[0036] 如上所述的克百威生物条形码免疫分析测定试剂盒在克百威定性定量分析中的 应用。
[0037] 如上所述的克百威生物条形码免疫分析测定试剂盒测定克百威的方法，包括： [0038] a)、将克百威标准品、提取与净化后的待测样品分别与等体积的克百威双标胶体 金探针和克百威磁性纳米探针混合孵育；
[0039] b)、洗涤孵育产物并去杂化得到与各标准品与待测样品对应的生物条形码；
[0040] c)、将所述生物条形码与DNA生物芯片杂交，并加入单标纳米金探针放大信号；杂 交反应结束后加入银染试剂并用芯片扫描仪测定仪测定各孔灰度值；
[0041] d)、以克百威标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为纵坐标，建立 标准曲线，并根据标准曲线计算各样品中的克百威浓度。
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0043] (1)本发明可以特异地定量检测克百威含量。具有简便、快速、灵敏、特异、稳定等 优点。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推 广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
[0044] (2)根据本发明的试剂盒，磁性纳米探针中的克百威半抗原与检测样品中的克百 威竞争克百威双标胶体金探针上的克百威单抗形成直接竞争体系，因此本法采用的竞争反 应体系，即确保检测的灵敏度，也可有效保证检测结果的良好重现性。另外，这种模式还便 于操作和生产。
[0045] (3)本发明的试剂盒使用的是银染方法，通过检测生物芯片上的灰度值，灵敏度大 大提高，可为蔬菜水果中克百威的检测提供更为灵敏、快速、可靠的依据。
【附图说明】
[0046] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0047] 图1为杂交反应结束后DNA生物芯片的扫描图；
[0048] 图2为实施例2中以克百威标准品的浓度为横坐标，各浓度所对应的灰度抑制率为 纵坐标，建立的标准曲线。
【具体实施方式】
[0049]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050] 实施例1
[0051] 克百威生物条形码免疫分析测定试剂盒的制备方法
[0052] S11、单标胶体金探针的制备
[0053] 1 )、金纳米颗粒合成方法
[0054]向硅化好的烧杯中分别加入98mL去离子水，再分别入2mL50mM氯金酸原液，使氯金 酸的浓度为ImM，在磁力搅拌器上l〇〇〇rpm/min搅拌、250 °C加热，液体沸腾后继续煮沸2min; 吸取10mL 38.8mM柠檬酸三钠，迅速一次性加入烧杯中，保持搅拌速度和加热温度不变，继 续煮沸6min，可发现溶液颜色由无色逐渐变成紫色，再变成酒红色，根据加入柠檬酸三钠还 原剂量的不同最终变成不同的颜色，待液体冷却后用去离子水补回原体积，于4°C密闭保 存，合成的金纳米颗粒的粒径控制在13~15nm。
[0055] 2)、取巯基化DNA1溶液，加入100mm〇l/L的三(2-羧乙基)膦溶液(TCEP)，在室温下 摇床上放置2小时。还原剂TCEP与DNA1之间的比例接近200:1，高比例的差距加快反应速度， 提高还原效果。室温下，新合成的纳米金球在6000rcf转速下20离心分钟，将纳米金球取出 溶于超纯水。取一定体积的纳米金球l〇〇〇〇rcf离心20分钟，去掉上清液，加入0.5 X Tris-硼 酸（T B E)缓冲溶液，然后加入所取的巯基化D N A的量，加入氯化钠溶液至氯化钠浓度为 50mmol/L，常温下，反应24小时。逐渐添加氯化钠至浓度为500mmol/L(分3次加入，每次隔1 个小时加入一次），常温下静置8小时。lOOOOrcf离心20分钟，除去上清液，溶于超纯水，重复 3次，得到巯基化DNA1修饰的纳米金球GNP溶液。
[0056] S12、克百威双标胶体金探针的制备
[0057] 取一定体积胶体金溶液，用0. lmol/L K2CO3调节至pH = 9.0;静置15min，加入一定 量的克百威单克隆抗体，在搅拌下将胶体金和抗体混合，静置30min。然后加入硫醇修饰的 DNA链，10°C静置40h，再以磷酸缓冲液(PBS)调整至pH = 7.4,提高NaCl浓度，NaCl分3次加 入，每隔1个小时加入一次，至终浓度0.1111〇1/1，1000(^/1^11离心101^11，即得到含寡核苷酸 的胶体金。用lmL PBS重悬含寡核苷酸的胶体金，静置10~15分钟，然后再加入5%牛血清白 蛋白（BSA)，使BSA终浓度为1%，封闭lh。再加入与硫醇修饰的所述单链DNA链互补的生物条 形码DNA链，室温杂交4h，10000r/min离心得到克百威双标胶体金纳米探针。
[0058] S13、克百威磁性纳米探针的制备
[0059] 1)、鸡卵白蛋白（0VA)标记克百威半抗原的制备
[0060] 辣根过氧化物酶标记克百威半抗原的制备，具体方法如下：
[0061] 取半抗原0.25mmol，溶于lmL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌下加入60μ1正三丁胺 和30μ1氯甲酸乙酯，室温搅拌反应lh。取反应液300μ1缓慢滴加至lj6mL溶有120mg 0VA的碳酸 盐缓冲液(CBS，0.01mol/L)中，室温搅拌反应2h后，装入透析袋，先用蒸馏水透析3次，然后 用0.01m〇l/L的PBS透析3d，每天换透析液3-4次。取出分装保存于-20°C的冰箱中。
[0062] 2)、磁性纳米粒子合成方法
[0063] 磁性微球的形成过程:取8.1g FeCl3 · 6H20和3.3g FeCl2 · 4H20加入150mL去离子 水，配成溶液，然后移入三口烧瓶中。在N2保护环境中与剧烈搅拌状态下向Fe2+和Fe 3+的混合 溶液中18mL质量分数为25 %的浓氨水，溶液中开始生成棕褐色的Fe3〇4粒子，调节溶液的pH 值在9~11之间，此刻反应温度为70°C，在反应的过程中要保证一定的搅拌速度，反应的离 子方程式为：
[0064] Fe2++2Fe3++80H- = Fe3〇4+4H2〇
[0065] Fe3〇4/油酸的合成:在剧烈搅拌状态下将5.0g油酸(C18H34〇 2)加入Fe3〇4的液体中， 然后在N2保护环境下，温度为70°C水浴中反应一个小时，使油酸均匀的包覆在粒子表面。反 应结束后，得到黑色溶胶状物质，利用外加磁场将所得的沉淀从反应体系中分离出来，用乙 醇洗涤3次除去多余的油酸，再用去离子水洗涤至pH = 7,此时得到油酸均匀包覆的Fe3〇4粒 子。
[0066] 单层羧基功能化的Fe3〇4粒子合成：采用高锰酸钾氧化油酸法合成壬二酸(H00C (CH2) 7C00H)形成羧基化磁性纳米粒子。加入160mL浓度为10mg/mL的KMn〇4溶液在剧烈搅拌 状态，温度为50°C条件下反应8h，反应结束后利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离 出来，并先后用去离子水洗涤3次，所得产物在40°C下真空干燥，将干燥后的粒子溶于水溶 液便得到稳定的羧基化磁性纳米粒子。磁性纳米粒子的粒径控制在18~2 2nm。
[0067] 3)、磁性微球和0VA-半抗原的连接
[0068] a)、微球的活化。用pH=6.0，15mmol/L的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液(MES)作为活 化缓冲溶液，取lmL磁珠于2. OmL离心管中，加入活化缓冲溶液后，将上清液吸掉;再用活化 缓冲液重新洗涤磁珠2遍，再分别加入碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺，在漩涡振荡器上混合 均匀，室温活化30min。
[0069] b)、微球与OVA-半抗原偶联。用pH = 7.4,0.01mol/L的磷酸盐吐温（PBST，1% Tween-20)溶液作偶联缓冲液，用活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍，再用偶联缓冲 液洗涤磁珠2遍;然后用偶联缓冲液重悬磁珠，再加入0VA-半抗原，使得磁珠表面活化的羧 基与0VA的氨基于37C下反应lh，将0VA-半抗原偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。
[0070] c)、封闭。用偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入含有2 %BSA的偶联缓冲液封闭 磁珠60min。最终得到免疫磁性探针。
[0071] S14、克百威标准品的制备
[0072]用克百威纯品配制，浓度分别为0ng/mL、0 · 05ng/mL、0 · 01ng/mL、0 · 5ng/mL、lng/ mL、5ng/mL、1Ong/mL，共7并瓦；
[0073] 所述克百威纯品纯度不低于90%。