附着至样本核酸的标记来检测经杂交的核 酸。这些标记可依本领域技术人员所熟知的多种方法中的任一种并入。然而，在一个方面 中，标记是在制备样本核酸的扩增步骤期间同时地并入。因此，例如，利用经标记物引物或 经标记核苷酸的聚合酶链反应（PCR)将提供经标记扩增产物。在另一个实施方式中，如上 所述使用经标记核苷酸（例如萤光素标记的UTP和/或CTP)的转录扩增可将标记并入至 经转录的核酸中。
[0225] 或者，标记可直接地添加到初始核酸样本（例如，mRNA、polyA、mRNA、cDNA等）或 可在完成扩增之后添加到扩增产物。将标记附着至核酸的方法是本领域技术人员所熟知的 且包括（例如）缺口平移或末端标记（例如利用经标记的RNA)，其是通过激酶化核酸且在 随后进行接合样本核酸与标记（例如，萤光团）的核酸连接子的附着（连接）。
[0226] 适用于本发明的可检测标记包括可通过光谱方法、光化学方法、生物化学方法、免 疫化学方法、电方法、光学方法或化学方法检测的任何组合物。在本发明中的有用的标记包 括用于利用经标记的链霉亲和素共辄物染色的生物素、磁性珠粒（例如，Dynabeads?)、萤 光染料（例如，萤光素、德克萨斯红（texas red)、玫瑰红、绿色萤光蛋白质、等）、放射性标 记（例如，3H、125I、35S、14C、或 32P)、酶（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用于ELISA 中的其他酶）、和热量标记（例如胶态金或有色玻璃或塑料（例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶 等）珠粒）。教导这些标记的用途的专利案包括美国专利案第3, 817, 837号；第3, 850, 752 号；第 3, 939, 350 号；第 3, 996, 345 号；第 4, 277, 437 号；第 4, 275, 149 号；和第 4, 366, 241 号。
[0227] 本领域技术人员熟知标记的检测。因此，例如，可使用照相软片或闪烁计数器检测 放射性标记，可使用检测发射光的光检测器检测萤光标记物。通常通过提供具有底物的酶 和检测由酶对底物作用所产生的反应产物检测酶标记，并通过简单地观察有色标记检测热 量标记。
[0228] 可检测的标记可在杂交之前或之后被添加至靶（样本）核酸，正如WO 97/10365 中所述。这些可检测标记是在杂交之前直接附着或并入到靶（样本）核酸。相反地，"间 接标记"是在杂交之后接合至杂交双螺旋。一般而言，间接标记是附着到已在杂交之前附 着至靶核酸的结合部分。例如，靶核酸可在杂交之前生物素化。在杂交之后，与抗生物素蛋 白（avidin)共辄的萤光团将会结合带有提供容易检测到的标记的杂交双螺旋的生物素。 关于标记核酸和检测经标记杂交核酸的方法的详细评论，请参见Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第 24 卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，P. Ti jssen 编辑 Elsevier，纽约（1993)。
[0229] 多肽的检测
[0230] 生物标记物的表达水平也可通过检测至少一种选自表1的生物标记物的蛋白质 表达或蛋白质产物来确定。蛋白含量的确定涉及测量发生在可选择性地识别和结合获自患 者的样本中生物标记物的多肽的抗体间的任何免疫特异性结合的量和比较该量与对照组 样本中至少一种生物标记物的免疫特异性结合的量。该生物标记物的蛋白质表达的量相较 对照组表达可能增加或减少。或者，可分析超过一种选自表1的生物标记物的组合。
[0231] 在蛋白质分析领域中有多种技术可用。那些包括但不限于放射免疫测定、 ELISA(酶联免疫吸附测定）、"夹心"免疫测定、免疫放射量测定、原位免疫测定（使用例如 胶态金、酶或放射性同位素标记）、西方墨点分析、免疫沉淀测定、免疫萤光测定、流式细胞 计数法、免疫组织化学、共焦显微镜法、酶测定、表面等离波子共振和PAGE-SDS。
[0232] 生物标记物的检测和Wnt抑制剂的治疗
[0233] 一旦已经预测患者对Wnt抑制剂敏感，则可在整个治疗过程中以一次给药、连续 或断续地实施向患者施用任何Wnt抑制剂。确定最有效的施用装置和剂量的方法为本领域 普通技术人员所熟知且随用于治疗的组合物、治疗的目的、进行治疗的靶细胞和进行治疗 的个体而改变。单一或多次施用可以根据治疗医师所选剂量和方式进行。可凭经验调整适 宜的剂量配方和施用药剂的方法。
[0234] 可在施用Wnt抑制剂之后检测至少一种选自表1的生物标记物以确定患者是否仍 旧对Wnt抑制剂的治疗敏感。此外，可在单次施用抑制剂之后的多个时间点检测至少一种 生物标记物。例如，施用初始一丸Wnt抑制剂，在首次治疗后1小时、2小时、3小时、4小时、 8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或数个月检测至少一种生物标记物。或 者，超过一种（例如2种、3种、4种、5种或所有）选自表1的生物标记物可一起检测。
[0235] 可在每次施用Wnt抑制剂之后检测该至少一种选自表1的生物标记物，因此，若存 在Wnt抑制剂的多次施用，则可在每次施用之后检测该至少一种生物标记物以确定持续的 患者敏感性。患者会经历Wnt抑制剂的多次施用以及接着在不同时间点检测这些生物标记 物。例如，治疗过程可能需要施用初始剂量、经过特定时段后的第二剂量和再在第二次给药 数小时后的第三剂量的Wnt抑制剂。可在施用各剂量的Wnt抑制剂后1小时、2小时、3小 时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或数个月检测至少一种生物 标记物。或者，超过一种（例如2种、3种、4种、5种或所有）选自表1的生物标记物可一起 进行检测。
[0236] 本发明范畴中也包括在不同时间点检测不同生物标记物。在不受任一理论约束 下，归因于Wnt抑制剂或生物标记物的作用机制，对Wnt抑制剂的响应延迟并在施用后的任 何时间检测至少一种生物标记物以确定患者是否仍旧对药物的施用敏感。在每次施用Wnt 抑制剂后对至少一种选自表1的生物标记物的检测将提供关于方法、剂量和治疗过程的指 导。
[0237] 最后，存在施用不同Wnt抑制剂并接着检测至少一种选自表1的生物标记物。在 该实施方式中，超过一种Wnt抑制剂被选择并施用给该患者。可接着在施用每次不同的Wnt 抑制剂之后检测至少一种选自表1的生物标记物。如上述，该试验也可在施用不同Wnt抑 制剂后的多个时间点进行。例如，可施用第一 Wnt抑制剂给患者并在施用后1小时、2小时、 3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或数个月检测至少一种 生物标记物。可接着施用第二抑制剂并再次在施用第二Wnt抑制剂后1小时、2小时、3小 时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或数个月检测至少一种生物 标记物。或者，超过一种（例如2种、3种、4种、5种或所有）选自表1的生物标记物可一起 进行检测。
[0238] 本发明的另一个方面提供一种评估Wnt抑制剂的适宜剂量水平的方法，该方法包 括在施用Wnt抑制剂之后监测至少一种生物标记物的差异性表达。例如，在施用第一丸Wnt 抑制剂之后，分析至少一种生物标记物并基于该结果建议增加或减少Wnt抑制剂剂量。在 施用经调整剂量的Wnt抑制剂之后，至少一种生物标记物的分析将可确定患者是否仍旧对 经调整的剂量敏感以及该经调整的剂量是否提供预期的效果，例如，抑制肿瘤生长。或者， 超过一种（例如2种、3种、4种、5种或所有）选自表1的生物标记物可一起进行检测，以评 估对Wnt抑制剂的剂量的敏感性。
[0239] 在评估最初具敏感性的肿瘤中Wnt抑制剂的延时效力的所有实施方式的替代实 施方式中，可将NKD1、LEFl和/或Axin2的差异性表达与敏感性肿瘤样本中的表达进行比 较。敏感性肿瘤样本也定义为通过50nM化合物A的治疗48小时时显示Axin2减少（Wnt 路径抑制）大于50 %的肿瘤。
[0240] 可制得用于评估任何Wnt抑制剂的活性的试剂盒。例如，包括用于选自表1的生 物标记物的PCR或微阵列杂交的核酸引物的试剂盒可用于评估对Wnt抑制剂的敏感性。或 者，与用于至少一种生物标记物的抗体一起提供的试剂盒可适用于检测对Wnt抑制剂的敏 感性。
[0241] 本领域中熟知癌症可变为抗化疗治疗，尤其在该治疗为长期的情况下。至少一种 选自表1的生物标记物的差异性表达的检测可在利用任何化疗剂的长期治疗之后进行，以 确定癌症是否对Wnt抑制剂敏感。若患者先前已经经另一种化疗剂或另一种Wnt抑制剂治 疗，则这就是患者检测至少一种选自表1的生物标记物以确定肿瘤是否对Wnt抑制剂敏感 的有用信息。该检测可尤其有益于患者，如果其癌症经历缓解且接着再生长或已转移至不 同部位。
[0242] 对Wnt抑制剂的筛选
[0243] 可检测至少一种选自表1的生物标记物以筛选其他Wnt抑制剂。该方法包括检测 具有至少一种生物标记物的细胞，预测若细胞对候选Wnt抑制剂敏感，则接着使该细胞与 该候选Wnt抑制剂接触和比较经处理的细胞的IC5。与接触敏感性细胞的已知Wnt抑制剂。 例如，就预测为如通过至少一种生物标记物的差异性表达所确定的对任何Wnt抑制剂敏感 的细胞而言，候选Wnt抑制剂将具有ICmS 3 μ M。至少一种生物标记物表达的测量可通过 上述方法（例如PCR或微阵列分析）进行。或者，可基于这目的检测超过一种的生物标记 物的组合。
[0244] 表 1
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[0247] 实施例
[0248] 实施例1 :化合物A和化合物B (分别为图IA和1B)为生化和细胞检测中的有效 PORCN抑制剂。
[0249] 放射性配体结合检测：膜制备：使用Fugene 6 (Roche)，利用带有人类PORCN的 pcDNA 3. 1结构（Invitrogen)转染约IO8个293细胞。在48小时后，通过在PBS中刮削来 收获细胞，以1，〇〇〇 Xg离心10分钟。对缓冲液吸气。在干冰浴中冷冻细胞小球，接着轻柔 地再悬浮于IOml含有无 EDTA蛋白酶抑制剂混合物的50mM Tris pH 7. 5、250mM蔗糖缓冲 液（Sigma)中。使用polytron(Brinkman)裂解细胞。在4°C以l，600Xg将裂解细胞离心 20分钟，转移上清液并在4°C下在SS34转子中以20, OOOrpm离心20分钟。弃置上清液，使 用三个利用Polytron的10秒脉冲，将这些小球再悬浮于10%鹿糖、50mM Tris pH 7. 5、5mM MgCl2UmM EDTA 溶液中。
[0250] 化合物B的放射性配体标记物：化合物C，其结构列于下方， CN 105190313 A 说明书 23/29 页
[0252] 经由由AmBioslabs进行的氢化反应放射性标记化合物C，以制得3H-放射性标记 物的化合物B。
[0253] 放射性配体结合检测：利用上述膜制剂，如下进行过滤结合检测。为减低非特异性 结合，如制造商建议利用〇. 1 % BSA预涂覆96孔过滤盘（PerkinElmer)且接着利用0. 1 % BSA洗涤四次。在室温下，在聚丙烯96孔盘中，结合缓冲液（50mM Tris pH 7. 5、5mM MgCl2、 ImM EDTA、0.1%牛血清白蛋白）加上无 EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Sigma)中在存在或 不存在化合物A下，利用6. 6nM3H-化合物B以150 μ 1的最终体积培养膜制剂（50 μ g总 蛋白质）3小时。接着将结合反应混合物转移至经预涂覆的96孔过滤盘（PerkinElmer)， 使用96-针FilterMate收获器（PerkinElmer)过滤和洗涤。使用微盘闪烁计数器 TopCount(PerkinElmer)获得放射性信号。通过TopCount (PerkinElmer)测定放射性配体 PORCN结合活性。利用Prism进行曲线拟合。
[0254] 如图2A所显示，经氣标记的化合物B大量地结合至自经PORCN转染的293细胞 的膜制剂而不结合至自无 Wnt或载体对照组转染细胞的那些，这表明化合物B特异性地与 PORCN相互作用。另外，化合物B和PORCN之间的特异性相互作用可被未经标记的化合物B 竞争消除（图2A)。化合物B结合至PORCN和充当体外生物化学PORCN结合检测中用于与 冷测试化合物竞争的热放射性配体。在使用3H-化合物B的与PORCN的放射性配体结合检 测中，化合物A显示InM的IC5。（图2B)。
[0255] 实施例2 :通过化合物A抑制PORCN阻断体外Wnt信号传导
[0256] 报告基因检测：在37°C与5% CO2的空气氛围中，将小鼠睾丸间质（Leydig)细胞 TM3细胞（获自美国菌种培养物收集中心（American Type Culture Collection)，ATCC， 维吉尼亚州马纳萨斯）培养于补充2· 5% FBS(Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）和 5%马血清（Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）、50单位/mL青霉素和50 μ g/mL链霉素 (Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）的汉姆氏（Ham' s)F12培养基和杜贝卡氏改良依格 培养基（Dulbecco, s modified Eagle's medium) (Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德） 的1:1混合物中。在IOcm培养皿中的TM3细胞是遵循制造商协定，通过8 μ g的包含由 Wnt响应性元素所驱动的萤光素酶基因的STF-报告子质粒和2 μ g pcDNA3. I-Neo (Gibco/ Invitrogen，加州卡尔斯巴德）与30yL FuGENE6(Roche Diagnostics，印弟安纳州印弟 安纳波里斯）共转染。通过400 yg/mL G418(Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）筛选 稳定细胞系（TM3Wnt-Luc)。在37°C与5% CO2的空气氛围中，将TM3Wnt-Luc细胞和L-细 胞Wnt3A细胞（获自美国菌种培养物收集中心，ATCC，维吉尼亚州马纳萨斯）培养于补充 10% FBS (Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）和50单位/mL青霉素和50 μ g/mL链霉素 (Gibco/Invitrogen，加州卡尔斯巴德）的杜贝卡氏改良依格培养基（Gibco/Invitrogen， 加州卡尔斯巴德）中，是经胰蛋白酶化和共培养于含补充2% FBS的DMEM培养基的384孔 盘中，和通过不同浓度的本发明化合物处理。在24小时后，通过Bright-Glo?萤光素酶检 测系统（Promega，威斯康辛州麦迪逊）检测萤火虫萤光素酶活性。当在化合物的效应使得 发光信号减少50%时，测得IC5。。
[0257] 化合物A有效地抑制Wnt共培养检测中的Wnt信号传导，IC5。为0. 4nM(图3A)。 该抑制效应是通过添加经过外源Wnt3A调节的培养基恢复（图3B)。为进一步证实其在 PORCN依赖性Wnt分泌中的功能，通过HA标记物的Wnt3a (HA-Wnt3A)转染293A细胞和利用 多种剂量的化合物A处理。如图4所显示，化合物A有效地减低上清液中HA-Wnt3A的丰度 同时保留溶胞产物HA-Wnt3A，这表明Wnt3A分泌实质上是以剂量依赖性方式受化合物A抑 制。所分泌的Wnt在随后作用于Wnt接收细胞，这导致Wnt共报告子LRP6的磷酸化。使用 自分泌L-Wnt3A细胞（一种过度表达Wnt3A的小鼠乳腺细胞系），我们证实化合物A实际上 强烈地阻断LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白质6)的Wnt依赖性磷酸化（图5A)。据报 告PORCN会影响泛-Wnt翻译后棕榈酰基化17 18。在推定Wnt棕榈酰基化位点Ser209周围 的残基保留于所有19种Wnt当中（图5B)，且在整个蛋白质组的任何其他蛋白质中未识别 出CHGxSGSC棕榈酰基化基元。为测试化合物A是否可从基因方面概括PORCN的损失的结 果，我们在Wnt依赖性STF报告子检测中专注于一组典型的Wnt，包括Wntl、2、3、3A、6、7A、 和9A。如图5C所显示，化合物A证实对所有测试Wnt的相当的抑制活性，这点与PORCN表 达型的损失一致。另外，化合物A直至20 μ M时未在细胞中显示明显细胞毒性。
[0258] 实施例3 :人头颈癌细胞系中Wnt抑制剂的细胞功能性效应
[0259] 为识别出响应豪猪抑制的人癌细胞系，我们使用ΑΧΙΝ2的mRNA表达水平作为读 出，对超过300种细胞系进行特征分析。在37°C与5% 0)2下的增湿培养箱中培养所有细 胞系。HN30细胞（韦恩州立大学（Wayne State University))和UMSCC细胞（密歇根大 学（University of Michigan))是衍生自人头颈鳞状细胞癌（HNSCC)患者肿瘤样本。分别 地，依照制造商指令，使用Qiagen RNeasy和DNeasy血液和组织试剂盒分离总RNA或DNA0简而言之，通过添加缓冲剂RLT破坏细胞和使用QIAshredder旋转管柱均质化。在添加一 体积70%乙醇至均质化溶胞产物和彻底混合之后，将这些样本转移至RNeasy旋转管柱。在 离心之后弃置溢流。在利用缓冲剂RWl和缓冲剂RPE洗涤RNeasy旋转管柱两次之后，通过 利用无 RNA酶水洗脱RNeasy旋转管柱以收集RNA样本。对于TaqMan检测，每孔2 X IO6个 细胞接种于6孔细胞培养盘中且以5 μΜ作为最高