细胞1-2 X 16 /只，7-10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，冻存备用。
[0037]3、玉米赤霉烯酮免疫原(ZEN-BSA)制备
[0038]3.1称取2 mg玉米赤霉稀酮标品溶于0.8ml卩比啶中，向其中加入4 mg的O-羧甲基羟胺，溶解后，70°C搅拌反应5小时。
[0039]3.2将反应产物旋转蒸干，加3ml蒸馏水溶解，磁力搅拌下用lmol/L NaOH调pH至8.0，用1ml 二氯甲烷分三次抽提。用0.2mol/L HCl调水相pH至3.0，用6ml乙酸乙酯分三次抽提沉淀物，置通风橱中氮吹干，所得干燥物即为玉米赤霉烯酮活化物。
[0040]3.3用2ml DMF溶解玉米赤霉烯酮活化物，加入8 mg DCC和6mg NHS,室温磁力搅拌下反应4h。称取15mg BSA溶解于1.5ml碳酸盐缓冲液(0.lmol/L, pH 9.51)中，磁力搅拌下将玉米赤霉烯酮活化物溶液逐滴加入蛋白溶液中，室温下反应5小时。
[0041]3.4将上述反应溶液装入透析袋中，用20mM pH7.4 PBS溶液透析，4°C透析三天，期间每8小时换一次透析液。
[0042]3.5取出透析后的溶液，离心，取上清，_20°C保存。
[0043]4、抗玉米赤霉稀酮单克隆抗体制备
[0044]4.1小鼠免疫
[0045]将制备好的玉米赤霉烯酮免疫原，按体积比1:1加入佐剂混匀乳化，按蛋白浓度100 μ g/只腹部皮下多点免疫BALB/c小鼠，首免免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，二免及以后以免疫元和弗氏不完全佐剂等体积混匀，首免3周后，以同样方法进行二次免疫，二免后每两2周免疫一次，三免后检测小鼠血清效价，血清效价合格后进行融合，融合前3天再追加免疫一次。
[0046]4.2细胞融合
[0047]按照常规方法，准备好处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)和提取免疫小鼠的脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞混合，然后在I分钟左右时间内(最佳时间为45秒)缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养十96孔培养板，于37°C 5% 0)2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天的时候进行全换液。
[0048]4.3杂交瘤细胞的筛选
[0049]细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。采用间接亚克隆化。
[0050]4.4杂交瘤细胞的冻存
[0051]将进行了 2-3次亚克隆后的杂交瘤细胞扩大培养后用含25%血清、10% DMSO的基础细胞培养液冻存，浓度为16-1O7左右/ml。
[0052]4.5单克隆抗体腹水制备
[0053]复苏冻存的杂交瘤细胞，扩大培养。取8-10周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，7-10日后腹腔注射杂交瘤细胞1-2 X 16 /只，7-10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，冻存备用。
[0054]5、胶体金溶液制备
[0055]取10ml去离子水加入2.5ml 1%氯金酸溶液，煮沸后，迅速加入1.5ml 2%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，冷却后，4°C避光保存。经测定，该胶体金颗粒直径为35nm左右。
[0056]6、胶体金标记赭曲霉毒素A单抗的制备
[0057]移取制备的胶体金溶液100ml，用0.1M碳酸氢钠溶液调整pH值到8.0，加入Iml抗赭曲霉毒素A单抗，搅拌15分钟，缓慢加入Iml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分钟后，10000r/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶后，4 °C避光保存。
[0058]7、胶体金标记玉米赤霉稀酮单抗的制备
[0059]移取制备的胶体金溶液100ml，用0.1M碳酸氢钠溶液调整pH值到8.0，加入Iml抗玉米赤霉烯酮单抗，搅拌15分钟，缓慢加入Iml 25M的聚乙二醇20000溶液，搅拌15分钟后，10000r/min离心15分钟。弃去上清液，加入2ml含2%BSA的pH7.4的磷酸盐缓冲液复溶后，4 °C避光保存。
[0060]8、试纸条的组装
[0061]用点膜机把适当浓度的OTA-BSA偶联物、ZEN-BSA偶联物以及羊抗鼠IgG分别喷涂在反应膜上，作为检测线和质控线，37°C干燥箱内干燥5小时。将适当浓度的两种金标抗体分别喷涂在经过处理的胶体金结合垫上，37°C干燥箱内干燥5小时。在PVC背衬板上依次粘贴样品垫，胶体金结合垫，反应膜和吸水垫。组装完毕后，用切割机切割为3.5_宽的试纸条，同干燥剂一起密封入铝箔袋中保存。
[0062]9、试纸条的检测操作办法
[0063]9.1样品前处理
[0064]取Ig粉碎的样品置于1ml离心管中，加入5ml样品提取液，剧烈震荡3分钟，静置2分钟后，吸取0.5ml的上清液，再加入0.5mI的样品稀释液，混合均匀后待用。
[0065]9.2检测步骤
[0066]水平放置试纸条，吸取混合好的待测样品液100 μ I滴加到加样孔中，3-5分钟内读取实验结果。
[0067]9.3结果判断
[0068]在光线充足处，水平放置检测板，读取结果。
[0069]质控线未显色，表示操作不当或试纸条已失效，应更换试纸条重新检测。
[0070]质控线显色，两条检测线都显色，表示样品中所含赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的量低于检测限或者不含赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮。
[0071]质控线显色，两条检测线都不显色，表示样品中所含赭曲霉毒素A及玉米赤霉烯酮的量等于或高于检测限。
[0072]质控线显色，赭曲霉毒素A的检测线显色而玉米赤霉烯酮的检测线不显色，表示样品中所含赭曲霉毒素A的量低于检测限或者不含赭曲霉毒素Α，而样品中所含玉米赤霉烯酮的量等于或高于检测限。
[0073]质控线显色，赭曲霉毒素A的检测线不显色而玉米赤霉烯酮的检测线显色，表示样品中所含赭曲霉毒素A的量等于或高于检测限，而样品中所含玉米赤霉烯酮的量低于检测限或者不含与玉米赤霉烯酮。
【主权项】
1.一种同步检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条，其特征在于:试纸条由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成，且在相邻的地方有2mm的重叠，胶体金结合垫上喷有赭曲霉毒素A单克隆抗体及玉米赤霉稀酮单克隆抗体和胶体金颗粒的结合物；反应膜上从样品垫到吸水垫方向依次喷有赭曲霉毒素A—牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮一牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗体，分别作为检测线和质控线。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于试纸条上的背衬为一面涂有不干胶的不吸水材料；样品垫用玻璃纤维制成；胶体金结合垫用聚酯膜或玻璃纤维素膜制成；反应膜用硝酸纤维素膜制成；吸水垫用吸水纸制成。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于两条检测线和质控线呈间隔分布，相邻两条线之间的间距为3 — 5mm。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于所用胶体金颗粒的直径为20—40nm。
【专利摘要】本实用新型涉及一种同步检测赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的免疫层析试纸条。由依次黏贴在背衬上的样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫组成。反应膜上喷有赭曲霉毒素A—牛血清白蛋白偶联物、玉米赤霉烯酮—牛血清白蛋白偶联物和羊抗鼠抗体，作为检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色形式表现出来。具有操作简单、快速、灵敏度高的特点，且不需要借助其它仪器设备，适用于野外现场检测。可用于饲料、食品等样品中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮两种真菌毒素含量的同步检测。
【IPC分类】G01N33-531, G01N33-558
【公开号】CN204314300
【申请号】CN201420842568
【发明人】张波, 谢刚, 王松雪, 付晓玲, 雷达, 刘向阳
【申请人】北京康源泰博生物科技有限公司, 国家粮食局科学研究院, 南昌大学第二附属医院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月26日