amine)、TMB (四甲基耳关苯胺，tetramethylbenzidine)。
[0080]与此同时，也可以进一步包含能够检测上述抗体或核酸适配子的二次抗体，并且可使用通过荧光物质和放射性同位素等标记的二次抗体。
[0081]这种本发明的试剂盒具有如下优点:可通过从1至50 μ 1优选地从10 μ 1的少量尿液中检测出初级纤毛，来诊断肾脏疾病。
[0082]本发明的试剂盒可进一步包含用于将从肾脏组织分离出的初级纤毛或其基体分解为组成该初级纤毛其基体的蛋白质的处理剂。
[0083]作为又一方式，本发明提供一种用于检测从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的方法，该方法包括以下步骤:在分离出的尿液样本中确认初级纤毛或其组成成分或者初级纤毛基体或其组成成分的存在与否。
[0084]关于上述初级纤毛、其基体及其组成成分，与上述所说明的内容相同。
[0085]关于从分离出的尿液样品中检测初级纤毛、其基体或/和其组成成分的存在与否，可使用特异性地检测这些的制剂或用于分离初级纤毛或其基体的衬底和与初级纤毛或其基体结合的染料等来执行，但不限于此。
[0086]在上述步骤之前，可进一步包括以下步骤:利用将上述初级纤毛分解为组成该初级纤毛的蛋白质的处理剂对分离出的尿液样本进行处理。
[0087]作为又一方式，本发明提供一种肾脏疾病的发病或经过的诊断方法，该方法包括以下步骤:在分离出的尿液样本中确认从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的存在与否、浓度或初级纤毛长度。
[0088]关于上述初级纤毛、其基体及其组成成分，与上述所说明的内容相同。
[0089]此外，也可以利用肾脏疾病的发病或其经过的诊断方法判断肾脏疾病治疗效果及预后效果。
[0090]具体来讲，上述方法从分离出的尿液样本中确认初级纤毛、其基体或者乙酰化微管蛋白或Arll3b的存在与否，如果样本中存在初级纤毛、其基体或者乙酰化微管蛋白或Arll3b，则可判定为肾脏存在异常和肾脏疾病发病，并且在(a)从正常人排泄的尿液和检测对象个体排泄的尿液中检测初级纤毛或其基体的步骤及(b)将上述正常人排泄的尿液中检测到的初级纤毛或其基体的水平与从检测对象个体的尿液中检测到的初级纤毛进行比较，从检测对象个体尿液中检测到的初级纤毛或其基体的水平比从正常人尿液中检测到的初级纤毛或其基体的水平明显增加的情况下，也可以判定为肾脏疾病发病。
[0091]此外，通过从上述分离出的尿液样本中测定初级纤毛、其基体或其组成成分(例如，乙酰化微管蛋白或Arl 13b)的含量、浓度或初级纤毛的长度，从而也可以根据含量增加程度及组成该初级纤毛、其基体的蛋白质浓度判定肾脏疾病的进行程度(图5)。
[0092]此时，上述初级纤毛或其基体可通过多种方法来检测到，也可以使用通过将尿液样本直接应用于显微镜等单元来确认包含在该尿液样本内的初级纤毛或其基体的方法，或者对上述尿液样本进行过滤及浓缩之后，通过显微镜等单元确认包含在该尿液样本中的初级纤毛或其断片的方法，还可以使用通过蛋白质水平确认上述初级纤毛或其基体的标记来检测出初级纤毛或其基体的方法。通过蛋白质水平确认上述标记的方法与上述所说明的内容相同。
[0093]上述确认步骤可以是如下步骤:通过对特异性地检测从肾脏组织分离出的初级纤毛或其基体的制剂或特异性地检测该初级纤毛或其基体的组成成分(例如，乙酰化微管蛋白(acetylated a -tubulin)或Arll3)的制剂进行处理，来确认其存在与否、浓度或初级纤毛的长度。
[0094]本发明的诊断方法在上述步骤之前，可进一步包括以下步骤:利用将上述初级纤毛分解为组成该初级纤毛的蛋白质的处理剂对分离出的尿液样本进行处理。
[0095]此外，本发明可通过调查初级纤毛及初级纤毛基体的量变情况，来诊断疾病的强度及经过。
[0096]下面，通过下述例进一步详细说明本发明。但是，下述例仅用于示意性地说明本发明，本发明的范围并不限于下述例。
[0097]实施例1:试验材料及方法
[0098](1)试验动物
[0099]使用8周龄的C57B/6鼷鼠进行了试验，并且在进行缺血/再灌注(ischemia/reperfus1n)或假手术(sham)之前，通过注射麻醉剂(pentobarbital sodium 60mg/kg body wt，戊巴比妥钠，60mg/kg体重)来使其麻醉。根据公知方法，肾脏的缺血通过使用非外伤性显微夹(Roboz, Rockville, MD)堵住血管丛(renal pedicle) 30分钟来执行(Park KM, Chen A, and Bonventre JV., The Journal of b1logicalchemistry 276:11870-11876，2001) 0 从诱发缺血(ischemia)之后经过 48 小时的时间点至用于试验的24小时之前，对于鼷鼠组向腹腔内每日给药作为发挥superoxidedismutase (SOD,超氧化物歧化酶)效果的抗氧化剂猛(III)(四(1_甲基_4_ P比啶基)卩卜啉，Tetrakis (l-methyl-4-pyridyl)porphyrin, 5mg/kg Bff)及 0.9%生理盐水。此外，对于这些鼷鼠中的部分鼷鼠，在使用于试验前20小时，向腹腔给药5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5，-bromo-2’ -deoxyuridine，BrdU, 50mg/kg Bff)。为了诱发糖尿病肾病，向鼷鼠连续 5 天每日给药一次链脲霉素(streptozotocin, 55mg/kg Bff)，并且血糖的增加通过测定血液中的葡萄糖(glucose)浓度来确认。关于糖尿病肾病的诱发与否，通过使用库玛西染色来确认尿液中蛋白质即蛋白尿的存在与否。尿液中的初级纤毛的存在通过有效利用抗-乙酰化微管蛋白抗体的蛋白免疫印迹法分析来检测。
[0100]为了诱发因急性肝损伤(acute hepatic injury)而诱发的急性肾损伤，通过结扎鼷鼠的肝动脉(hepatic artery)和肝静脉(hepatic vein)而诱发急性肝损伤，并在24小时后留取尿液，通过使用抗-乙酰化微管蛋白的蛋白免疫印迹法分析检测尿液中的初级纤毛的存在。
[0101](2)组织学分析
[0102]经由左心室且使用PBS 30ml进行2分钟的肾脏灌流之后，使用PLP溶液(2%多聚甲酸(paraformaldehyde)、75mM L-赖氨酸(L-lysine)、10mM 偏高鹏酸钠(sodiummetaper1date))进行灌流。然后，摘除肾脏，在4°C温度下在PLP中浸渍4小时。利用超薄切片机将石錯包埋组织样本粉碎成4 μ m厚的薄片。利用周期性过碘酸希夫(PAS，per1dicacid Schiff)对石蜡薄片进行染色，并确认组织学损伤。关于PAS染色，依据制造商手册执行。通过数码相机拍摄之后收集影像。各试验动物组由四只以上鼷鼠组成。
[0103](3)肾脏功能参数
[0104]使用贝克曼肌酐分析仪II (Beckman, Brea, CA)来测定血楽内肌酸酐(plasmacreatinine, PCr)的浓度。
[0105](4)免疫荧光分析
[0106]使用二甲苯从石蜡包埋组织薄片中去除石蜡成分，并利用100、95及80%乙醇依次处理而使其再水化后，分别用PBS洗涤10分钟。将上述薄片在包含0.1% SDS的PBS中浸渍5分钟，并用PBS洗涤10分钟。为了使抗原决定基露出，使用高压蒸气灭菌器将上述薄片在10mM朽1檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮10分钟，并在室温下冷却20分钟之后，分别用PBS洗涤三次且每次为5分钟。将上述薄片在包含1%牛血清白蛋白(BSA，Bovine serumalbumin)的PBS中浸渍30分钟并进行封闭，在4°C下与各自的抗体(抗-乙酰化α -微管蛋白(acetylated a-tubulin)抗体(Ac-微管蛋白(tubulin), 1:100 ；Sigma),抗 _Na/K-腺苷三磷酸酶(ATPase)抗体(1:20稀释；Santa Cruz, CA),抗_5_溴脱氧尿啼啶核苷(BrdU)抗体(1:100 稀释；Serotec, Raleigh, NC)，抗-水通道蛋白(aquaporin) _1 抗体(AQP1 ； 1:100 稀释；Alomone Labs, Jerusalem, Israel)和抗-AQP2 抗体(1:200 稀释；Alomone Labs))反应一整晚。反应结束之后，用PBS将各薄片洗涤三次且每次为5分钟，并在常温下与结合有荧光素(FITC)或红色荧光(Texas Red)的二次抗体反应60分钟后，用PBS洗涤三次且每次为5分钟。为了检测细胞核，在各薄片上施加1分钟DAPI (4’ -6_diamidino-2-phenylindole，4’, 6- 二脒基_2_苯基卩引噪)。最后，将上述薄片置于ProLongGold 抗裡色剂(Prolong Gold ant1-fade reagent) (Invitrogen, Carlsbad, CA)上，并用Ax1plan-2epifluorescence焚光显微镜进行观察。各试验动物组由三只鼷鼠组成。
[0107](5)肾脏组织中的过氧化物的形成及脂质过氧化水平的测定
[0108]在焚光检测仪(fluorescencespectrometer, Molecular Devices)上使用超氧化物阴离子荧光探针(二氢乙啶，dihydroethidium) (DHE)来测定肾脏组织内的过氧化物标准。简单而言，利用冰对从鼷鼠摘除的肾脏进行匀质化来获取肾脏粉碎物。在带有20 μ 1肾脏粉碎物的96孔板中加入10 μ M DHE 200 μ 1。使用发光/激发滤光片在37°C下测定从上述孔板中释放出的荧光。过氧化物水平用每lmg肾脏粉碎物蛋白质值来表示。使用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS，Th1barbituric acid-reactive substances)测定脂质过氧化水平。
[0109](6)蛋白免疫印迹法分析
[0110]根据Park KM (Park KM, Chen A, and Bonventre JV., The Journal of b1logicalchemistry 276:11870-11876, 2001)等公知的方法进行蛋白免疫印迹法分析。简单而言，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离肾脏组织粉碎物，并使其转移到Immobilon薄膜(membrane)中。使上述薄膜(membrane)与抗 _p_ERK 抗体、抗-total ERK 抗体、抗-CP1-17抗体、抗肌动蛋白(beta-actin)抗体、抗-KIM-1 (kidney injury molecule-1，肾损伤分子-1)抗体和抗-GAPDH抗体进行反应。洗涤之后，将上述薄膜(membrane)与在一次抗体中结合有过氧化物酶的二次抗体进行反应，并使其露出在Western Lighting化学发光试剂(Chemi luminescence Reagent (NEL101))上之后，拍摄成 X 光照片(X-ray) 0
[0111