至浓度为25000分子数/μ1、83333分子数/μL和250000分子 数AU三个浓度。然后以01igol-3为例，将01ig 〇l-3在相同浓度下混合，得到混合样品Α、Β、 C，如表2所示。
[0058] 表2实施例2样品配方
[0059]
[0060] 将上述样品按照表3配置QPCR扩增液，得到QPCR扩增试剂盒。然后按照表4所示的 程序对01ig〇l-3进行QPCR扩增，以及对混合样品A、B、C中的Oligol-3各自进行QPCR扩增，以 各自延伸扩展后的01ig〇l-3为模板，扩增结果的Ct值如表5所示。其中，延伸引物为RT-P，它 的3'端末端与寡核苷酸的3'端互补配对，5'端可以形成发卡结构，且中间序列与MGB探针 (MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-P以序列为SEQ ID勵：14所示为例。正向引物为卩卩， 反向序列为RP。FP以序列为SEQIDN0:15所示为例，RP以序列为SEQIDN0 :16所示为例， MGty以序列为SEQ ID从)：17所示为例，5'端的荧光基团用?41标记，3'端为10。
[0061 ] 表301 igo分子的QPCR扩增试剂盒 [0062]
[0063] 表4QPCR扩增程序
[0064]
[0065] 表5扩增结果Ct值 「00661
[0067] ~从表5可以看出，混合样品A、B、C中的01 igo 1 -3，在相同浓度下扩增的Ct值与单个^ Oligo的扩增Ct值相差为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，可 以算得回归直线方程及相关系数R2如下：
[0068] 01ig〇1:y = -3.3664x+40.11，R2 = 0.99937;
[0069] 01ig〇2:y = -3·384x+40·809，R2 = 0·99997;
[0070] 01ig〇3:y = -3.3824x+38.928，R2 = 0.99463。
[0071] 将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除以对应理论 分子数，所得检测效率如下： Γ00791
[0073]因此，平行样品间扩增Ct差值为0.1左右，检测效率为98.5 %_110.5%之间，说明 三条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经 鉴定可以得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可以保证多重PCR 的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可以得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说 明。
[0074]实施例3制作标准曲线
[0075]以01ig〇l-13可以得到同样的结果，为了简化过程，以下实施例以01ig〇l-3为例。 [0076] 按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对01ig〇2进行修饰得到01ig〇-FB，用 摩尔当量为10倍的SANH对CD24进行肼基修饰得到CD24-SANH，将摩尔比为10:1的01ig〇-FB 与CD24-SANH在室温条件下反应16小时后得到CD24-01 igo2。
[0077]按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的SFB对01ig〇3进行修饰得到01ig〇-FB， 用摩尔当量为50倍的SANH对⑶44进行肼基修饰得到⑶44-SANH，将摩尔比为8:1的01ig〇-FB 与CD44-SANH在室温条件下反应24小时后得到CD44-01 igo3。
[0078] 将CD133-01igol、CD24-01igo2和CD44-01igo3按照表3的试剂盒和表4的程序进行 QPCR扩增，以延伸扩展后的01igol-3为模板，得到的扩增结果与01igol-3单独扩增一致，说 明偶联的抗体部分对01 igo的QPCR扩增没有影响。
[0079] 用标准品稀释液将CD133-01igol、CD24-01igo2和CD44-01igo3各自稀释成浓度 为：833、2500、8333、25000、83333和250000分子数/2.5μ1，共六个浓度，空白对照组为去离 子水。
[0080] 按照表3所示的配方配置PCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的程序对以上各浓度 的 CD133-01igol、CD24-01igo2 和 CD44-01igo3 进行 QPCR 扩增，以延伸扩展后的 Oligol-3 为 模板，扩增结果如表6所示：
[0081 ] 表6标准曲线QPCR扩增结果Ct值
[0082]
[0083]~根据抗体-Oligo的不同浓度的Ct值，绘出标准曲线，进行线性回归计算，得到回归 直线方程及相关系数如下：
[0084] CD133-01igol:y = -3.2951x+41.354，R2 = 0.99782;
[0085] CD24-01igo2:y = -3.3332x+39.184，R2 = 0.99609;
[0086] CD44-01igo3:y = -3·872x+42·342，R2 = 0·96588。
[0087] 实施例4CTC细胞抗原的QPCR检测
[0088] 取不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC细胞抗原量进行检测。要求受试者 血常规白细胞值位于2X 106~1.2 X 107个/mL之间，并且血液样本在处理过程中，样本没有 出现以下异常现象:如样本红细胞裂解不完全导致样本细胞粘连、样本红细胞裂解后剩余 细胞偏少/白细胞偏少，全血样本出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采 集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：
[0089] (1)取不同癌症病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样 品置于2-8°C冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入lOmLPBS洗涤细胞;离心弃上清，再加入 400yLPBS重悬细胞。
[0090] (2)加入100μΙ blocking buffer后室温封闭20min;再加入CD133-01igol、CD24- 01igo2和CD44-01igo3探针后，在室温孵育40min后终止反应并离心去上清。
[0091] (3)使用PBS洗涤细胞3遍后加入120ul洗脱液混合均匀，冰上孵育2min，离心取 100ul上清，洗脱未反应的探针;最后加入20yL反应中和液中和。
[0092] 用实施例3制作标准曲线相同的QPCR条件检测CD133-01igol、CD24-01igo2和 ⑶44-01 igo3探针的Ct值，结果如表7所示：
[0093] 表7CTC的QPCR检测结果
[0094]
[0095] 实施例5CTC细胞抗原的免疫荧光检测
[0096] 为了检测本发明试剂盒检测结果的可靠性，对与实施例4相同的血液进行免疫荧 光检测，其步骤如下：
[0097] (1)取与实施例4相同的病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。 然后将样品置于2_8°C冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入lOmLPBS洗涤细胞;离心弃上 清，再加入400yLPBS重悬细胞。
[0098] (2)使用⑶45磁珠去除部分白细胞，离心后使用100ul PBS重悬细胞。
[0099] (3)加入浓度为4 %的多聚甲醛溶液固定后涂片，PBS洗三遍后封闭30分钟，PBS再 洗三遍。
[0100] (4)分别加入各个标记的一抗⑶133、⑶24和⑶44抗体，在4°C湿盒内过夜，PBS洗三 遍。
[0101] (5)DAPI染核并封片后，用荧光显微镜鉴定计数，结果如表8所示：
[0102] 弄8CTC的免痦w光拾涮结里
[0103]
[0104]从表7和表8的检测结果可以看出，Ct值越低的样品，含有的抗原分子个数越高。而 镜检所得荧光阳性CTC个数越多，即CD133、CD24及CD44含量越多，荧光阳性CTC个数即有侵 袭力的CTC个数越多，表明ct值与镜检个数二者呈负相关，一致性良好。从检测结果来看，c 和E号病人的⑶133、⑶24及⑶44含量较多，CSC表达量高于A、B、D号病人。
[0105] 对上述A-E编号的病人进行术后跟踪，术后复发的结果如表9所示：
[0106] 表9术后复发结果
[0107]
LUiUbj 通]Q：表9口」以宥出，C、E組的柄人木;53个月炅友，说明共CTC细腿的侵袋刀牧强，结 果与表7、8-致。
[0109]对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还 可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:它包括： 由⑶133、⑶24和⑶44抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探 针； 用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液； 还包括焚光探针。2. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述抗 体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分;所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷 酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡 核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。3. 根据权利要求2所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述寡 核苷酸探针部分是将5'端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基 修饰后得到的；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-30倍的SANH进行肼基修饰后得到 的。4. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述抗 体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下 反应12-24小时后得到的。5. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述寡 核苷酸的长度为16_22nt，5 '端为6-14nt长度的引物识别序列，3 '端用延伸引物进行延伸扩 展。6. 根据权利要求5所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述延 伸引物的长度为50_80nt，它的3 '端末端与寡核苷酸的3 '端互补配对，5 '端可以形成发卡结 构，且中间序列与荧光探针的序列互补。7. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述寡 核苷酸的序列为SEQ ID NO: 1-13中所示的任一个。8. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述扩 增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引 物的5'端与寡核苷酸互补。9. 根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于:所述循 环肿瘤细胞为宫颈癌、乳腺癌或前列腺癌循环肿瘤细胞中的一种或多种。
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测循环肿瘤细胞侵袭力的试剂盒，其特征在于：它包括：CD133、CD24和CD44抗体分别与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；还包括荧光探针。本发明所述的试剂盒通过将CD133、CD24和CD44作为CSC的标识物，进行平行检测CTC中各抗原的含量，从而得到CTC中CSC的表达量，分析出CTC的侵袭力。检测成本低，灵敏度高，具有很强的实用性。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105675870
【申请号】CN201610206075
【发明人】李静, 陈昌岳, 蔡红东, 邓文斌, 甘广利, 张祥林
【申请人】上海美吉生物医药科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月5日