4、6、8、12、16、20微升加入到96孔板的蛋白标准品孔中，每孔力日PBS补足20微升， 绘制标准曲线； 3) 将样品做适当的稀释(分别稀释2倍、4倍、8倍），加20微升至96孔板的样品孔中； 4) 将配好的化Iin酪甲试剂每孔加入200微升，轻轻震荡混匀室溫放置10分钟； 5)每孔中加入化Iin酪乙试剂，迅速混匀，37°C解育30分钟，用酶标仪(美国伯乐，Bio-rad680)测定A650,根据标准曲线计算出蛋白浓度(见表1)。
[0034] 2.5 间接化ISA法检测HIV-I pl7、p24、p31、p66抗体 所用10份HIV-I阳性血清，均经WB确认，含有表达的HIV-I重组抗原对应的抗体，10份 HIV-I阴性血清。
[003引 1)用ddH20润湿96孔板，吸水纸上拍干； 2) 不同浓度的HIV-I pl7、p24、p31、p66抗原分别包被96孔板，4°C放置12小时； 3) lXPBS-0.05% tween PH7.4洗涂96孔板S次，每次5分钟，200ul/孔； 4) lXPBS-2% BSA 37°C 封闭3小时； 5) lXPBS-0.05% tween PH7.4洗涂96孔板S次，每次5分钟，200ul/孔； 6) 加入不同浓度的已知阳性血清和已知阴性血清IOOul/孔，空白孔加入1 XPBS 1 OOu 1 /孔。37°C水浴1小时； 7) lXPBS-0.05% tween PH7.4洗涂96孔板S次，每次5分钟，200ul/孔； 8) 每孔加入不同浓度的酶标二抗(PH7.4 1 XPBS-0.05% tween稀释），37°C水浴1小时； 9) lXPBS-0.05% tween PH7.4洗涂96孔板S次，每次5分钟，200ul/孔； 10) 显色液A和显色液B 1:1混匀，IOOul/孔，37°C避光水浴20分钟； 11) 每孔加入50ul终止液终止反应； 12) 酶标仪读取450nm吸光度，结果见表2。
[0036] 3.液相忍片法检测HIV-I中的应用 3.1微球的包被 将 HIV 抗原即 41、917、924、931、966、旨9120分别包被到50，56，65，71，83、77号微球 (北京中原领先科技有限公司，型号分别为LC10050，LC10056，LC10065，LC10071，LC10083， LC10077)上，p24单克隆抗体(沃本免疫诊断公司，1103-clone 4F6)包被到37号微球(北京 中原领先科技有限公司，LC10037)上。蛋白和微球的偶联方法参照Luminex公司操作手册进 行。
[0037] 1)从冰箱里取试剂盒，室溫平衡20-30分钟； 2) 室溫平衡运段时间，计算步骤4、8、11、13所需的体积数，W便每个反应顺利进行； 3) 重悬未偶联的微球:旋满备用微球10秒，超声10秒W分散微球； 4) 吸取IOOul微球混悬液(约1.25 X IO6个)于1.5mL低结合率离屯、管内。^ 8000 X g离 屯、l-2min，用吸管小屯、吸走上清； 5) 洗涂微球：向低结合率离屯、管内加入125ul活化缓冲液，满旋10秒，超声10秒，^ 8000 X g离屯、1-2分钟。用吸管小屯、吸走上清； 6) 重复步骤5，一次共洗两次； 7) 用吸管小屯、吸走上清； 8) 480化活化缓冲液加入到反应管； 9) 满旋反应管10秒钟，然后超声处理10秒，W分散微球； 10) 满旋所提供的横酸基-N服管至少10秒； 11) 添加10化的横酸基-N服溶液到反应管； 12) 加入25化L的活化缓冲液于抓C(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)小 瓶内（10毫克，现配现用）； 13) 向反应管加入10化的邸C溶液； 14) 满旋的反应管至少10秒； 15) 微球室溫避光解育20±1分钟，10分钟旋满微球一次，^SOOOXg离屯、1-2分钟，用 吸管小屯、吸走上清； 16) 洗涂微球:取5(K)化活化缓冲液加入到反应管。满旋反应管10秒，然后超声处理10 秒，W分散微球； 17) 重复步骤16两次，共洗=次； 18) > SOOOXg离屯、1-2分钟，用吸管小屯、吸走上清； 19) 向反应管中添加900ul活化缓冲液； 20) 向反应管中加入IOOul终浓度为0.25mg/ml的抗原与抗体； 21) 满旋的反应管为至少10秒； 22) 微球避光在旋转器上旋转2小时(旋转速度15-30转）； 23 )洗净微球：向反应管中加入50化L洗涂缓冲液。满旋反应管10秒，然后超声处理10 秒，W分散微球； 24) 重复步骤23两次，共洗涂=次； 25) >8000Xg离屯、1-2分钟，用吸管小屯、吸走上清； 26) 向反应管中加入12加1洗涂缓冲液； 27振荡反应管10秒钟，然后超声处理10秒，W分散微球。用血球计数器计数微球，确定 微球的浓度； 28)在2-8°C避光保存。
[0038] 3.2 HIV-I抗体阳性、不确定、阴性标本的抗体检测及反应条件的优化 1) 加样之前用IOOul/孔的分析缓冲液润湿96孔板； 2) 加阴性血清和用分析缓冲液稀释了 25倍的阳性血清，2加1/孔； 3) 加入混匀的稀释好的微球(确保100个M)25ul/孔； 4) 室溫震荡培养1小时； 5) 室溫3500rpm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 6) 12加1/孔洗涂缓冲液洗涂微球，3500rpm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 7) 重复第6步，两次； 8) 加稀释好的生物素化二抗(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、SB-0052) Jug/ ml，2加 1/孔； 9) 室溫震荡培养1小时； 10) 室溫3500rpm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 11) 12加1/孔洗涂缓冲液洗涂微球，350化pm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 12) 加入20ug/ml的SA-PE 25ul于每孔； 13) 室溫震荡解育30分钟； 14) 室溫3500rpm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 15) 12加1/孔洗涂缓冲液洗涂微球，350化pm，离屯、5分钟，小屯、弃上清； 16) 加入12加1/孔洗涂缓冲液重悬微球，Luminex-200检测J(美国Iuminex公司，Iuminex 200) ,Luminex-IOO软件（美国 Iuminex公司）分析。
[0039] 3.2.1生物素化二抗浓度的优化 其余反应条件不变，将生物素化二抗倍比稀释（8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml、 0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.12加 g/ml、0.0625ug/ml)，根据平均巧光强度(Mean Fluorescent Intensity，MFI)来确定最佳的反应浓度。
[0040] 实验结果如图2所示，MFI随着生物素化二抗浓度的提高而提高，当生物素化二抗 浓度为4ug/ml时MFI最高(MFI: 6799)。
[0041 ] 3.2.2 SA-阳加入浓度的优化 其余反应条件不变，将SA-TO按W下浓度分别加入各孔20ug/ml、18ug/ml、16ug/ml、 14ug/ml、12ug/ml、lOug/ml、8ug/ml、6ug/ml、4ug/ml、化g/ml，根据平均巧光强度来确定最 佳的反应浓度。
[0042] 实验结果如图3所示，当SA-TO加入浓度为14ug/ml时，MFI为10857,在实验所用的 几个浓度中MFI最高，因此选用14ug/ml为SA-PE的最适浓度。
[0043] 3.2.3 SA-阳反应条件的优化 其余反应条件不变，SA-PE反应时间分别于10分钟、20分钟、30分钟终止反应。根据平 均巧光强度来确定SA-PE最佳的反应时间。
[0044] SA-PE反应时间对实验的影响如图4所示，从图中明显可W看出，SA-PE反应10min、 20min、30min的MFI差别不是太大，但是总体是上升的趋势，为了保证实验的质量W及能够 获得一个较高的MFI值，SA-阳反应时间最终选择了 30min。
[004引3.2.4加样方式的优化 确定好生物素化二抗，SA-PE的加入浓度后，探讨加样方式是否对实验产生影响，设计 了 W下几种加样方式（其余实验条件均相同），根据平均巧光强度（Mean Fluorescent Intensity，MFI)来确定最佳加样方式： 1)微球、血清标本、生物素化二抗、SA-阳同时加入96孔板，室溫震荡培养1小时，室溫 3500rpm，离屯、5分钟，小屯、弃上清。125ul/孔洗涂缓冲液洗涂微球，350化pm，离屯、5分钟，小 屯、弃上清(洗3次），加入12加1/孔洗涂缓冲液重悬微球，Luminex-200检测，Luminex-IOO软 件分析。
[0046] 2)微球、血清标本、生物素化二抗同时加入96孔板，室溫震荡1小时室溫3500巧m， 离屯、5分钟，小屯、弃上清。加入优化好浓度的SA-阳于各孔，室溫震荡解育30分钟。125u