专利名称：：枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种复配杀菌剂及其应用，尤其是一种将枯草芽孢杆菌和嘧霉胺复配的杀菌剂及其在防治梨黑斑病中的应用。
背景技术：
：近年来，我国梨树栽培面积迅速增加，果品产量急速提高。据农业部资料统计，2008年我国梨栽培面积95.4万公顷，产量816.5万吨，占世界梨总产量的50.3%。随着国民经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，对果品的质量及其安全性提出了越来越高的要求。但是，近年来由于气候环境变化和外来有害生物入侵，梨树重大病虫害(梨黑斑病、炭疽病、梨小食心虫和梨木虱等)频繁暴发，形成了梨树生长期病虫害交替发生、复合为害、农药连续使用的严峻局面。梨黑斑病(blackspotdisease)又名"裂果病"，是梨树主要病害之一。梨黑斑病不仅影响梨果产量和品质，而且造成贮藏期病果，在梨的进出口贸易中受到进口国的严密关注。2004年初，美国以在我国出口鸭梨上检出梨黑斑病新种为由暂停进口我国鸭梨，随后加拿大也采取了类似的暂停措施，给我国鸭梨产业和出口企业造成重大经济损失。生产上防治梨黑斑病完全依靠化学农药。据不完全统计，江苏省梨全生育期用药在15次以上，从梨树发芽开始，每隔IO天打一次药直至收获，全生育期打药不少于20次；这种化学防治果树病害的方法不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加了有毒化学物质在果品中的残留量，对人类健康带来危害。生物农药对人畜安全、环境兼容性好、病虫害不易产生抗药性，因而日益引起人们的重视。但是田间使用生物农药也存在着一些问题，如田间防治效果不稳定、田间药效作用缓慢等。解决这一突出问题的根本途径是突破目前以化学农药为主的防治对策的局限性，开展生防微生物与低毒化学药剂协同控制梨黑斑病的高效安全的病害控制技术体系。通过有目的地引进有益微生物，操纵管理果园生态环境中微生物群落的合理分布，形成一个生物多样化的设施生态系统，恶化梨黑斑病菌生存环境，充分发挥有益微生物生物防治的作用，大幅度降低化学农药使用量，实现梨黑斑病的可持续控制。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌；是分布在土壤、植物表面和根际的重要微生物种类，能产生一系列代谢产物抑制其它微生物的生长，具有防治植物病害的作用。目前在全世界保存的野生型枯草芽孢杆菌菌株有几百种，研究证实枯草芽孢杆菌能够产生40多种具有不同结构和功能的抗菌物质。江苏省农科院筛选获得的、对果树多种真菌病害有很好防效的枯草芽孢杆菌sf-628于2006年8月1日被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)受理保藏，保藏编号为CGMCCNo.1772，拉丁学名为Bacillussubtilissf-628(本文简称sf-628)。其生物学性状记载为sf-628在YPGA(酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g;葡萄糖5.0g，琼脂17.0g;水1000ml)培养基平板上生长24h的菌落3-5mm，菌落圆形，四周光滑，米色，表面有皱褶。革兰氏反应阳性，细胞形状杆状，细胞直径大于lPm，严格好气，L-阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、淀粉水解、明胶液化等利用反应均为阳性。枯草芽孢杆菌sf-628是一株对化学药剂嘧霉胺有天然抗性的菌株，用嘧霉胺进一步抗性诱导处理，能够在嘧霉胺含量10000卯m的YGPA培养基上正常生长。枯草芽孢杆菌sf-628还具有许多优良性能，如有较广的抑菌谱，对多种植物病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质；对果树黑斑病有很好的防治效果。目前，江苏省苏科农化有限责任公司利用枯草芽孢杆菌sf-628生产了具有不同含菌量的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。嘧霉胺，英文通用名pyrimethanil;化学名称为N_(4，6_二甲基嘧啶_2_基)苯胺。原药为浅黄色结晶粉末，熔点96.3t:，工业品含量在95X以上，能溶于大多数有机溶齐U，室温下在水中溶解度为0.121g/L，25°C时蒸气压力为2.2mPa，在一定pH值范围内稳定。油水分配系数LogP为2.84(正辛醇/水)。嘧霉胺原药按中国毒性标准分类为低毒级。大鼠雌雄急性经口LD5。分别为3690和4300mg/kgb.w.，大鼠雌雄急性经皮LD5。均大于2000mg/kgb.w.。对家兔皮肤、眼睛无剌激性。在试验剂量内无致畸、致癌、致突变作用。嘧霉胺作用机制独特，它能抑制病原菌蛋白质分泌，包括降低水解酶水平，然后渗透到寄主组织中使之坏死，因而与现有的杀菌剂无交互抗性。目前，将枯草芽孢杆菌和嘧霉胺复配的杀菌剂并未见诸报道。
发明内容本发明的目的在于针对目前生产上大量使用化学农药防治梨黑斑病、严重污染果园生态环境、导致农药残留超标、影响果品品质的问题，提出一种对梨黑斑病具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌嘧霉胺微生物复配杀菌剂及其应用。枯草芽孢杆菌sf-628和嘧霉胺复配后，形成优势互补的作用，既能发挥化学药剂高效、快速的抑菌作用，又能发挥sf-628在诱导果树抗病性、大量繁殖后微生物群落合理分布的调整功能等作用。通过使用该微生物复配剂，在果园生态环境引进大量有益微生物，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理等农业措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的果园生态系统，达到药效增加、减少化学药剂使用量、持久地控制果树病害流行的目的。本发明的目的是这样实现的一种枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂或填充辅料，其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1085%，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和嘧霉胺组成，在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为10-90%。在本发明中助剂为农药中常规助剂，溶剂或填充辅料为农药中常规溶剂或常规填充辅料；在成品药剂中助剂重量百分比为120%，溶剂或填充辅料所占的重量百分比为1075%。本发明所述的复配杀菌剂的剂型为水悬浮剂，或可湿性粉剂。—种上述复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树真菌病害。在所述复配杀菌剂的应用中，所述的果树真菌病害是指真菌引起的果树黑斑病。在所述复配杀菌剂的应用中，将成品药剂稀释5001500倍，稀释后有效药物成分的含量至少为532.5mg/L。本发明的优点在于将生防微生物枯草芽孢杆菌sf-628和化学药剂嘧霉胺按一定比例混合使用，由于枯草芽孢杆菌和嘧霉胺对病原菌的作用机制完全不同，两者复配使用不仅能发挥化学药剂嘧霉胺抑菌速度快、对梨黑斑病防治效果稳定的优势；而且还能保持生防微生物枯草芽孢杆菌sf-628在果树根叶围定殖、分泌抗生素、诱导植物产生抗病性等特点，改善果园微生物生态环境。通过复配、协同作用，达到互补优势，提高防治效果的目的；同时减少化学药剂用药量、降低用药成本、减少化学药剂在果品中的残留量、病原菌不易产生抗性。具体实施例方式实施例1、枯草芽孢杆菌sf-628对梨轮纹病菌、黑斑病菌和炭疽病菌菌丝生长的抑制作用。供试真菌病原菌菌株梨轮纹病菌、黑斑病菌、炭疽病菌，由江苏省农科院植保所提供。将供试病原菌移植PSA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、20g琼胶和1000ml蒸馏水，pH5.66.6)上，置于28t:培养箱中培养5d，备用。将生防菌sf-628在NA斜面(3g牛肉浸膏、lg酵母浸膏、5g蛋白胨、10g蔗糖、20g琼胶和1000ml蒸馏水，p朋.87.0)上进行活化，然后移入50mlNA培养液中，在28"下振荡(150r/m)培养48h，备用。在PSA平板中央放置病原菌菌丝块，直径为7mm;培养皿四周呈对角线放置4个滤纸片(离培养皿中心距离为22.5mm)，加入不同稀释倍数的生防菌sf-628菌液7iil;设无生防菌sf-628菌液处理为对照。每处理重复3次。待对照病原菌菌落长满平板时，测量处理菌落生长直径。计算抑制率抑制率(％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径_7)]X100%表1不同稀释倍数的生防菌sf-628对三种梨病原菌菌丝生长的抑制作用病原菌对照菌落直径CmrrO原液1:1001:500菌落直径(mm)抑制率(%)菌落直径(mm)抑制率(%)菌落直径(mm)抑制率(%)梨轮纹病菌901392.771787.951985.54梨黑斑病菌901590.362479,522677,11梨炭疽病菌901491.572084.342578.31实施例2、13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的配制。供试药剂40%嘧霉胺EC由江苏南京格色尔化工实业有限公司生产提供。600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由江苏省苏科农化有限责任公司生产提供。助剂NNO(亚甲基二萘磺酸钠)。填充辅料轻质碳酸牵丐将各组分按照重量百分比备料40%嘧霉胺EC:32.5%;600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂16.7%;助剂NNO:8%;轻质碳酸钙42.8%。制备过程将嘧霉胺、枯草芽孢杆菌按上述比例置于混合器中，加入NNO(亚甲基二萘磺酸钠)，用轻质碳酸钙填充至100%，所有物料在混合器中混合均匀后，经气流粉碎机粉碎2次，即成13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。实施例3、10%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌水悬浮剂的配制。40%嘧霉胺EC和600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的来源与实施例2相同。助剂选择木质素磺酸钠、0P-10;CMC;有机硅酮；乙二醇。溶剂选择水。将各组分按照重量百分比备料40%嘧霉胺EC:25%;600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂16.7%;木质素磺酸钠9%;OP-IO:4%;增稠剂CMC:1%;消泡剂有机硅酮0.01%;防冻剂乙二醇5%;水适量。制备过程将嘧霉胺、枯草芽孢杆菌、木质素磺酸钠、0P-10、增稠剂CMC、消泡剂有机硅酮、防冻剂乙二醇按上述比例置于反应釜中，用水加至100%混合均匀，再将混合物引入砂磨机中碾磨至物料细度为l-5ym;碾磨后混合均匀即成水悬浮剂。实施例4、13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨黑斑病菌菌丝生长的增效作用测定。供试菌株梨黑斑病菌，由江苏省农科院植保所提供。被测药剂由实施例2提供的13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。对比药剂40%嘧霉胺EC(江苏南京格色尔化工实业有限公司提供)；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(江苏省苏科农化股份有限公司生产提供)。室内增效生物测定将40%嘧霉胺EC配成0.01iig/ml、0.1iig/ml、liig/ml、10iig/ml带药的PSA培养基平板；将600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂配成6X106枯草芽孢杆菌/ml、6X105枯草芽孢杆菌/ml、6X104枯草芽孢杆菌/ml、6X103枯草芽孢杆菌/ml带菌的PSA培养基平板；将13%嘧霉胺*100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，稀释1000倍、2500倍、5000倍、10000倍、20000倍，制备成带不同梯度药液的PSA培养基平板。再将梨黑斑病菌(直径7mm)接入带毒平板，嘧霉胺单剂和枯草芽孢杆菌单剂做对照，同时设立清水对照平板，待清水对照平板长满之时，测量菌落直径。计算抑制率抑制率(％)=[(对照菌落直径-药剂处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)]X100%将抑制率观察值转化为抑制率的等值偏差，以各处理的培养基中杀菌剂的浓度对数为X，以相应处理对病原菌菌丝生长抑制率的等值偏差为Y，应用统计回归方法，拟合出浓度对数_抑制百分率机率值毒力曲线，计算EC50值和SR。参考Wadley公式(增效指数SR=混合物的理论EC50/混合物的实测EC50，SR>1.5为增效作用，0.5《SR《1.5为相加作用，SR〈0.5为拮抗作用)。室内增效试验结果(表2)表明13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对梨黑斑病菌的增效系数为8.36，该复配组合表现出对梨黑斑病菌显著的增效作用。表213%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂抑制梨黑斑病菌菌丝生长的增效测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5、13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治果树黑斑病的田间小区效果。试验时间于2008年4月15日(梨树落花后)在江苏省农业科学院梨园内进行。试验品种黄金梨。试验药剂由实施例2提供的13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对比药剂40%嘧霉胺EC(江苏南京格色尔化工实业有限公司生产提供)；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(江苏省苏科农化股份有限公司生产提供)。田间药效试验采用喷雾法防治梨黑斑病。梨树落花后(4月15日)每隔两周(15d)喷一次药。梨树整个生长期共需要打药4-5次。按每亩用量兑水400Kg均匀喷雾，每小区一亩(667m2);每个处理设2次重复，设保护行。6月上旬调查各个小区的梨黑斑病发病指数，每小区均调查四株，每株分东、南、西、北、中五点取样，每点取当年生枝条的20片叶调查。目测叶片的发病状况，根据病害症状描述，记载病情级别。计算防治效果。梨黑斑病病情分级标准如下0级无病斑1级病斑面积占整个叶面积的5%及以下；3级病斑面积占整个叶面积的5.1%-15%;5级病斑面积占整个叶面积的15.1%-33.3%;7级病斑面积占整个叶面积的33.4%-50%;9级病斑面积占整个叶面积的50.1%及以上。￡(各级病叶数x代表级值)病情指数二-X100调查总叶数x最高代表级值处理区平均病情指数防治效果(％)=(1--)X100对照区平均病情指数田间试验结果(表3)表明亩用量800克的13%嘧霉胺*100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对梨黑斑病的防治效果为76.05%;亩用量500克的13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对梨黑斑病的防治效果为60.06%。复配杀菌剂800克/亩的防治效果优于40%嘧霉胺乳油(亩用量500毫升)和600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(亩用量250克)的防治效果。表313%嘧霉胺*100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治梨黑斑病的田间小区效果小区处理亩用量(400公斤药液计)稀释倍数有效含量黑斑病病指防效(％)40%啼霉胺EC500毫升1:800200毫升6,5467.83600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂250克1:1600250克8.2959.2213%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌口J湿性粉剂800克1:500104克嘧霉胺+133克600亿枯草芽孢杆菌4.8776.05500克1:■65克嘧霉胺+83克600亿枯草芽孢杆菌8.1260.06空白对照///20.33/实施例6、13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂和10%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌水悬浮剂防治果树黑斑病的田间小区效果。试验时间于2009年4月20日(梨树落花后)在丰县孙楼镇大洼村一承包户的梨园内进行。试验品种黄金梨。试验药剂由实施例2提供的13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂、实施例3提供的10%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌水悬浮剂。对比药剂40%嘧霉胺EC(江苏南京格色尔化工实业有限公司生产提供)；600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(江苏省苏科农化股份有限公司生产提供)。田间药效试验采用喷雾法防治梨黑斑病。病情分级标准、病指和防效计算与实施例5相同。田间试验结果(表4)表明13%嘧霉胺100亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂亩用量800克，对梨黑斑病的防治效果分别为81.66%;亩用量500克，对梨黑斑病的防治效果分别为62.39%。复配杀菌剂800克/亩的防治效果优于40%嘧霉胺乳油(亩用量500毫升)和600亿枯草芽孢杆菌(亩用量250克)的防治效果。10%嘧霉胺*100亿枯草芽孢杆菌水悬浮剂亩用量800毫升，对梨黑斑病的防治效果为76.43%，与对照单剂40%嘧霉胺乳油(亩用量500毫升)防治效果相当，优于600亿枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(亩用量250克)的防治效果。表4枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂防治梨树黑斑病的田间小区效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>/权利要求一种枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂或填充辅料，其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和嘧霉胺组成，在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为10-90％。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于助剂为农药中常规助剂，溶剂或填充辅料为农药中常规溶剂或常规填充辅料；在成品药剂中助剂重量百分比为120%，溶剂或填充辅料所占的重量百分比为1075%。3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂的剂型为水悬浮剂，或可湿性粉剂。4.一种如权利要求1所述复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树真菌病害。5.根据权利要求4所述的复配杀菌剂的应用，其特征在于所述的果树真菌病害是梨黑斑病。6.根据权利要求4或5所述的复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释5001500倍，稀释后的有效药物成分含量至少为532.5mg/L。全文摘要本发明涉及一种枯草芽孢杆菌嘧霉胺复配杀菌剂，成品药剂包括有效活性成分、助剂以及溶剂或填充料。其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为10～85％，所述的有效活性成分由枯草芽孢杆菌和嘧霉胺组成。在有效活性成分中，枯草芽孢杆菌的重量百分比为10-90％。应用时，将成品药剂稀释后喷洒在果树上用于防治果树黑斑病。其优点在于将枯草芽孢杆菌sf-628和化学药剂嘧霉胺按一定比例混合使用，能充分发挥微生物和化学药剂的协同作用，达到优势互补，提高防治效果的目的；同时减少化学药剂用药量、降低用药成本、减少化学药剂在果品中的残留量、改善了果园生态环境。文档编号A01N43/54GK101700041SQ20091023493公开日2010年5月5日申请日期2009年11月20日优先权日2009年11月20日发明者刘永锋,刘邮洲,陈志谊申请人:江苏省农业科学院