专利名称：产生ω-3脂肪酸的酶和方法
技术领域：
本发明涉及在重组细胞(例如酵母或植物细胞)中合成长链多不饱和脂肪酸(特别是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本发明还提供产生长链多不饱和脂肪酸的重组细胞或植物。此外，本发明涉及一组新的酶，它们具有去饱和酶或延长酶活性，可用于合成长链多不饱和脂肪酸的方法。具体地，本发明提供具有新活性的ω 3 去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6去饱和酶。本发明还提供用于以多种基因瞬时和/或稳定转化细胞(特别是植物细胞)的方法和DNA构建体。
背景技术：
现在广泛认为ω -3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA和VLC-PUFA)是关乎人和动物健康的重要化合物。可从膳食来源或通过转换亚油酸(LA，18:2gj6)或α-亚麻酸(ALA， 18:3 ω 3)而获得这些脂肪酸，LA和ALA被认为是人类膳食中的必需脂肪酸。尽管人和许多其他脊椎动物能够将植物来源的LA或ALA转换为VLC-PUFA，但这种转换的速率很慢。此外， 大多数现代社会的饮食不平衡，其中至少90%的多不饱和脂肪酸(PUFA)是ω6脂肪酸，而非理想的4 1或更低的ω6 ω 3脂肪酸的比例(Trautwein，2001)。对于人类，VLC-PUFA 例如二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6co3)的直接来源主要是来自鱼类或鱼油。因此，健康专家们推荐将含有高水平VLC-PUFA的鱼类常规纳入人类饮食。 例如，来源于鱼类的VLC-PUFA油被越来越多地添加到食品和婴儿配方奶中。不过，鉴于全球和国家鱼业的下滑，需要找到这些有益健康的油类的替代来源。与动物不同，高等植物不能合成链长超过18个碳原子的多不饱和脂肪酸。具体地，农作物和园艺植物以及其他被子植物不具有合成长链ω 3脂肪酸例如衍生自ALA的 ΕΡΑ、二十二碳五烯酸(DPA，22:5co3)和DHA所需的酶。因此，植物生物技术的一个重要目的是通过遗传工程学方法改造出产生大量VLC-PUFA的农作物，由此提供这些化合物的替代来源。VLC-PUFA牛物合成涂径生物体(例如微藻类、苔藓和真菌)中VLC-PUFA的生物合成通常是一系列的依赖氧的去饱和作用和延长反应(图1)。这些生物体中产生EPA的最常见的途径包括Δ 6-去饱和作用、Δ 6-延长作用和Δ 5-去饱和作用(称为Δ 6-去饱和作用途径)，较不常见的途径则使用Δ 9-延长作用、Δ 8-去饱和作用和Δ 5-去饱和作用(称为Δ 9-去饱和作用途径)。这些连续的去饱和作用和延长反应可以从ω6脂肪酸底物LA开始，见图1左上部分(ω6)，或从ω 3底物ALA开始，见图1右下部分(ω 3)。如果起始的Δ 6_去饱和作用在 ω 6底物LA上进行，该系类三种酶的VLC-PUFA产物会是ω 6脂肪酸ARA。合成VLC-PUFA的生物体可利用ω3_去饱和酶将ω6脂肪酸转换为ω 3脂肪酸，如图1所示的将花生四烯酸 (ARA，20:4 ω 6)转换为EPA的Δ17-去饱和酶步骤。ω 3_去饱和酶家族的一些成员可作用于从LA到ARA的大量底物。植物ω 3_去饱和酶通常特异性催化由LA到ALA的Δ 15-去饱和作用，而真菌和酵母ω 3-去饱和酶对由ARA到EPA的Δ 17-去饱和作用具有特异性(Pereira等，200 ；Zank等，200 。一些报道提示可能存在非特异性的ω 3_去饱和酶，可将多种ω 6底物转换为相应的ω 3产物(Siang等，2007)。其他ω 3_去饱和酶可对ω3底物具有偏向性(Sayanova等，2003)。在这些生物体中，EPA转换为DHA相对简单，包括通过Δ 5_延长作用由EPA产生 DPA，随后通过Δ 4-去饱和作用产生DHA (图1)。相反，哺乳动物则利用所谓的“Sprecher” 途径，通过不依赖于Δ 4去饱和酶的3个分开的反应将DPA转换为DHA (Sprecher等，1995)。前端去饱和酶通常存在于植物、苔藓、微藻类和低等动物(例如秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans))中，主要接受与磷酯酰胆碱(PC)底物的sn-2位置发生酯化的脂肪酸底物。这些去饱和酶因此称为酰基-PC脂质连接的前端去饱和酶(Domergue等， 2003)。相反，高等动物前端去饱和酶通常接受酰基辅酶A底物，其中脂肪酸底物连接于CoA 而非 PC (Domergue 等，2005)。PUFA和VLC-PUFA延长反应各自包括由多组分蛋白复合体催化的4个步骤首先，缩合反应给脂肪酸加上来自丙二酰-CoA的2C单元，导致形成β -酮酰基中间体，然后通过NADPH将其还原，随后脱水产生烯醇基中间体，该中间体最后被再次还原，产生延长的脂肪酸。通常认为这4个反应中的缩合步骤具有底物特异性，而其他步骤则不具有。在实践中，这意味着，只要引入对VLC-PUFA具有特异性的缩合酶(典型地称为“延长酶”)， 植物中的天然延长机制便能够延长VLC-PUFA，只不过植物中的天然延长机制延长非天然 VLC-PUFA底物的效率可能是低的。2007年鉴定并表征了酵母延长作用循环脱水酶(Denic and Weissman,2007) ο在植物、苔藓和微藻类中，VLC-PUFA去饱和作用天然发生在主要属于酰基-PC库的脂肪酸底物，而延长作用则发生在酰基-CoA库的底物。脂肪酸从酰基-PC分子转移至 CoA载体是由磷脂酶类(PLA)进行的，而酰基-CoA脂肪酸转移至PC载体是由溶血卵磷脂酰基转移酶类(LPCAT)进行的(图2) (singh等，2005)。在去饱和作用可以跟上延长作用之前必需发生酰基交换(反之亦然)，由此引起的流量下降可通过使用对酰基辅酶A底物具有特异性的去饱和酶而克服(Hoffmann等，2008)。遗传工程化产生VLC-PUFA绝大多数VLC-PUFA代谢工程一直采用需氧Δ 6_去饱和作用/延长作用途径进行。1996年首次报道了使用来自蓝细菌集胞藻(Synechocystis)的Δ 6_去饱和酶在烟草中生物合成Y-亚麻酸(GLA，18:3 ω 6) (Reddy and Thomas，1996)。最近，已经在农作物例如向日葵(73% GLA ;Knauf等，2006)和大豆(28% GLA ；Sato等，2004)中产生GLA。由于涉及更多的去饱和作用和延长作用步骤，因此产生VLC-PUFA例如EPA和DHA涉及更复杂的工程化。饥等O004)最早报道了在陆生植物中产生EPA，其将编码来自球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ 9_延长酶的基因、编码来自小眼虫(Euglenagracilis)的Δ8-去饱和酶的基因、和编码来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的Δ 5_去饱和酶的基因引入拟南芥， 产生高达3%的ΕΡΑ。随后Abkidi等Q004)报道了使用编码来自小立碗藓(Pyscomitrella patens)的Δ 6_去饱和酶和Δ 6_延长酶的基因和编码来自三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的Δ 5-去饱和酶的基因在亚麻子中产生了高达0. 8%的EPA。WO 04/017467首次报道了产生DHA，并迄今为止其报道的产生VLC-PUFA的水平是最高的，其描述通过引入编码异丝水霉(Saprolegnia diclina) Δ 6_去饱和酶、高山被孢霉Δ 6-去饱和酶、高山被孢霉Δ 5-去饱和酶、异丝水霉Δ 4-去饱和酶、异丝水霉Δ 17-去饱和酶、高山被孢霉Δ 6-延长酶和路氏巴夫藻(Pavlova lutheri) Δ 5_延长酶的基因，在大豆胚(而非种子)中产生了 3%的DHA。在也产生DHA的胚中，最高EPA水平是19.6%，说明EPA转换为DHA的效率低下(W0 2004/071467)。这一发现与Robert等Q005)发表的结果类似，后者的从EPA到DHA的流量低下，其使用鲐(Danio rerio) Δ 5/6-去饱和酶、秀丽隐杆线虫Δ 6-延长酶、和盐生巴夫藻(Pavlova salina) Δ 5_延长酶和Δ 4_去饱和酶，在拟南芥中产生了 3% EPA和0. 5% DHA。也在2005, et al.报道使用畸雌腐霉(Pythium irregulare) Δ 6-去饱和酶、破囊壶菌(Thraustochytrid) Δ 5_去饱和酶、小立碗藓Δ6-延长酶、金盏花(Calendula off icianalis) Δ 12-去饱和酶、破囊壶菌Δ 5_延长酶、致病疫霉 (Phytophthora infestans) Δ 17-去饱禾口酶、虹鱒(Oncorhynchus mykiss) VLC-PUFA 延长酶、破囊壶菌八4-去饱和酶和破囊壶菌^^々1\在芥菜(Brassica juncea)中产生了 25% ARAU5% EPA 禾口 1. 5% DHA(Wu 等，2005)。因此仍需要在重组细胞中，特别是在油料种子植物的种子中更加高效地产生 LC-PUFA。
发明内容
本发明人首次鉴定到了能够在重组细胞中将EPA高效转换为DPA的Δ 5延长酶。因此，本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有Δ5延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中当所述延长酶由所述细胞、优选植物细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述延长酶对EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率产生DPA。在一个实施方式中，所述延长酶包含SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述细胞还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 8去饱和酶和/或Δ 6去饱和酶，ii) Δ9延长酶和/或Δ6延长酶，iii)A5去饱和酶，和iv)任选存在的Δ 4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。本发明人还鉴定到了具有新特性的ω 3去饱和酶。所述ω 3去饱和酶可用于为产生ΕΡΑ、下游脂肪酸DPA和DHA、以及其他ω 3VLC-PUFA而设计的重组途径中。因此，本发明提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有ω3去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAJf DGLA去饱和化为ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。所述去饱和酶优选地是前端去饱和酶。
在另一个实施方式中，所述去饱和酶对酰基链中具有至少三个碳碳双键的C20脂肪酸、优选ARA具有Δ 17去饱和酶活性。在另一个实施方式中，所述去饱和酶对酰基链中具有三个碳碳双键的C18脂肪酸、优选GLA具有Δ 15去饱和酶活性。所述去饱和酶优选地对酰基辅酶A底物的活性高于对相应的酰基-PC底物的活性。在一个实施方式中，所述酰基辅酶A底物是ARA-CoA，而所述酰基-PC底物包含位于的PC的sn-2位置的ARA。在另一个实施方式中，所述细胞是植物细胞，且当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶对ARA具有活性，以至少40%的效率产生EPA。在一个具体的实施方式中，所述去饱和酶包含SEQ ID N0:15、17或20所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :15具有至少35%相同性的氨基酸序列、与SEQ ID NO :17具有至少60%相同性的氨基酸序列和/或与SEQ ID NO :20具有至少60%相同性的氨基酸序列。此外，本发明人鉴定到了编码一种Δ6去饱和酶的基因，所述Δ6去饱和酶在植物和/或酵母中对ω3脂肪酸底物的转换效率高于对ω6脂肪酸底物的转换效率。该Δ6去饱和酶还表现出Δ8去饱和酶活性。与对ω3去饱和的脂肪酸底物不具有偏向性的去饱和酶相比，在植物的重组LC-PUFA途径中使用该Δ 6去饱和酶或其他对ω 3去饱和的脂肪酸底物具有高特异性的去饱和酶提高了 EPA、DPA和DHA的水平。因此，本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有Δ6去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶进一步具有至少两种、优选全部三种以下特性i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性， 优选地在植物细胞中是这样，ii)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ETrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有△ 6去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶对ω3底物的活性高于对相应的ω6底物的活性，且其中当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶对ALA具有活性，以至少5%、至少7. 5%、或至少10%的效率产生SDA，或当所述去饱和酶在酵母细胞中表达时，其以至少35%的效率产生 SDA。在一个实施方式中，所述去饱和酶对脂肪酸底物ALA的Δ6去饱和酶活性高于对 LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。所述Δ 6去饱和酶优选地对ALA底物的Δ 6去饱和酶活性是对LA的至少大约2 倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍，优选地在植物细胞中是这样。在另一个实施方式中，所述Δ 6去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接至PC的sn-2位置的ALA的活性，优选地在植物细胞中是这样。
所述Δ 6去饱和酶优选地对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性是对作为脂肪酸底物的连接至PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性的至少大约5倍或至少10-倍，优选地在植物细胞中是这样。所述Δ 6去饱和酶优选地是前端去饱和酶。在另一个实施方式中，本发明的细胞还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 6 延长酶，ii) Δ 5去饱和酶，iii)A5 延长酶，和iv)任选存在的Δ 4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。本发明细胞中的所述Δ 6去饱和酶优选地对ETA不具有可检测到的Δ 5去饱和酶活性。所述Δ 6去饱和酶优选地包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :10具有至少77%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述Δ 6去饱和酶包含SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列并具有Δ 8去饱和酶活性。本发明人还发现，表达Δ 9延长酶、Δ 8去饱和酶和Δ 5去饱和酶的重组细胞能够更高效地将脂肪酸底物转换为EPA、DPA和DHA。因此，本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 9 延长酶，ii) Δ 8去饱和酶，iii)A5 去饱和酶，iv)任选存在的Δ 5延长酶，和ν)如果存在Δ 5延长酶，则任选存在的Δ 4去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，且其中所述细胞内的总脂肪酸有至少15%、至少20%、或至少25%在它们的酰基链中包含至少20个碳和至少3个碳碳双键。在一个实施方式中，本发明细胞内脂肪酸中的ARA、EPA、DPA和DHA总计占所述细胞内的总脂肪酸的至少15%、至少20%、或至少25%。在进一步的实施方式中，本发明的细胞将油酸转换为二十碳烯酸(C20:l)的能力与野生型植物相比是降低的，和/或在所述细胞中有低于5%的油酸被转换为二十碳烯酸。在一个具体的实施方式中，所述细胞内的总脂肪酸具有低于1 %的C20 1。在进一步的实施方式中，本发明的细胞与野生型细胞相比具有降低的内源性Δ 15 去饱和酶活性，和/或所述细胞中有低于10%的LA被转换为ALA。在一个具体的实施方式中，所述内源性Δ 15去饱和酶对酰基-PC底物的活性高于对相应的酰基辅酶A底物的活性，优选地其中所述酰基是LA。
在进一步的实施方式中，本发明的细胞与缺乏所述外源性多核苷酸的相应细胞相比，其将GLA转换为SDA和/或将ARA转换为EPA的转换是增加的。在一个实施方式中，本发明的细胞内脂肪酸中的DHA的量占所述细胞内的总脂肪酸的至少3%、至少5%、或至少10%。在另一个实施方式中，在本发明的细胞内，LA转换为ARA和/或ALA转换为EPA的转换效率是至少80%或至少90%。在一个实施方式中，所述Δ 9延长酶包含SEQ ID NO 22所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :22具有至少80%相同性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，所述Δ 8去饱和酶包含SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO : 具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述Δ 5去饱和酶包含SEQ ID NO 26或SEQ IDNO 13所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID N0J6和/或SEQ ID Ν0:13具有至少 80%相同性的氨基酸序列。本发明人已经获得的结果表明，可以利用表达所述Δ6-去饱和酶、Δ6延长酶、 Δ 5去饱和酶、Δ 5延长酶、和Δ 4去饱和酶的一组基因、或类似的(特别是其中所述去饱和酶对酰基辅酶A底物具有活性的)一组基因，来合成显著水平的EPA、DPA和DHA。因此，本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ6延长酶和/或Δ9延长酶，ii) Δ 6去饱和酶和/或Δ 8去饱和酶，iii)A5 去饱和酶，iv) Δ 5 延长酶，ν) Δ 4去饱和酶，和vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，特征在于具有一种或多种或全部以下特性a)将ALA转换为EPA、DPA或DHA的转换效率是至少17. 3%、或至少23%，b)将ALA转换为DPA或DHA的转换效率是至少15. 4%、或至少21 %，c)将ALA转换为DHA的效率是至少9. 5%、或至少10. 8%，禾口d)将EPA转换为DHA的效率是至少45%、或至少50%，且优选地进一步特征在于所述细胞内总脂肪酸中有至少4%是DHA。优选地，掺入到细胞内的三酰基甘油中的总脂肪酸中有至少6%、至少11%或至少 15% 是 DHA。在一个实施方式中，DHA构成所述细胞内SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的总和的 20-65 %，优选地为 40-65 %。优选地，细胞内的ω3脂肪酸中的0. 1-25%是SDA、0. 1-10%是ΕΤΑ、0. 1-60%是 EPA, 0. 1-50%是DPA、且30-95%是DHA，更优选地，所述细胞内的ω3脂肪酸中的0. 1-25% 是 SDA、0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA 和 40-95%是 DHA。所述Δ 4去饱和酶优选地包含SEQ ID NO :73所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :73具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一个方面，本发明提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ6延长酶和/或Δ9延长酶，ii) Δ6去饱和酶和/或Δ8去饱和酶，iii)A5 去饱和酶，iv) Δ 5延长酶，和ν)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，特征在于具有一种或多种或全部以下特性a)将ALA转换为EPA或DPA的转换效率是至少17. 3%、或至少23%，和b)将ALA转换为DPA的效率是至少15. 4%、或至少21 %，且优选地进一步特征在于所述细胞内的总脂肪酸中有至少4%是DPA。优选地，掺入到细胞内的三酰基甘油中的总脂肪酸中有至少6%、至少11%或至少 15% 是 DPA。优选地，DPA构成细胞内SDA、ETA、EPA和DPA的总量的20-65 %，更优选地 40-65%。优选地，细胞内的ω3脂肪酸中的0. 1-35%是SDA、0. 1-15%是ΕΤΑ、0. 1-60%是 EPA、而30-75%是DPA，更优选地，细胞内的ω 3脂肪酸中的0. 1-35%是SDA、0. 1-15%是 ETA,0. 1-50%是 EPA 而 40-75%是 DPA。在一个实施方式中，所述Δ 6延长酶包含SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述Δ 6去饱和酶包含SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述Δ 5去饱和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO J6具有至少80%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述Δ 5延长酶包含SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述二酰基甘油酰基转移酶包含SEQ ID Ν0:75或SEQ ID NO 108所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDN0:75和/或SEQ ID NO :108具有至少80%相同性的氨基酸序列。本发明显然涵盖任何两种、三种、四种或全部上述酶的组合。在另一个实施方式中，本发明的细胞、优选地植物细胞、且更优选地植物种子细胞，还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 17去饱和酶，ii) Δ 15去饱和酶，和/或iii)A12 去饱和酶其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，
在另一个实施方式中，本发明的细胞中由外源性多核苷酸表达的一种或多种或全部所述去饱和酶对酰基辅酶A底物的活性高于对相应的酰基-PC底物的活性。在具体的实施方式中，所述Δ6去饱和酶和Δ5去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶、Δ 6去饱和酶和Δ 4去饱和酶、或全部三种所述Δ6去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ4去饱和酶、或在每一上述这些组合的基础上额外加上任何Δ 17去饱和酶、Δ 15去饱和酶和/或Δ 12去饱和酶，均对它们的酰基辅酶A底物的活性高于对相应的酰基-PC底物的活性。在这一实施方式中，细胞中由外源性多核苷酸表达的其他去饱和酶对酰基辅酶A底物的活性可高于或不高于对相应的酰基-PC底物的活性。可以理解，每种酶的优选的酰基辅酶A底物是不同的。本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有△ 6延长酶和△ 9延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中所述延长酶的Δ6延长酶活性高于Δ9延长酶活性。在一个实施方式中，所述延长酶转换SDA以产生ETA的效率是至少50%或至少 60%，和/或转换ALA以产生ETrA的效率是至少6%或至少9%。优选地，所述延长酶具有的Δ 6延长酶活性是Δ 9延长酶活性的至少大约6. 5倍。在另一个实施方式中，所述延长酶不具有可检测到的Δ5延长酶活性。延长酶优选地包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO 4具有至少55%相同性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述细胞还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 8去饱和酶和/或Δ 6去饱和酶，ii) Δ 5去饱和酶，iii)A5 延长酶，和iv)任选存在的Δ 4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有△ 5去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶包含SEQ ID NO :13所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID Ν0:13具有至少 53%相同性的氨基酸序列。本发明还提供重组细胞，优选地是植物细胞，更优选地是植物种子细胞，所述细胞包含编码具有△ 9延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中所述延长酶包含 SEQ ID NO :28、94和96中任一序列所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、与SEQ ID NO 观具有至少81%相同性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO: 94和/或SEQ ID NO: 96具有至少 50%相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述Δ 9延长酶包含SEQ ID NO 94或SEQ IDNO :96所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少50% 相同性的氨基酸序列，且其中所述延长酶对ω6底物的活性高于对相应的ω3底物的活性。 更优选地，所述Δ 9延长酶对ω 6底物(例如LA)的活性是对相应的ω 3底物(例如ALA) 的活性的至少2倍，更优选地至少4倍。在另一个方面，本发明提供一种重组细胞，其包含编码二酰基甘油酰基转移酶的外源性多核苷酸，其中所述二酰基甘油酰基转移酶包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、 其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :108具有至少讨％相同性的氨基酸序列。在本发明细胞的一个实施方式中，所述去饱和酶和/或延长酶、或多种去饱和酶和/或延长酶，可纯化自微藻类。优选的微藻类是巴夫藻(Pavlova spp)、塔胞藻 (Pyramimonas spp)禾口微胞藻(Micromonas spp)。在优选的实施方式中，本发明的细胞是真核细胞。例如所述细胞可以是植物细胞、 哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。所述细胞可以是组织培养物中的细胞、体外的细胞和/或分离的细胞。在一个实施方式中，所述细胞在植物中和/或是成熟的植物种子细胞。所述植物可以是田间的植物或作为植物部分收获的植物，或所述种子可以是收获的种子。在一个具体的实施方式中，所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。本领域人员可以理解，可以在同一细胞中共表达一或多种所定义的延长酶和/或去饱和酶。在进一步的实施方式中，本发明的细胞能够合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)， 其中所述衍生自不能合成所述LC-PUFA的细胞。本发明人还发现，共表达沉默阻抑物(silencing suppressor)可升高植物细胞内脂肪酸生物合成酶类的水平，特别是在从最初的转化植物重复繁殖数代之后。因此，在优选的实施方式中，本发明的细胞，优选地植物细胞，更优选地植物贮藏器官细胞或种子细胞， 包含编码沉默阻抑物的外源性多核苷酸。优选地，编码沉默阻抑物的外源性多核苷酸可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子。在一个实施方式中，所述植物贮藏器官特异性启动子是种子特异性启动子，或是优先在发育的种子中表达的子叶-特异性启动子或胚乳-特异性启动子。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码脂肪酸ω 3去饱和酶活性的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择能够进行以下至少一种去饱和作用的细胞将ARA去饱和化为EPAJf DGLA去饱和化为ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为 ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。在一个实施方式中，所选的细胞是本发明的细胞。具体地，所述细胞可进一步包含本申请所描述的去饱和酶和延长酶的组合。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码脂肪酸Δ 5延长酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述 LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择其中所述Δ 5延长酶对EPA具有活性并以至少60%、至少65%、至少70% 或至少75%的效率产生DPA的细胞。在本发明方法的一个实施方式中，所选的细胞是本发明的细胞。具体地，所述细胞可进一步包含本申请所描述的去饱和酶和延长酶的组合。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码脂肪酸Δ 6去饱和酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有至少两种、优选全部三种以下特性的细胞i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性， 优选地在植物细胞中是这样，ii)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ALA具有Δ 6去饱和酶活性并对KrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码脂肪酸Δ 6去饱和酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有Δ 6去饱和酶活性的细胞，所述Δ 6去饱和酶对ω 3底物的活性高于对相应的ω 6底物的活性，且所述Δ 6去饱和酶对ALA具有活性并以至少5%、至少7. 5%、 或至少10%的效率产生SDA，或当其在酵母细胞中表达时以至少35%的效率产生SDA。在一个实施方式中，所选的细胞是本发明的细胞。具体地，所述细胞可进一步包含本申请所描述的去饱和酶和延长酶的组合。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA 的细胞i) Δ 9 延长酶，ii) Δ 8去饱和酶，
iii)A5 去饱和酶，iv)任选存在的Δ5延长酶，和ν)如果存在Δ 5延长酶，则任选存在的Δ 4去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择其中总脂肪酸有至少15%、至少20%或至少25%在它们的酰基链中包含至少20个碳和至少3个碳碳双键的细胞。在一个实施方式中，所选的细胞是本发明的细胞。本发明还提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA 的细胞i) Δ6延长酶和/或Δ9延长酶，ii) Δ6去饱和酶和/或Δ8去饱和酶，iii)A5 去饱和酶，iv) Δ 5 延长酶，ν) Δ 4去饱和酶，禾口vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，C)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有一种或多种或全部以下特性的细胞1)将ALA转换为EPA、DPA或DHA的转换效率是至少17. 3%、或至少23% ；2)将ALA转换为DPA或DHA的转换效率是至少15. 4%、或至少21% ；3)将ALA转换为DHA的效率是至少9. 5%、或至少10. 8% ；禾口4)将EPA转换为DHA的效率是至少45%、或至少50% ；且优选地进一步特征在于所述细胞内总脂肪酸中有至少4%是DHA。在另一方面，本发明提供获得细胞、优选地植物细胞、更优选地植物种子细胞的方法，所述的细胞能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA 的细胞i) Δ6延长酶和/或Δ9延长酶，ii) Δ6去饱和酶和/或Δ8去饱和酶，iii)A5 去饱和酶，iv) Δ 5延长酶，和ν)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶
其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有一种或多种或全部以下特性的细胞a)将ALA转换为EPA或DPA的转换效率是至少17. 3%、或至少23%，和b)将ALA转换为DPA的效率是至少15. 4%、或至少21 %，且优选地进一步特征在于所述细胞内的总脂肪酸中有至少4%是DPA。在本发明的方法的一个实施方式中，所述外源性多核苷酸稳定整合到所述细胞的基因组中。在另一个实施方式中，所述方法还包括从步骤a)的细胞再生转化植物的步骤。在进一步的实施方式中，所述外源性多核苷酸在所述细胞中瞬时表达。在一个实施方式中，所述细胞是植物的叶细胞。本发明还提供选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶；ii)将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性；iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有ω 3去饱和酶活性并能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAjf DGLA去饱和化为ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。在所述方法的一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :15具有至少 35%的相同性、与SEQ ID NO: 17具有至少60%的相同性、和/或与SEQ ID NO 20具有至少60%的相同性。本发明还提供选择参与脂肪酸延长作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸延长酶，ii)将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸延长作用的核酸分子所述多肽具有Δ 5延长酶活性且其转换EPA产生DPA的效率是至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。在一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO 6具有至少47%的相同性。本发明还提供选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶，
ii)将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有Δ 6去饱和酶活性并具有至少两种、优选全部三种以下特性a)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性， 优选地在植物细胞中是这样，b)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和c)对ALA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。在所述方法的一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID Ν0:10具有至少 77%的相同性和/或与SEQ ID NO :8具有至少67%的相同性。本发明还提供选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶，ii)将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有Δ 6去饱和酶活性和Δ 8去饱和酶活性。在一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO 8具有至少67%的相同性。在另一个实施方式中，本发明的方法的步骤(ν)包括选择编码对酰基辅酶A底物具有活性的去饱和酶的核酸分子或编码前端去饱和酶的核酸分子。本发明还提供本文中所定义的外源性多核苷酸的组合，当它们用于产生重组细胞时，它们在重组细胞中表达至少两种脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶的组合、和/或在重组细胞中产生LC-PUFA。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ5延长酶，其中当由外源性多核苷酸在细胞中表达时，所述延长酶对EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率产生DPA。在一个实施方式中，所述△ 5延长酶的特征在于具有本文所定义的任何一或多种特性。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸ω3去饱和酶，当由外源性多核苷酸在细胞中表达时，其能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAjf DGLA 去饱和化为ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ΕΤΑ、 将ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。在一个实施方式中，本发明的ω 3去饱和酶的特征在于具有本文所定义的任何一或多种特性。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6去饱和酶，其中所述去饱和酶进一步具有至少两种、优选全部三种以下特性i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性， 优选地在植物细胞中是这样，ii)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的Sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ETrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6去饱和酶，其中所述去饱和酶对ω 3底物的活性高于对相应的ω 6底物的活性，且其中所述去饱和酶对ALA具有活性，当所述去饱和酶由外源性多核苷酸在细胞中表达时以至少5%、至少7. 5%、或至少10%的效率产生SDA，或当其在酵母细胞中表达时以至少35%的效率产生SDA。在一个实施方式中，本发明的△ 6去饱和酶的特征在于具有本文所定义的任何一或多种特性。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6延长酶和Δ9延长酶，其中所述延长酶的△ 6延长酶活性高于△ 9延长酶活性。在一个实施方式中，本发明的Δ6延长酶和Δ 9延长酶的特征在于具有本文所定义的任何一或多种特性。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ 5去饱和酶，其包含SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :13具有至少53%相同性的氨基酸序列。本发明还提供基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ 9延长酶，其包含SEQID NO :28、 94和96任一所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、与SEQID NO 具有至少81 %相同性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO: 94和/或SEQ ID NO :96具有至少50%相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述Δ 9延长酶包含SEQ ID NO 94或SEQ ID NO 96所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少50% 相同性的氨基酸序列，且其中所述延长酶对ω6底物的活性高于对相应的ω3底物的活性。在另一个方面，本发明提供基本上纯化的和/或重组二酰基甘油酰基转移酶，其包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :108具有至少
相同性的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明的去饱和酶或延长酶可纯化自微藻类。优选的微藻类是巴夫藻、塔胞藻和微胞藻。本发明还提供分离的和/或外源性多核苷酸，其包含i)选自 SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129
中任一序列的核苷酸序列，ii)编码本发明的去饱和酶或延长酶的核苷酸序列，iii)与 SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129
所示的一或多种序列具有至少50%相同性的核苷酸序列，和/或iv)在严格性条件下与i)至iii)中任一序列杂交的序列。在一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :1 具有至少57%相同性的核苷酸序列，并编码Δ6延长酶。在另一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 18禾口 /或SEQ ID NO 19具有至少50%相同性的核苷酸序列， 并编码ω 3去饱和酶。在另一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQ ID NO 5和 /或SEQ ID NO :1 具有至少50%相同性的核苷酸序列，并编码Δ5延长酶。在一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 9, SEQ ID N0:11和/或SEQ ID NO :125具有至少75%相同性的核苷酸序列，并编码Δ 6去饱和酶。在另一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQID Ν0:12具有至少60%相同性的核苷酸序列，并编码Δ 5去饱和酶。在另一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQ ID NO ,21, SEQ ID NO :29、SEQ ID NO 93和/或SEQ ID NO 96具有至少50%相同性的核苷酸序列， 并编码Δ 9延长酶。在另一个实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸包含与SEQID NO :107具有至少60%相同性的核苷酸序列，并编码二酰基甘油酰基转移酶。在一个具体的实施方式中，所述分离的和/或外源性多核苷酸与SEQID NO :3、5、 7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129 所示序列之一具有至少 80%、或至少90 %、或至少95 %、或至少99 %的相同性。本发明还提供用于整合到和/或已整合到植物细胞基因组中的DNA构建体，所述构建体包含一簇至少三个编码调控植物细胞内脂肪酸合成的蛋白质的可读框，优选地每一蛋白质是脂肪酸去饱和酶或脂肪酸延长酶，其中具有相同转录方向的各可读框间隔至少 750bp、至少1，OOObp或至少l，250bp，且至少有两个可读框具有不同的转录方向，其中每一可读框可操纵地连接于在植物细胞中具有活性的启动子，且每一启动子可独立地是相同的或不同的。优选地，所述DNA构建体中至少有两个启动子是不同的。一或多个或每一所述可读框优选地可操纵地连接于异源性5’前导序列，每一前导序列可独立地是相同的或不同的，其中与特定可读框的天然存在的5’前导序列相比，每一异源性5’前导序列使翻译效率提高。在本发明的DNA构建体中，所述异源性5’前导序列优选地是烟草花叶病毒 (TMV) 5’前导序列。在本发明的DNA构建体中，所述蛋白质优选地是延长酶和/或去饱和酶，更优选地是本申请所述的组合。在另一个实施方式中，本发明的DNA构建体仅具有三个或四个被翻译成蛋白质的可读框。本发明还提供载体，其包含本发明的多核苷酸和/或本发明的DNA构建体。优选地，所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。本发明还提供产生本发明的去饱和酶或延长酶的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达本发明的多核苷酸、本发明的DNA构建体和/或本发明的载体。
本发明人还令人惊异地发现，可将至少三种独立的包含不同外源性多核苷酸的染色体外转移核酸瞬时转染至真核细胞内并可组合检测细胞内每一外源性多核苷酸的活性。 因此，在另一方面，本发明还提供以至少三种不同的外源性多核苷酸瞬时转染真核细胞的方法，所述方法包括i)获得至少a)第一细菌，其包含包含第一外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，b)第二细菌，其包含包含第二外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，和c)第三细菌，其包含包含第三外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，和ii)将所述细胞与步骤i)的细菌接触，其中每一染色体外转移核酸从细菌转移至细胞中以产生瞬时转染的细胞，其中每一外源性多核苷酸包含在所述细胞中具有活性的启动子，其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的，且其中至少有一种外源性多核苷酸编码沉默阻抑物。可以一或多种所述细菌依次或同时进行步骤ii)。例如，细胞可以接触第一细菌， 然后接触第二细菌，等等。在另一实例中，细菌同时接触各种细菌，优选地为所述细菌的混合物。不同细菌的浓度可彼此不同或可以是相同的或相近的。所述细菌可以是混合的分离物(pooled isolates)，例如包含来自菌株文库的多种分离物。在一个实施方式中，所述方法还包括获得所述细胞然后使所述细胞接触一或多种额外的细菌，每一细菌包含包含不同外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。例如，在一个实施方式中，所述方法包括获得所述细胞然后使所述细胞接触第四细菌，所述第四细菌包含包含第四外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。在另外一实施方式中，所述方法包括获得所述细胞然后使所述细胞接触第五细菌，所述第五细菌包含包含第五外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。在另外一实施方式中，所述方法包括获得所述细胞然后使所述细胞接触第六细菌，所述第六细菌包含包含第六外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。在另外一实施方式中，所述方法包括获得所述细胞然后使所述细胞接触第七细菌，所述第七细菌包含包含第七外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。在又一实施方式中，所述方法包括获得所述细胞然后使所述细胞接触第八细菌，所述第八细菌包含包含第八外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。优选地，所述的不同外源性多核苷酸编码不同RNA分子和/或多肽。在一个实施方式中，每一外源性多核苷酸编码形成酶途径的一部分的酶或是此种酶的候选物。上述方面特别可用于研究形成大的和/或复杂的生物学途径的多核苷酸和/或多肽。因此，在优选的实施方式中，每一外源性多核苷酸编码酶或是此种酶的候选物，所述酶参与脂肪酸合成、脂肪酸修饰、二酰基甘油组装、三酰基甘油组装、或其中两种或更多种的组合。在一个实施方式中，一或多种所述细菌的形式是原生质体。可用于本发明的细菌的实例包括，但不限于，土壤杆菌、根瘤菌、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、 百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium Ioti)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍舌L沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、 单核细胞增多性李司忒菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假结核病耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica)。可用于本发明的染色体外转移核酸的实例包括，但不限于，P-DNA、土壤杆菌、 T-DNA、或它们的组合。优选地，上述方面的细胞是植物细胞或哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞是组织或器官的一部分。在另一个实施方式中，所述细胞是植物细胞，所述组织或器官是叶、茎、根、分生组织、愈伤组织、或胚珠。本发明人还确定了，如果启动子是种子特异性启动子，外源性多核苷酸在叶细胞中的表达可共表达种子特异性转录因子(例如多叶子叶2(leafy cotyledon 2)、视褐质 3(fusca3)或脱落酸敏感3(abscisic acid_senstive3))而增强。多叶子叶2蛋白的实例包括，但不限于，WO 01/70777中所述的那些。因此，在优选的实施方式中，所胡植物细胞是植物的叶细胞，至少一种所述启动子是种子特异性启动子，且至少一种所述外源性多核苷酸编码种子特异性转录因子例如多叶子叶2。在一个实施方式中，所述外源性多核苷酸无一是病毒基因。在一个实施方式中，一或多种所述外源性多核苷酸在所述染色体外转移核酸中仅以所述核酸序列的单拷贝形式存在，而不是所述核酸序列的多聚体或部分多聚体。在另一个实施方式中，至少一种所述染色体外转移核酸不包括在所述细胞中具有功能的复制起始点，优选地不是病毒复制起始点，更优选地不是FBNYV复制起始点。在另一个实施方式中，所述外源性多核苷酸无一编码病毒复制酶或病毒移动蛋白，例如WO 2007/137788和Marillonnet等Q005)所述的那些。本发明还提供筛选瞬时转染的细胞的所需活性的方法，所述方法包括以至少三种本发明的外源性多核苷酸瞬时转染真核细胞，并测试所述细胞的所需活性。本发明人还发现，通过以不同的染色体外转移核酸来提供6种以上不同基因，可增强所述6种以上不同基因对细胞、特别是植物细胞的转染。因此，在另一方面，本发明提供以至少六种不同的外源性多核苷酸转化真核细胞的方法，所述方法包括i)获得至少a)第一细菌，其包含第一染色体外转移核酸，所述第一染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，和b)第二细菌，其包含不同于所述第一染色体外转移核酸的第二染色体外转移核酸，所述第二染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，ii)将所述细胞与步骤i)的细菌接触，和iii)任选地选择被所述第一和第二染色体外转移核酸的外源性多核苷酸稳定转化的细胞，其中每一所述第一和第二染色体外转移核酸的外源性多核苷酸由所述细菌转移至所述细胞中以产生转化的细胞，其中每一所述外源性多核苷酸包含启动子，所述启动子在所述细胞中或可由其衍生的细胞中具有活性，且其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的。可以两种细菌依次或同时进行步骤i)a)和i)b)。例如，所述细胞可先接触第一细菌，然后接触第二细菌。与第二细菌接触的细胞可以是与第一细菌接触后的细胞的子代细胞或衍生自与第一细菌接触后的细胞。在另一实例中，所述细胞同时与这两种细菌接触。
在一个实施方式中，所述i)第一染色体外转移核酸只有3-6种、3-5种、3_4种、 4-6种、4-5种或5-6种不同的外源性多核苷酸，和ii)第二染色体外转移核酸只有3-6种、 3-5种、3-4种、4-6种、4-5种或5_6种不同的外源性多核苷酸。优选地，每一外源性多核苷酸编码多肽，且其中各多肽是不同的。在另一个实施方式中， i)第一染色体外转移核酸包含两种外源性多核苷酸，它们独立地编码选自如下一组的多肽Δ6去饱和酶、Δ 12去饱和酶和Δ 15去饱和酶，和ii)第二染色体外转移核酸包含编码多肽的外源性多核苷酸，所述多肽是该组中的第三种酶。优选地，所述细胞是植物细胞，且所述方法还包括从所述稳定转化的细胞再生转化植物的步骤。本发明还提供细胞，所述细胞是通过所述以至少三种本发明的外源性多核苷酸瞬时转染真核细胞的方法而产生的，或是通过所述以至少6种不同的本发明外源性多核苷酸转化真核细胞的方法而产生的。在又一方面中，本发明提供产生以至少六种不同的外源性多核苷酸稳定转化的植物的方法，所述方法包括i)获得包含第一外源性基因组区的第一种稳定转化植物，所述第一外源性基因组区包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸，ii)获得与所述第一种稳定转化植物具有性亲和性(sexually compatible)并包含第二外源性基因组区的第二种稳定转化植物，所述第二外源性基因组区不同于所述第一外源性基因组区并包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸，iii)使所述第一种稳定转化植物与所述第二种稳定转化植物杂交，和iv)选择由步骤iii)产生的包含所述第一和第二基因组区的植物或其子代，由此产生稳定转化植物，其中每一所述外源性多核苷酸包含启动子，所述启动子在植物中具有活性，且其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的。在优选的实施方式中，按照前述本发明的DNA构建体中所述来定向和间隔所述第一和/或第二外源性基因组区的外源性多核苷酸。在所述第一和第二外源性基因组区中，任一启动子序列可出现多次或仅出现一次，或者，在所述第一和第二外源性基因组区中，一或多种启动子可出现多次而一或多种其他启动子仅出现一次。每一植物启动子可独立地优先在所述植物的组织或器官中具有活性，例如，相对于其他组织或器官而言，在叶或种子中具有活性。这可使得所有引入的蛋白质编码区在所述植物器官或组织中同时表达或重叠表达。在并列的实施方式中，一或多种启动子在所述植物中组成型表达，而一或多种其他启动子优先在植物器官或组织中表达。在一个实施方式中，步骤i)包括通过以下步骤产生所述第一种稳定转化植物a)将植物细胞与包含第一染色体外转移核酸的第一细菌接触，所述第一染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，b)从步骤a)的植物细胞产生稳定转化植物，和任选地c)产生来自步骤b)的稳定转化植物的子代植物；和/或步骤ii)包括通过以下步骤产生所述第二种稳定转化植物，d)将植物细胞与包含第二染色体外转移核酸的第二细菌接触，所述第二染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，e)从步骤d)的植物细胞产生稳定转化植物，和任选地f)产生来自步骤e)的稳定转化植物的子代植物。在另一个方面，本发明提供产生以至少六种不同的外源性多核苷酸稳定转化的植物的方法，所述方法包括i)获得包含第一外源性基因组区的第一种稳定转化植物或植物部分，所述第一外源性基因组区包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸，ii)使所述第一种稳定转化植物或植物部分的细胞接触包含染色体外转移核酸的细菌，所述染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，iii)从所述细胞产生植物，和iv)任选地，选择由步骤iii)产生的包含所述至少六种不同的外源性多核苷酸的植物。对于上述各方面的“将细胞与步骤i)的细菌接触”这一步骤，正如本领域人员能够理解的那样，这一步骤要在合适的条件下进行合适的时间，以便染色体外转移核酸从细菌转移至细胞。在另一方面，本发明提供真核细胞至少包含a)包含第一外源性多核苷酸的第一染色体外转移核酸，b)包含第二外源性多核苷酸的第二染色体外转移核酸，和c)包含第三外源性多核苷酸的第三染色体外转移核酸。在一个实施方式中，所述细菌进一步一或多种额外的细菌，每一细菌包含包含外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。本发明还提供植物或其子代或种子，其包含包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸的第一外源性基因组区，和包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸的第二外源性基因组区。所述外源性基因组区的外源性多核苷酸优选地按照前述DNA构建体中所述来定向和间隔。本发明还提供包含本发明的细胞的转基因非人类生物体。在一个实施方式中，所述生物体的每一细胞均是本发明的细胞。优选地，所述转基因非人类生物体是转基因植物，更优选地是转基因油料种子植物，其产生下文所列的的油。在进一步的实施方式中，所述转基因植物包含至少一种额外的编码沉默阻抑物的外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，其中所述植物具有正常的表型。本发明还提供种子，其包含本发明的细胞或得自本发明的转基因植物。本发明还提供油，其由本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子产生，或得自本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子。在一个实施方式中，所述油是通过对来自油料种子的油进行提取而获得的。在一个实施方式中，所述油介花油(欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他芸苔油、葵花子油(向日葵(Helianthusannus))、亚麻籽油(栽培亚麻(Linum usitatissimum))、大豆油(大豆(Glycine max))、 红花油(红花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉蜀黍(Zea mays))、烟草油(烟草(Nicotiana tabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕榈油、棉籽油(陆地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鍔梨油(鍔梨(Persea americana))(WI (Oleaeuropaea))(月要胃(Anacardium occidentale)) >
夏威夷果油(夏威夷果(Macadamia intergrifolia))、扁桃仁油(扁桃O^runus amygdalus))或拟南芥籽油(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。本发明还提供脂肪酸，其由本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子产生，或得自本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子。本发明还提供产生含不饱和脂肪酸的油的方法，所述方法包括从本发明的细胞、 本发明的转基因非人类生物体、或本发明的种子提取油。本发明还提供组合物，其包含本发明的细胞、本发明的去饱和酶或延长酶、本发明的多核苷酸、本发明的DNA构建体、本发明的载体、本发明的油或本发明的脂肪酸。本发明还提供饲料、化妆品或化学制品，其包含本发明的细胞、本发明的转基因非人类生物体、本发明的种子、本发明的油和/或本发明的脂肪酸。本发明还提供进行去饱和酶反应的方法，所述方法包括使与CoA酯化的多不饱和脂肪酸接触本发明的去饱和酶。本发明还提供基本上纯化的抗体或其片段，其特异性结合本发明的去饱和酶或延长酶.本发明还提供治疗或预防可能从PUFA获益的病症的方法，所述方法包括给对象施用本发明的细胞、本发明的去饱和酶或延长酶、本发明的多核苷酸、本发明的DNA构建体、本发明的载体、本发明的转基因非人类生物体、本发明的种子、本发明的油或本发明的脂肪酸和/或本发明的饲料。在一个实施方式中，所述病症是心律失常、血管成形术、炎症、哮喘、银屑病、骨质疏松症、肾脏结石、AIDS、多发性硬化、类风湿关节炎、克隆病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合征、注意力缺陷多动症、囊性纤维化、苯丙酮尿症、单相抑郁、攻击敌意、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板聚集、胃肠道出血、子宫内膜异位症、经前期综合征、肌痛脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼部疾病。本发明还提供本发明的细胞、本发明的去饱和酶或延长酶、本发明的多核苷酸、本发明的DNA构建体、本发明的载体、本发明的转基因非人类生物体、本发明的种子、本发明的油或本发明的脂肪酸和/或本发明的饲料在制备用于治疗或预防可能从PUFA获益的病症的药物中的用途。本发明人已经令人惊异地发现，沉默阻抑物可优先地表达于植物贮藏器官以增强转基因在植物中的表达水平，而不明显影响植物的发育。因此，本发明提供植物细胞，其包含i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和ii)编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子。优选地，所述植物贮藏器官特异性启动子是种子特异性启动子，例如子叶特异性启动子或胚乳特异性启动子。在一个实施方式中，所述沉默阻抑物是病毒阻抑蛋白，例如，但不限于，PU P19、 V2、P38、P15、Pe-Po 和 RPV-PO0典型地，如果植物组成型地表达病毒阻抑蛋白，则植物具有异常的表型，但如果沉默阻抑物特异性表达于贮藏器官，则植物具有正常的表型。此类病毒阻抑蛋白的实例包括， 但不限于，P1、P19和P15。在进一步的实施方式中，所述病毒阻抑蛋白降低microRNA的积累和/或降低 microRNA的导向型裂解。RNA分子本身可以是功能性的，例如，但不限于，反义多核苷酸、催化性多核苷酸、 dsRNA和/或microRNA。或者，所述RNA分子可编码具有所需功能的多肽，例如，但不限于，参与脂肪酸合成或修饰的酶、种子贮藏蛋白(例如，谷类麦谷蛋白或麦醇溶蛋白)、参与碳水化合物的合成或修饰、次级代谢的酶或药物。药用蛋白质的实例包括，但不限于，抗体以及抗体相关分子及其片段、抗原性多肽，它们能够例如产生针对癌症、感染因子的免疫保护，细胞因子例如，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-α、人血清白蛋白和促红细胞生成素。在进一步的实施方式中，所述细胞包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种或更多额外的不同的外源性多核苷酸，每一外源性多核苷酸编码RNA分子并可操纵地连接于在贮藏器官中指导基因转录的启动子。每一外源性多核苷酸可以可操纵地连接于同一启动子、不同的启动子或它们的组合。在一个实施方式中，所述外源性多核苷酸是DNA。在进一步的实施方式中，所述细胞存在于植物贮藏器官例如种子中。在优选的实施方式中，与缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因细胞相比，所述 RNA分子以升高的水平存在。优选地，所述水平增加至少10%、至少20%、更优选地至少 30%。在另一实施方式中，与缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因细胞相比，由至少所述额外的外源性多核苷酸编码的至少一种RNA分子以升高的水平存在。本发明还提供转基因植物，其包含以上方面的细胞。在一个实施方式中，所述植物的每一细胞均是以上方面所定义的细胞。在特别优选的实施方式中，与缺乏所述细胞的植物相比，所述植物具有正常的表型。在另一方面，本发明提供植物贮藏器官，其包含以上方面的细胞和/或其得自前面定义的转基因植物。在一个实施方式中，所述植物贮藏器官是种子。在另一方面，本发明提供获得在贮藏器官中具有升高水平的RNA分子的表型正常植物的方法，包括a)向植物细胞中引入i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和
ii)编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子，b)从步骤a)的细胞再生转化植物，c)生长所述转化植物直至其产生贮藏器官，d)确定所述贮藏器官中的RNA分子水平，和e)选择表型正常的植物，但其中所述贮藏器官内的RNA分子的水平与缺乏所述第一外源性多核苷酸的相应的贮藏器官相比是升高的。在又一方面，本发明提供获得在贮藏器官中RNA分子稳定表达的表型正常植物的方法，包括a)向植物细胞中引入i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和ii)编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子，b)从步骤a)的细胞再生转化植物，c)从步骤b)的植物产生包含贮藏器官的第三代子代植物，和d)选择第三代子代植物，其中所述贮藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的贮藏器官中水平的至少90%。优选地，以上方面的外源性多核苷酸稳定整合到所述细胞的基因组中。在又一方面，本发明提供在转基因植物的贮藏器官中稳定表达RNA分子的方法， 包括i)表达编码沉默阻抑物的、可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子的第一外源性多核苷酸，和ii)表达编码RNA分子的、可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子的第二外源性多核苷酸，其中所述转基因植物是从以所述外源性多核苷酸转化的母本植物获得的至少第三代子代植物，且其中所述植物的贮藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的贮藏器官中水平的至少90%。在一个实施方式中，所述植物生长在田间。显然，本发明一个方面的优选的特征也适用于本发明的许多其他方面。在本说明书中，“包含”一词或其变化形式例如“包括”应理解为旨在纳入所提及的元件、整数或步骤或是元件、整数或步骤的组，但不排除任何其他的元件、整数或步骤或是元件、整数或步骤的组。下面通过以下非限制性实施例并结合附图进一步阐述本发明。
图1.需氧DHA生物合成途径。图2.在PC、CoA库和TAG库之间转移脂肪酸的各种酰基交换酶(acyl exchange enzymes)。改编自 Singh 等 Q005)。
图3.微胞藻CS-0170 Δ 6_延长酶和相关基因之间的多重比对。AAV33630， C20-多不饱和脂肪酸延长酶[巴夫藻CCMP459] ；ΑΑΥ15135，延长酶1 [盐生巴夫藻]； ABR67690, C20延长酶[绿色巴夫藻(Pavlova viridis)] ；AAV67797，多不饱和脂肪酸延长酶 1 [Ostreococcus tauri] ；CAL55414,多不饱和脂肪酸延长酶 2 (ISS) [Ostreococcus tauri] ；XP_001419791,推定的蛋白质[Ostreococcus lucimarinus CCE9901]； MicCS0170-d6E，微胞藻CS-0170A6-延长酶(本发明)；AAV67800，多不饱和脂肪酸延长酶2[假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana) ] ；XP_001416454，推定的蛋白质 [Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；ABC18313，多不饱和脂肪酸延长酶 1 [破囊壶菌 (Thraustochytrium sp. )FJN_10] ；AAV67799，多不饱和脂肪酸延长酶1 [假微型海链藻]； AAW70157, Δ-6-延长酶[三角褐指藻]；ABC18314，多不饱和脂肪酸延长酶2 [破囊壶菌 FJN-10] ；CAD58M0，未命名蛋白质产物[球等鞭金藻]。图4.塔胞藻CS-0140A6_延长酶和相关基因之间的多重比对。AAL84174，多不饱和脂肪酸特异性延长酶1[小立碗藓]；AAT85662，多不饱和脂肪酸延长酶[地钱 (Marchantia poIymorpha)] ；AAV67797，多不饱禾口月旨肪酸延长醇 1 [Ostreococcus tauri]； AB094747,推定的蛋白质[Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；Pyrco-d6E,塔胞藻 CS-OHOA 6-延长酶(本发明)；ABC18313，多不饱和脂肪酸延长酶1 [破囊壶菌FJN-10]； BAF97073，多不饱和脂肪酸延长酶[高山被孢霉]；XP_001567488，长链多不饱和脂肪酸延长酶样蛋白[巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)MH0M/BR/75/M2904]； BAE71129，△ 5-延长酶[地钱]；XP_001779105 ；推定的蛋白质[小立碗藓]。图5.塔胞藻CS-0140A5_延长酶和相关基因之间的多重比对。ΑΑΙ52204，Ε1ον14 蛋白[鲐]；CAG01780，未命名蛋白质产物[墨綠凹鼻飩(Tetraodon nigroviridis)]； AAV67800,多不饱和脂肪酸延长酶2 [假微型海链藻]；AAV33630，C20-多不饱和脂肪酸延长酶[巴夫藻CCMP459] ；ABR67690, C20延长酶[绿色巴夫藻]；AAY15135，延长酶1 [盐生巴夫藻]；AAV67798，多不饱和脂肪酸延长酶2 [Ostreococcus tauri] ；AB098084，推定的蛋白质[Ostreococcus lucimarinus CCE9901] ；Pyrco_d5E，塔胞藻 CS-0140 Δ 5-延长酶(本发明)。图6.微胞藻(ΧΜΡ1545Δ6-去饱和酶和相关基因之间的多重比对。ΑΑΜ09687， Δ 5-脂肪酸去饱和酶[破囊壶菌ATCC21685] ；AAV33631, Δ 4-去饱和酶[球等鞭金藻]； AAW70159, Δ 6-去饱禾口酶[Ostreococcus tauri] ；AB099366，推定的蛋白质[Ostreococcus lucimarinus CCE99Ol] ；Mic_d6D，微胞藻 CCMPlM5 Δ 6_ 去饱和酶(本发明)；ABF58685, Δ 5-去饱禾口酶[Perkinsus marinus] ；ABL96295, Δ 5-去饱禾口酶[盐生巴夫藻]。图7. Ostreococcus lucimarinus Δ 6-去饱和酶和相关基因之间的多重比对。ΑΑΜ09687, Δ 5-脂肪酸去饱和酶[破囊壶菌ATCC21685] ；AAR27297, Δ 6-去饱和酶[淀粉丝菌(Amylomyces rouxii) ] ；AAS93682, Δ 6-脂肪酸去饱和酶[稻根霉菌 (Rhizopus oryzae) ] ； AAV33631, Δ4-去饱和酶[球等鞭金藻]；AAW70159，Δ6-去饱禾口 Sl [Ostreococcus tauri] ；0stlu-d6D, Ostreococcus lucimarinus Δ6_ 去t包禾口 (本发明)；ABF58685，Δδ-去饱和酶[Perkinsus marinus] ；ABL96295, Δ δ-去饱和酶[盐生巴夫藻]；EDQ92231，推定的蛋白质[领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)MXl] ；CAM41728，脂肪酸去饱和酶，推定的[巴西利什曼原虫]；CAM65683，脂肪酸去饱和酶，推定的[婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)]。图8.塔胞藻CS-0140 Δ 5_去饱和酶和相关基因之间的多重比对。ΑΑΜ09687， Δ 5-脂肪酸去饱和酶[破囊壶菌ATCC21685] ；Pyrco_d5D，塔胞藻CS-0140 Δ 5-去饱和酶 (本发明)；ΑΑΤ85661，Δ 6-脂肪酸去饱和酶[地钱]；ΑΑΧ14505，Δ6-脂肪酸去饱和酶 [假微型海链藻]；ΑΒΡ49078，Δ 6-脂肪酸去饱和酶[三角褐指藻]；AAW70159，Δ 6-去饱禾口醇[Ostreococcus tauri] ；XP_001421073，推定的蛋白质[Ostreococcus Iucimarinus CCE9901] ；ABF58685, Δ 5-去饱和酶[Perkinsus marinus] ；CAJ07076，脂肪酸去饱和酶，推定的[硕大利什曼原虫(Leishmania major) ] ；ABL96295, Δ 5-去饱和酶[盐生巴夫藻]； EDQ92231，推定的蛋白质[领鞭毛虫MXl]。图 9. Ostreococcus tauri (Ot) (SEQ ID NO :30)、Ostreococcus lucimarinus (01) (SEQ ID NO 10)和微胞藻(M) CCMP1545 (SEQ ID NO :8)的Δ 6-去饱和酶蛋白序列的
多重比对。图10.显示各种去饱和酶之间的关系的系统发育树。PaVSa-d5D =盐生巴夫藻Δ 5-去饱和酶(ABL96295) ；Thr21685_d5D =破囊壶菌ATCC21685 Δ 5-去饱和酶(ΑΑΜ09687) ；Micl545-d6D =微胞藻 CCMPlM5 Δ 6_ 去饱和酶(本发明)；0stta_d6D =Ostreococcus tauri Δ 6_ 去饱禾口醇(AAW70159) ；0stlu_d6D = Ostreococcus lucimarinus Δ6-去饱和酶(本发明)；Galga_d6D =原鸡(Gallus gallus) Δ 6-去饱和酶 (ΧΡ_421053) ； Homsa-d6D =智人 Δ6-去饱和酶(AAG23121) ；Musmu_d6D =小家鼠 Δ 6-去饱和酶(ΝΡ_062673) ；Danre-d5/6D =鲐 Δ 5-/Δ 6-去饱禾Π 酶(AAG25710) ；Spaau_d6D = 金黄色石斑鱼(Sparus aurata)推定的Δ6-去饱和酶(AAL17639) ；Scoma-d6D =大菱鲆 (Scophthalmus maximus) Δ6-去饱和酶(AAS49163) ；0ncmy-d6D =虹鱒 Δ6-去饱和酶 (AAK26745) ；Salsa_d5D = Salmo salarA5_ 去饱和酶(AAL82631) ；Prifa-d6D = Primula farinosa Δ 6-去饱和酶(ΑΑΡ23034) ；Euggr_d6D =小眼虫 Δ 6-去饱和酶；Borof_d6D = 琉璃苣(Borago officianalis) Δ6-去饱和酶(AAC49700) ；Caeel_d6D =秀丽隐杆线虫 △ 6-去饱和酶(AAC15586) ；Rhior_d6D =稻根霉菌△ 6-去饱和酶(AAS93682) ；Moral-d6D =高山被孢霉Δ 6-去饱和酶(AAF08685) ；Moris_d6D =深黄被孢霉(Mortierella isabellina) Δ6-去饱和酶(AAL73M8) ；Marpo-d6D =地钱 Δ6-去饱和酶(AAT8566I)； Cerpu-d6D=角齿藓(Ceratodon purpureus) Δ 6_ 去饱和酶(CAB94993) ；Phatr_d6D =三角褐指藻Δ 6-去饱和酶(AAL92563) ；Hiaps-d6D =假微型海链藻Δ 6-去饱和酶(ΑΑΧ14505)； Pavsa-d8D =盐生巴夫藻Δ8-去饱和酶(ABL96296) ；Phatr_d5D =三角褐指藻Δ 5-去饱和酶(AAL92562) ；Marpo-d5D =地钱 Δ δ-去饱和酶(AAT85663) ；Moral-d5D =高山被孢霉厶5-去饱和酶仏六1 280；35) ；Dicdi-dOT=盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum) Δ 5-去饱和酶(ΒΑΑ37090)。图11.来自以linP-micl545-d6D-linT构建体转化的T2拟南芥种子的GC结果。 显示了单个事件1-19的SDA和GLA水平，各柱状图上方显示了 ω3到ω6的转换效率的比。 细小微胞藻Δ 6-去饱和酶对ω 3底物显示出明显的偏向性。图12.构成渗入到本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中的EPA途径的酶的转换效率。EPA途径含有Δ 6-去饱和酶(车前叶蓝蓟(Echium plantagineum) Δ 6-去饱和酶、 Ostreococcus tauri Δ 6-去饱禾口醇或细小微胞藻(Micromonas pusilla) Δ 6-去饱禾口醇)、Pyramimonas cordata Δ 6_延长酶和盐生巴夫藻Δ 5_去饱和酶。a显示各途径的ω3库转换效率；b.含有车前叶蓝蓟途径、细小微胞藻途径和含有这两种去饱和酶的途径之间的直接比较；c.含有O.tauri途径、细小微胞藻途径和含有这两种酰基-CoA去饱和酶的途径之间的直接比较。图13. GC和GC-MS确认通过瞬时表达的微胞藻RCC299 ω 3去饱和酶在本氏烟草中产生ΕΡΑ。图14. 二元载体pJPlOlacq的图显示了该二元载体的关键特征，包括启动子方向、 TMV前导序列定位、间隔区域定位和基因插入的独特克隆位点。NosT = NOS终止子，FPl = 截短的napin终止子，LininT = Linin终止子。图15. 二元载体pJP107的图。图16.确定在基于叶的分析法中实现近最大基因活性所需的土壤杆菌的浓度。以不同培养密度的含有二元表达构建体Ig Δ 9elo的土壤杆菌AGLl进行渗入后的本氏烟草中的球等鞭金藻Δ 9-延长酶(IgA9el0)活性。将共渗入的P19设定在OD6tltlnm为0. 4的浓度。 y-轴显示的是产生EDA和ETrA的Ig Δ 9elo活性的总和。图17.采用在叶子中瞬时表达或稳定表达的方法比较LC-PUFA途径的转基因表达。转换效率基于总脂肪酸特征谱。3结果来自(Qi等，2004)广结果来自(Robert等，2005)。图18.本氏烟草中的代谢适应。a.是对金枪鱼油中产生的脂肪酸甲基酯(FAME) 的气相色谱(GC)示踪，其仅含有少量的EPA，但含有大量的DHA。b.和c.是对来自以单基因CaMV 35S 二元构建体(含有细小微胞藻Δ 6-去饱和酶、P. cordata Δ6_延长酶、盐生巴夫藻Δ 5-去饱和酶、P. cordata Δ 5-延长酶(b.)或盐生巴夫藻Δ 5_延长酶(c.)和盐生巴夫藻Δ 4-去饱和酶)瞬时转化的本氏烟草叶组织中的TAG成分的FAME的GC示踪。EPA 在使用盐生巴夫藻Δ 5-延长酶的样品中的累积证实了如何可以通过仔细选择途径中的单个基因而使得代谢途径发生适应。图19.载体PJP3075中包含转基因的区域的图。图20.载体PJP3059中包含转基因的区域的图。图21.载体PJP3060中包含转基因的区域的图。图22.载体PJP3115中包含转基因的区域的图。图23.载体PJP3116中包含转基因的区域的图。序列表要点SEQIDNO1-编码微胞藻CS-0170 Δ 6-延长酶的可读框。
SEQIDNO2-微胞藻CS-0170 Δ 6-延长酶。
SEQIDNO3-编码塔胞藻CS-0140 Δ 6-延长酶/ Δ 9-延长酶的可读框。
SEQIDNO4-塔胞藻CS-0140 Δ 6-延长酶/ Δ 9-延长酶。
SEQIDNO5-编码塔胞藻CS-0140 Δ 5-延长酶的可读框。
SEQIDNO6-塔胞藻CS-0140 Δ 5-延长酶。
SEQIDNO7-编码微胞藻CCMP1545 Δ 6-去饱和酶/ Δ 8-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO8-微胞藻CCMP1545 Δ 6-去饱和酶/ Δ 8-去饱和酶。
SEQIDNO9-编码Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去饱禾口酶的可读框。
SEQIDNO10-Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去饱禾口酶。
SEQIDNO11-用于在植物中表达Ostreococcus Iucimarinus Δ 6-去饱和酶的经密码子优化的可读框。
SEQIDNO12-编码塔胞藻CS-0140 Δ 5-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO13-塔胞藻CS-0140 Δ 5-去饱和酶。
SEQIDNO14-编码微胞藻CS-0170 ω 3-去饱和酶的部分可读框。
SEQIDNO15-部分微胞藻CS-0170 ω 3-去饱和酶。
SEQIDNO16-编码微胞藻RCC299 ω 3-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO17-微胞藻RCC299 ω 3-去饱和酶。
SEQIDNO18·-用于在植物中表达微胞藻RCC299 ω 3-去饱和酶的经密码子优化的可读框。
SEQIDNO19-编码微胞藻CCMP1545 ω 3_去饱和酶的可读框。
SEQIDNO20-微胞藻CCMP1545 ω 3_去饱和酶。
SEQIDNO21-编码球等鞭金藻Δ 9-延长酶的可读框。
SEQIDNO22-球等鞭金藻Δ 9-延长酶。
SEQIDNO23-编码盐生巴夫藻Δ 8-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO24-盐生巴夫藻Δ 8-去饱和酶。
SEQIDNO25-编码盐生巴夫藻Δ 5-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO26-盐生巴夫藻Δ 5-去饱和酶。
SEQIDNO27-编码Emiliania huxleyi CCMP1516 Δ 9延长酶的可读框。
SEQIDNO:28-Emiliania huxleyi CCMP1516 Δ 9 延长酶。
SEQIDNO:29-用于在植物中表达Emiliania huxleyi Δ 9延长酶的经密码子优化的可读框。
SEQIDNO:30-Ostreococcus tauri Δ 6_ 去饱禾口酶。
SEQIDNO:31-延长酶共有结构域1。
SEQIDNO:32-延长酶共有结构域2。
SEQIDNO:33-延长酶共有结构域3。
SEQIDNO:34-延长酶共有结构域4。
SEQIDNO:35-延长酶共有结构域5。
SEQIDNO:36-延长酶共有结构域6。
SEQIDNO:37-去饱和酶共有结构域1。
SEQIDNO:38-去饱和酶共有结构域2。
SEQIDNO:39-去饱和酶共有结构域3。
SEQIDNO:40-去饱和酶共有结构域4。
SEQIDNO:41-71和78-92-寡核苷酸引物。
SEQIDNO:72-编码盐生巴夫藻Δ 4-去饱和酶的可读框。
SEQIDNO:73-盐生巴夫藻Δ 4-去饱和酶。
SEQIDNO:74-编码拟南芥二酰基甘油酰基转移酶1的可读框。
SEQIDNO:75-拟南芥二酰基甘油酰基转移酶1。
SEQIDNO:76-延长酶共有结构域7。
SEQ ID NO :77-延长酶共有结构域8。SEQ ID NO :93_ 编码 Pavlova pinguis A 9_ 延长酶的可读框。SEQ ID NO :94-Pavlova pinguis A9_ 延长酶。SEQ ID NO :95-编码盐生巴夫藻A9_延长酶的可读框。SEQ ID NO :96_盐生巴夫藻A 9_延长酶。SEQ ID NO :97_P19 病毒阻抑物。SEQ ID NO :98_V2 病毒阻抑物。SEQ ID NO :99_P38 病毒阻抑物。SEQ ID NO lOO-Pe-PO 病毒阻抑物。SEQ ID NO 101-RPV-P0 病毒阻抑物。SEQ ID NO :102-编码P19病毒阻抑物的可读框。SEQ ID NO :103-编码V2病毒阻抑物的可读框。SEQ ID NO :104-编码P38病毒阻抑物的可读框。SEQ ID NO :105-编码Pe-PO病毒阻抑物的可读框。SEQ ID NO 106-编码RPV-P0病毒阻抑物的可读框。SEQ ID NO 107-密码子优化的编码微胞藻CCMP1545 ニ酰基甘油酰基转移酶2的
可读框。SEQ ID NO :108-微胞藻CCMP1545 ニ酰基甘油酰基转移酶2。SEQ ID NO 109-1 -转移核酸边界序列。SEQ ID NO 125-用于在植物中表达微胞藻CCMP1545 A 6去饱和酶/ A 8去饱和酶 的经密码子优化的可读框。SEQ ID NO 126-用于在植物中表达塔胞藻CS-0140 A 6延长酶/ A 9延长酶的经 密码子优化的可读框(在3’端被截短并编码功能性延长酶)。SEQ ID NO 127-用于在植物中表达盐生巴夫藻A 5去饱和酶的经密码子优化的
可读框。SEQ ID NO 1 -用于在植物中表达塔胞藻CS-0140 A 5延长酶的经密码子优化的
可读框。SEQ ID NO :1 -用于在植物中表达盐生巴夫藻A 4去饱和酶的经密码子优化的 可读框。发明详述通用技术和定义除非另有说明，否则本说明书中所使用的科技术语均具有与本领域(例如細胞培 养、分子遗传学、脂肪酸合成、转基因植物、蛋白质化学和生物化学等领域)普通技术人员 通常所理解的含义相同的含义。除非另有说明，本发明所采用的重组蛋白质、細胞培养和免疫学技术均为本领域 人员所熟知的标准技木。此类技术在文献中有充分的描述和解释，例如參见J.Perbal， A Practical Guiae to Molecular Cloning，Jonn Wiley ana Sons (1984) ； J. Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) ；T. A. Brown(编辑)，Essential Molecular Biology :A Practical Approach，Volumes land 2，IRL Press (1991) ；D. Μ. Glover and B. D. Hames (编辑)，DNA Cloning A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press(1995and 1996)；禾口 F. Μ· Ausubel 等 (编辑)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and WileyHnterscience (1988，包括迄今所有的更新版)；Ed Harlow and David Lane (编辑)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)；禾口 J. Ε· Coligan 等(编辑)Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括迄今所有的更新版)，通过引用将上述文献并入本申请。诜定的定义在本文中，术语"脂肪酸"指的是羧酸(有机酸)，通常具有长的脂肪族尾部，可以是饱和的或不饱和的。典型地，脂肪酸具有碳碳键连接的链，其长度为至少8个碳原子， 更优选地长度为至少12个碳。绝大多数天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有2个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以是游离状态的(非酯化的)或者是酯化的形式，例如作为甘油三酯、甘油二酯、单酰基甘油酯的部分、酰基辅酶A(硫酯)结合型或其他结合形式。脂肪酸可酯化为磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式。“饱和脂肪酸"在其链上不含有任何双键或其他官能团。术语"饱和"指的是氢，其中所有的碳(除羧基[-C00H]之外)均含有尽可能多的氢。换言之，ω端含有3个氢(CH3-)而链内的各个碳含有2个氢(-CH2-)。“不饱和脂肪酸"与饱和脂肪酸形式相似，不同之处为沿着链存在一或多个烯烃官能团，每一烯烃将链中的单键的〃 -CH2-CH2-"部分置换为双键的〃 -CH = CH-"部分 (即，与另一碳双键连接的碳)。链中连接于该双键任一侧的2个相邻碳原子可以顺式或反式构型存在。在本文中，术语“单不饱和脂肪酸”指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少12个碳原子且链中仅有一个烯烃基(碳碳双键)。在本文中，术语“多不饱和脂肪酸”或"PUFA" 指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少12个碳原子和至少2个烯烃基(碳碳双键)。在本文中，术语"长链多不饱和脂肪酸”或"LC-PUFA"指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少20个碳原子和至少2个碳碳双键，因此也包括VLC-PUFA。在本文中，术语"极长链多不饱和脂肪酸"和"VLC-PUFA"指的是这样的脂肪酸，其碳链中包含至少 22个碳原子和至少3个碳碳双键。通常，脂肪酸碳链的碳原子数涉及的是非分支碳链。如果碳链是分支的，则碳原子数不包括侧基碳原子。在一个实施方式中，所述长链多不饱和脂肪酸ω 3脂肪酸，S卩脂肪酸自甲基端开始的第三个碳碳键发生去饱和(碳碳双键)。在另一个实施方式中，所述长链多不饱和脂肪酸ω6脂肪酸，S卩脂肪酸自甲基端开始的第六个碳碳键发生去饱和(碳碳双键)。在进一步的实施方式中，所述长链多不饱和脂肪酸选自 花生四烯酸(ARA，20:4 Δ 5，8，11，14 ； ω 6)、二十碳四烯酸(ΕΤΑ，20:4 Δ 8，11，14，17，ω 3)、 二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20:5 Δ 5，8，11，14，17 ； ω 3)、二十二碳五烯酸(DPA，22 5 Δ 7，10，13， 16,19, ω3)、或二十二碳六烯酸(DHA，22:6A4，7，10，13，16，19，ω 3)。LC-PUFA 也可以是双高-Y-亚油酸(DGLA)或二十碳三烯酸(ETrA，20:3All，14，17，ω 3)。显然，本发明所产生的LC-PUFA可以是任何或全部上述各项的混合物，并可包括其他LC-PUFA或任何这些 LC-PUFA的衍生物。在优选的实施方式中，ω 3脂肪酸是EPA、DPAjP /或DHA，优选地，EPA和/或DPA，或优选地，DPA和/或DHA。此外，在本文中，术语"长链多不饱和脂肪酸"和"极长链多不饱和脂肪酸"指的是游离状态的(非酯化的)或者是酯化的形式的脂肪酸，例如作为甘油三酯、甘油二酯、 单酰基甘油酯的部分、酰基辅酶A(硫酯)结合型或其他结合形式。脂肪酸可酯化为磷脂， 例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油的形式。因此，LC-PUFA可以混合物的形式存在于细胞内或提取自细胞、组织或生物体的纯化的油或脂质中。在优选的实施方式中，本发明提供的油包含至少75%或85%的三酰基甘油，其余部分以其他形式的脂质(例如本文中所提到的那些)存在，至少所述的三酰基甘油包含LC-PUFA。所述油可被进一步纯化或处理，例如以强碱水解去除游离脂肪酸或被分级、 蒸馏等等。可用于本发明的去饱和酶、延长酶和酰基转移酶蛋白及其编码基因是本领域已知的或是其同源物或衍生物。表1列出了这些基因的实例及其编码的蛋白质的大小。已被发现参与LC-PUFA生物合成的去饱和酶均属于所谓的“前端”去饱和酶。
权利要求
1.一种重组细胞，其包含编码具有Δ 5延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中当所述延长酶由所述细胞、优选植物细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述延长酶对EPA具有活性，以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率产生DPA。
2.权利要求1的细胞，其中所述延长酶包含SEQID NO :6所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的细胞，其还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i)Δ 8去饱和酶和/或Δ 6去饱和酶，ii)Δ 9延长酶和/或Δ 6延长酶，iii)Δ 5去饱和酶，以及iv)任选存在的Δ4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。
4.一种重组细胞，其包含编码具有ω 3去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAjf DGLA去饱和化为ETAjf GLA 去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA 并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。
5.权利要求4的细胞，其中所述去饱和酶是前端去饱和酶。
6.权利要求4或5的细胞，其中所述去饱和酶对酰基链中具有至少三个碳碳双键的 C20脂肪酸具有Δ 17去饱和酶活性，优选地对ARA具有Δ 17去饱和酶活性。
7.权利要求4至6中任一项的细胞，其中所述去饱和酶对酰基链中具有三个碳碳双键的C18脂肪酸具有Δ 15去饱和酶活性，优选地对GLA具有Δ 15去饱和酶活性。
8.权利要求4至7中任一项的细胞，其中所述去饱和酶对酰基辅酶A底物的活性高于对相应的酰基-PC底物的活性。
9.权利要求8的细胞，其中所述酰基辅酶A底物是ARA-CoA，而所述酰基-PC底物包含位于PC的sn-2位置的ARA。
10.权利要求4至9中任一项的细胞，其中所述细胞是植物细胞，且当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶对ARA具有活性，以至少40%的效率产生EPA。
11.权利要求4至10中任一项的细胞，其中所述去饱和酶包含SEQIDN0:15、17或20 所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 15具有至少35%相同性的氨基酸序列、与SEQ ID NO :17具有至少60%相同性的氨基酸序列和/或与SEQ ID N0:20具有至少60%相同性的氨基酸序列。
12.—种重组细胞，其包含编码具有△ 6去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶进一步具有至少两种、优选全部三种以下特性i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样， )对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ETrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。
13.—种重组细胞，其包含编码具有△ 6去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶对ω 3底物的活性高于对相应的ω 6底物的活性，且其中当所述去饱和酶由所述细胞中的所述外源性多核苷酸表达时，所述去饱和酶对ALA具有活性，以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率产生SDA，或当所述去饱和酶在酵母细胞中表达时，其以至少35%的效率产生SDA。
14.权利要求13的细胞，其中所述去饱和酶对脂肪酸底物ALA的Δ6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。
15.权利要求12或14的细胞，其中所述去饱和酶对作为底物的ALA的Δ6去饱和酶活性是其对作为底物的LA的Δ 6去饱和酶活性的至少大约2倍、至少3倍、至少4倍、或至少 5倍，优选地在植物细胞中是这样。
16.权利要求13至15中任一项的细胞，其中所述去饱和酶对作为脂肪酸底物的 ALA-CoA的活性高于对作为脂肪酸底物的连接至PC的sn-2位置的ALA的活性，优选地在植物细胞中是这样。
17.权利要求12或16的细胞，其中所述去饱和酶对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6 去饱和酶活性是其对作为脂肪酸底物的连接至PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性的至少大约5倍或至少10倍，优选地在植物细胞中是这样。
18.权利要求12至17中任一项的细胞，其中所述去饱和酶是前端去饱和酶。
19.权利要求12至18中任一项的细胞，其还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 6延长酶， ) Δ 5去饱和酶，iii)Δ5延长酶，和iv)任选存在的Δ4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。
20.权利要求12至19中任一项的细胞，其中所述Δ6去饱和酶对ETA不具有可检测到的Δ 5去饱和酶活性。
21.权利要求12至20中任一项的细胞，其中所述Δ6去饱和酶包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 10具有至少77%相同性的氨基酸序列。
22.权利要求12至21中任一项的细胞，其中所述Δ6去饱和酶包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列并具有Δ 8去饱和酶活性。
23.—种重组细胞，其包含编码二酰基甘油酰基转移酶的外源性多核苷酸，其中所述二酰基甘油酰基转移酶包含SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO 108具有至少相同性的氨基酸序列。
24.一种重组细胞，其包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 9延长酶， ) Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)任选存在的△5延长酶，和ν)如果存在Δ 5延长酶，则任选存在的Δ 4去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，且其中所述细胞内的总脂肪酸有至少15%、至少20%、或至少25%在它们的酰基链中包含至少20个碳和至少3个碳碳双键。
25.权利要求对的细胞，其中所述细胞内脂肪酸中的ARA、EPA、DPA和DHA总计占所述细胞内的总脂肪酸的至少15%、至少20%、或至少25%。
26.权利要求1至25中任一项的细胞，其中所述细胞将油酸转换为二十碳烯酸 (C20:l)的能力与野生型植物相比是降低的，和/或在所述细胞中有低于5%的油酸被转换为二十碳烯酸。
27.权利要求沈的细胞，其中所述细胞内的总脂肪酸具有低于1%的C20 1。
28.权利要求1至27中任一项的细胞，其中与野生型细胞相比，所述细胞具有降低的内源性Δ 15去饱和酶活性，和/或所述细胞中有低于10%的LA被转换为ALA。
29.权利要求观的细胞，其中所述内源性Δ15去饱和酶对酰基-PC底物的活性高于对相应的酰基辅酶A底物的活性，优选地其中所述酰基是LA。
30.权利要求1至四中任一项的细胞，其中所述细胞进一步包括与缺乏所述外源性多核苷酸的相应细胞相比，其将GLA转换为SDA和/或将ARA转换为EPA的转换是增加的。
31.权利要求1至30中任一项的细胞，其中所述细胞内脂肪酸中的DHA的量占所述细胞内的总脂肪酸的至少3 %、至少5 %、或至少10 %。
32.权利要求1至31中任一项的细胞，其中LA转换为ARA和/或ALA转换为EPA的效率是至少80 %或至少90 %。
33.权利要求对至32中任一项的细胞，其中所述Δ9延长酶包含SEQIDΝ0:22所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :22具有至少80%相同性的氨基酸序列。
34.权利要求M至33中任一项的细胞，其中所述Δ8去饱和酶包含SEQ ID NO 24所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 24具有至少80%相同性的氨基酸序列。
35.权利要求M至34中任一项的细胞，其中所述Δ5去饱和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 26具有至少80%相同性的氨基酸序列。
36.一种重组细胞，其包含编码以下各项的外源性多核苷酸i)Δ 6延长酶和/或Δ 9延长酶，ii)Δ 6去饱和酶和/或Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)Δ 5延长酶，ν) Δ 4去饱和酶，和vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，特征在于具有一种或多种或全部以下特性a)将ALA转换为EPA、DPA或DHA的效率是至少17.3%、或至少23%，b)将ALA转换为DPA或DHA的效率是至少15.4%或至少21 %，c)将ALA转换为DHA的效率是至少9.5%、或至少10.8%，和d)将EPA转换为DHA的效率是至少45%、或至少50%，且优选地进一步特征在于所述细胞内总脂肪酸中有至少4%是DHA。
37.权利要求36的细胞，其中掺入到细胞内的三酰基甘油中的总脂肪酸中有至少6%、 至少11%或至少15%是DHA。
38.权利要求36或37的细胞，其中DHA占细胞内全部SDA、ETA、EPA、DPA和DHA的 20-65 %，优选地占 40-65 %。
39.权利要求36至38中任一项的细胞，其中细胞内的ω3脂肪酸中的0.1-25%是SDA、 0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-60%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA、且 30-95%是 DHA，或其中细胞内的 ω 3 脂肪酸中的 0. 1-25%是 SDA、0. 1-10%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 ΕΡΑ、0. 1-50%是 DPA、且 40-95% 是 DHA。
40.权利要求36至39中任一项的细胞，其中所述Δ4去饱和酶包含SEQ ID NO 73所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 73具有至少80%相同性的氨基酸序列。
41.一种重组细胞，其包含编码以下各项的外源性多核苷酸i)Δ 6延长酶和/或Δ 9延长酶，ii)Δ 6去饱和酶和/或Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)Δ 5延长酶，和vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，特征在于具有一种或多种或全部以下特性a)将ALA转换为EPA或DPA的效率是至少17.3%、或至少23%，且b)将ALA转换为DPA的效率是至少15.4%、或至少21%，且优选地进一步特征在于所述细胞内的总脂肪酸中有至少4%是DPA。
42.权利要求41的细胞，其中掺入到细胞内的三酰基甘油中的总脂肪酸中有至少6%、 至少11%或至少15%是DPA。
43.权利要求41或42的细胞，其中DPA占细胞内全部SDA、ETA、EPA和DPA的20_65%， 优选地占40-65%。
44.权利要求41至43中任一项的细胞，其中细胞内的ω3脂肪酸中的0.1_35%是 SDA,0. 1-15%是ΕΤΑ、0. 1-60%是EPA、且30-75%是DPA，或其中细胞内的ω3脂肪酸中的 0. 1-；35%是 SDA、0. 1-15%是 ΕΤΑ、0. 1-50%是 EPA、且 40-75%是 DPA。
45.权利要求36至44中任一项的细胞，其中所述Δ6延长酶包含SEQID NO 4所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。
46.权利要求36至45中任一项的细胞，其中所述Δ6去饱和酶包含SEQ ID Ν0:8所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :8具有至少67%相同性的氨基酸序列。
47.权利要求36至46中任一项的细胞，其中所述Δ5去饱和酶包含SEQ ID NO 26所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ IDNO 26具有至少80%相同性的氨基酸序列。
48.权利要求36至47中任一项的细胞，其中所述Δ5延长酶包含SEQID NO 6所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :6具有至少47%相同性的氨基酸序列。
49.权利要求36至48中任一项的细胞，其中所述二酰基甘油酰基转移酶包含SEQID Ν0:75或SEQ ID NO :108所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :75和/ 或SEQ ID NO :108具有至少80%相同性的氨基酸序列。
50.权利要求1至49中任一项的细胞，其还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 17去饱和酶， ) Δ 15去饱和酶，和/或iii) Δ 12去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。
51.权利要求1至50中任一项的细胞，其中所述去饱和酶中的一种或多种或全部去饱和酶对酰基辅酶A底物的活性高于对相应的酰基-PC底物的活性。
52.一种重组细胞，其包含编码具有Δ 6延长酶和Δ 9延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中所述延长酶的Δ6延长酶活性高于Δ9延长酶活性。
53.权利要求52的细胞，其中所述延长酶转换SDA以产生ETA的效率是至少50%或至少60%，和/或转换ALA以产生ETrA的效率是至少6%或至少9%。
54.权利要求52或53的细胞，其中所述延长酶的Δ6延长酶活性是Δ 9延长酶活性的至少大约6. 5倍。
55.权利要求52至M中任一项的细胞，其中所述延长酶不具有可检测到的Δ5延长酶活性。
56.权利要求52至55中任一项的细胞，其中所述延长酶包含SEQID NO :4所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :4具有至少55%相同性的氨基酸序列。
57.权利要求52至56中任一项的细胞，其还包含编码以下各项的外源性多核苷酸i) Δ 8去饱和酶和/或Δ 6去饱和酶， ) Δ 5去饱和酶，iii)Δ5延长酶，和iv)任选存在的Δ4去饱和酶和/或ω 3去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子。
58.一种重组细胞，其包含编码具有Δ 5去饱和酶活性的脂肪酸去饱和酶的外源性多核苷酸，其中所述去饱和酶包含SEQ ID NO :13所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与 SEQ ID NO 13具有至少53%相同性的氨基酸序列。
59.一种重组细胞，其包含编码具有Δ 9延长酶活性的脂肪酸延长酶的外源性多核苷酸，其中所述延长酶包含SEQ ID NO :28、94和96中任一序列所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、与SEQ ID NO 具有至少81%相同性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO :94和/ 或SEQ ID NO :96具有至少50%相同性的氨基酸序列。
60.权利要求59的细胞，其中所述Δ9延长酶包含SEQ ID NO 94或SEQ ID NO 96所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID Ν0:94和/或SEQ ID NO :96具有至少 50%相同性的氨基酸序列，且其中所述延长酶对ω6底物的活性高于对相应的ω3底物的活性。
61.权利要求1至60中任一项的细胞，其中所述去饱和酶和/或延长酶可纯化自微藻类。
62.权利要求1至61中任一项的细胞，其是真核细胞。
63.权利要求62的细胞，其是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。
64.权利要求63的细胞，其位于植物中和/或是成熟的植物种子细胞。
65.权利要求64的细胞，其中所述植物或植物种子分别是油料种子植物或油料种子。
66.权利要求1至65中任一项的细胞，其能够合成长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，其中所述细胞衍生自不能合成所述LC-PUFA的细胞。
67.权利要求1至66中任一项的细胞，其进一步包含编码沉默阻抑物的外源性多核苷酸。
68.权利要求67的细胞，其中所述编码沉默阻抑物的外源性多核苷酸可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子。
69.权利要求68的细胞，其中所述植物贮藏器官特异性启动子是种子特异性启动子。
70.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码脂肪酸ω3去饱和酶活性的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择能够进行以下至少一种去饱和作用的细胞将ARA去饱和化为EPAjfDGLA去饱和化为ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。
71.权利要求70的方法，其中所选择的细胞是权利要求4至11中任一项所定义的细胞。
72.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码脂肪酸Δ5延长酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述 LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择其中所述Δ5延长酶对EPA具有活性并以至少60%、至少65%、至少70%或至少75%的效率产生DPA的细胞。
73.权利要求72的方法，其中所选择的细胞是权利要求1至3中任一项所定义的细胞。
74.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码脂肪酸△6去饱和酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述 LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有至少两种、优选全部三种以下特性的细胞i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样， )对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ALA具有Δ 6去饱和酶活性并对ETrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。
75.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码脂肪酸△6去饱和酶的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述 LC-PUFA的细胞，其中所述多核苷酸可操纵地连接于能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有Δ6去饱和酶活性的细胞，所述Δ 6去饱和酶对ω 3底物的活性高于对相应的ω 6底物的活性，且所述Δ 6去饱和酶对ALA具有活性并以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率产生SDA，或当其在酵母细胞中表达时以至少35%的效率产生SDA。
76.权利要求74或权利要求75的方法，其中所选择的细胞是权利要求12至22中任一项所定义的细胞。
77.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞i) Δ 9延长酶， ) Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)任选存在的△5延长酶，和ν)如果存在Δ 5延长酶，则任选存在的Δ 4去饱和酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，C)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择其中总脂肪酸有至少15%、至少20%或至少25%在它们的酰基链中包含至少 20个碳和至少3个碳碳双键的细胞。
78.权利要求77的方法，其中所选择的细胞是权利要求M至35中任一项所定义的细胞。
79.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞i)Δ 6延长酶和/或Δ 9延长酶，ii)Δ 6去饱和酶和/或Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)Δ 5延长酶，ν) Δ 4去饱和酶，和vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶，其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有一种或多种或全部以下特性的细胞1)将ALA转换为EPA、DPA或DHA的效率是至少17.3%、或至少23% ；2)将ALA转换为DPA或DHA的效率是至少15.4%、或至少21 % ；3)将ALA转换为DHA的效率是至少9.5%、或至少10. 8% ；和4)将EPA转换为DHA的效率是至少45%、或至少50%；且优选地进一步特征在于所述细胞内总脂肪酸中有至少4%是DHA。
80.获得能够合成一或多种长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的细胞的方法，所述方法包括a)将编码以下各项的外源性多核苷酸引入细胞，优选地是不能合成所述LC-PUFA的细胞i)Δ 6延长酶和/或Δ 9延长酶，ii)Δ 6去饱和酶和/或Δ 8去饱和酶，iii)Δ 5去饱和酶，iv)Δ 5延长酶，和vi)任选存在的二酰基甘油酰基转移酶其中每一多核苷酸可操纵地连接于一或多种能够在所述细胞中指导所述多核苷酸表达的启动子，b)在所述细胞中表达所述外源性多核苷酸，c)分析所述细胞的脂肪酸组成，和d)选择具有一种或多种或全部以下特性的细胞a)将ALA转换为EPA或DPA的效率是至少17.3%、或至少23%，且b)将ALA转换为DPA的效率是至少15.4%、或至少21%，且优选地进一步特征在于所述细胞内的总脂肪酸中有至少4%是DPA。
81.权利要求70至80中任一项的方法，其中所述外源性多核苷酸稳定整合到所述细胞的基因组中。
82.权利要求81的方法，还包括从步骤a)的细胞再生转化植物的步骤。
83.权利要求70至80中任一项的方法，其中所述外源性多核苷酸在所述细胞中瞬时表达。
84.权利要求70至83中任一项的方法，其中所述细胞是植物的叶细胞。
85.选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶； )将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性；iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有ω3去饱和酶活性并能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAjf DGLA去饱和化为 ETAjf GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。
86.权利要求85的方法，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO 15具有至少35%的相同性、与SEQ ID NO 17具有至少60%的相同性、和/或与SEQ ID NO 20具有至少60% 的相同性。
87.选择参与脂肪酸延长作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸延长酶， )将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸延长作用的核酸分子所述多肽具有△ 5延长酶活性且其转换EPA产生DPA的效率是至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。
88.权利要求87的方法，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO :6具有至少47%的相同性。
89.选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶， )将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有△ 6去饱和酶活性并具有至少两种、优选全部三种以下特性a)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，b)对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于 PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和c)对ALA具有Δ8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。
90.权利要求89的方法，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO :10具有至少77% 的相同性和/或与SEQ ID NO 8具有至少67%的相同性。
91.选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子的方法，包括i)获得可操纵地连接于启动子的核酸分子，所述核酸分子编码多肽，所述多肽可能是脂肪酸去饱和酶， )将所述核酸分子引入细胞，其中所述启动子在所述细胞中具有活性，iii)在所述细胞中表达所述核酸分子；iv)分析所述细胞中的脂肪酸组成；和ν)基于以下事实选择参与脂肪酸去饱和作用的核酸分子所述多肽具有△ 6去饱和酶活性和Δ 8去饱和酶活性。
92.权利要求91的方法，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQID NO :8具有至少67%的相同性。
93.权利要求85、86、或89-92中任一项的方法，其中步骤(ν)包括选择编码对酰基辅酶A底物具有活性的去饱和酶的核酸分子或编码前端去饱和酶的核酸分子。
94.前述任一项权利要求中所定义的外源性多核苷酸的组合，当它们用于产生重组细胞时，它们在重组细胞中表达至少两种脂肪酸去饱和酶和两种脂肪酸延长酶的组合、和/ 或在重组细胞中产生LC-PUFA。
95.基本上纯化的和/或重组脂肪酸ω3去饱和酶，当由外源性多核苷酸在细胞中表达时，其能够进行以下至少一种去饱和作用将ARA去饱和化为EPAjf DGLA去饱和化为ΕΤΑ、 将GLA去饱和化为SDAjf ARA去饱和化为EPA并将DGLA去饱和化为ETAjf ARA去饱和化为EPA并将GLA去饱和化为SDA、或所有这三种去饱和作用。
96.权利要求95的ω3去饱和酶，其特征在于具有如权利要求4至11中任一项所定义的任何一或多种特性。
97.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ5延长酶，其中当由外源性多核苷酸在细胞中表达时，所述延长酶对EPA具有活性，以至少60 %、至少65 %、至少70 %或至少75 %的效率产生 DPA。
98.权利要求97的Δ5延长酶，其特征在于具有如权利要求1至3中任一项所定义的任何一或多种特性。
99.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6去饱和酶，其中所述去饱和酶进一步具有至少两种、优选全部三种以下特性i)对作为脂肪酸底物的ALA的Δ 6去饱和酶活性高于对LA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样， )对作为脂肪酸底物的ALA-CoA的Δ 6去饱和酶活性高于对作为脂肪酸底物的连接于PC的sn-2位置的ALA的Δ 6去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样，和iii)对ETrA具有Δ 8去饱和酶活性，优选地在植物细胞中是这样。
100.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6去饱和酶，其中所述去饱和酶对ω 3底物的活性高于对相应的ω 6底物的活性，且其中所述去饱和酶对ALA具有活性，当所述去饱和酶由外源性多核苷酸在细胞中表达时以至少5%、至少7.5%、或至少10%的效率产生SDA，或当其在酵母细胞中表达时以至少35%的效率产生SDA。
101.权利要求99或100的Δ6去饱和酶，其特征在于具有如权利要求12至22中任一项所定义的任何一或多种特性。
102.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ6延长酶和Δ 9延长酶，其中所述延长酶的Δ 6 延长酶活性高于△ 9延长酶活性。
103.权利要求102的Δ6延长酶和Δ 9延长酶，其特征在于具有如权利要求53至56 中任一项所定义的任何一或多种特性。
104.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ5去饱和酶，其包含SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :13具有至少53%相同性的氨基酸序列。
105.基本上纯化的和/或重组脂肪酸Δ9延长酶，其包含SEQ ID NO :28、94和96任一序列所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、与SEQ ID NO 具有至少81%相同性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO 94和/或SEQ ID NO 96具有至少50%相同性的氨基酸序列。
106.基本上纯化的和/或重组二酰基甘油酰基转移酶，其包含SEQID NO :108所示的氨基酸序列、其生物学活性片段、或与SEQ ID NO :108具有至少相同性的氨基酸序列。
107.权利要求95至106中任一项的去饱和酶或延长酶，其中所述去饱和酶和/或延长酶可纯化自微藻类。
108.分离的和/或外源性多核苷酸，其包含i)选自SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107、或 125 至 129 中任一序列的核苷酸序列，ii)编码权利要求95至107中任一项的去饱和酶或延长酶的核苷酸序列，iii)与SEQ ID NO :3、5、7、9、11、12、14、16、18、19、27、29、93、95、107 或 125 至 129 中的一或多个序列具有至少50%相同性的核苷酸序列，和/或iv)在严格性条件下与i)至iii)中的任一序列杂交的序列。
109.用于整合到和/或已整合到植物细胞基因组中的DNA构建体，所述构建体包含一簇至少三个编码调控植物细胞内脂肪酸合成的蛋白质的可读框，优选地每一蛋白质是脂肪酸去饱和酶或脂肪酸延长酶，其中具有相同转录方向的各可读框间隔至少750bp、至少 1, OOObp或至少l，250bp，且至少有两个可读框具有不同的转录方向，其中每一可读框可操纵地连接于在植物细胞中具有活性的启动子，且每一启动子可独立地是相同的或不同的。
110.权利要求109的DNA构建体，其中至少有两个启动子是不同的。
111.权利要求109或权利要求110的DNA构建体，其中每一可读框可操纵地连接于异源性5’前导序列，每一前导序列可独立地是相同的或不同的，其中与特定可读框的天然存在的5’前导序列相比，每一异源性5’前导序列使翻译效率提高。
112.权利要求111的DNA构建体，其中所述异源性5’前导序列是烟草花叶病毒 (TMV) 5’前导序列。
113.权利要求109至112中任一项的DNA构建体，其中所述蛋白质是延长酶和/或去饱和酶。
114.权利要求109至113中任一项的DNA构建体，其仅具有三个或四个被翻译成蛋白质的可读框。
115.载体，其包含权利要求108的多核苷酸和/或权利要求109至114中任一项的DNA构建体。
116.权利要求115的载体，其中所述多核苷酸可操纵地连接于启动子。
117.产生权利要求95至107中任一项的去饱和酶或延长酶的方法，所述方法包括在细胞或无细胞表达系统中表达权利要求108的多核苷酸、权利要求109至114中任一项的 DNA构建体和/或权利要求115或权利要求116的载体。
118.以至少三种不同的外源性多核苷酸瞬时转染真核细胞的方法，所述方法包括i)获得至少a)第一细菌，其包含包含第一外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，b)第二细菌，其包含包含第二外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，和c)第三细菌，其包含包含第三外源性多核苷酸的染色体外转移核酸，和 )将所述细胞与步骤i)的细菌接触，其中每一染色体外转移核酸从细菌转移至细胞中以产生瞬时转染的细胞，其中每一外源性多核苷酸包含在所述细胞中具有活性的启动子，其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的，且其中至少有一种外源性多核苷酸编码沉默阻抑物。
119.权利要求118的方法，其包括获得所述细胞，然后将所述细胞与第四细菌接触，所述第四细菌包含包含第四外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。
120.权利要求119的方法，其包括获得所述细胞，然后将所述细胞与第五细菌接触，所述第五细菌包含包含第五外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。
121.权利要求120的方法，其包括获得所述细胞，然后将所述细胞与第六细菌接触，所述第六细菌包含包含第六外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。
122.权利要求121的方法，其包括获得所述细胞，然后将所述细胞与第七细菌接触，所述第七细菌包含包含第七外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。
123.权利要求122的方法，其包括获得所述细胞，然后将所述细胞与第八细菌接触，所述第八细菌包含包含第八外源性多核苷酸的染色体外转移核酸。
124.筛选瞬时转染的细胞的所需活性的方法，所述方法包括进行权利要求118至123 中任一项的方法并测试所述细胞的所需活性。
125.以至少六种不同的外源性多核苷酸转化真核细胞的方法，所述方法包括i)获得至少a)第一细菌，其包含第一染色体外转移核酸，所述第一染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，和b)第二细菌，其包含不同于所述第一染色体外转移核酸的第二染色体外转移核酸，所述第二染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸， )将所述细胞与步骤i)的细菌接触，和iii)任选地选择被所述第一和第二染色体外转移核酸的外源性多核苷酸稳定转化的细胞，其中每一所述第一和第二染色体外转移核酸的外源性多核苷酸由所述细菌转移至所述细胞中以产生转化的细胞，其中每一所述外源性多核苷酸包含启动子，所述启动子在所述细胞中或可由其衍生的细胞中具有活性，且其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的。
126.权利要求125的方法，其中所述i)第一染色体外转移核酸只有3到6种、只有3 到5种、只有3到4种、只有4到6种、只有4到5种、或只有5到6种不同的外源性多核苷酸，且ii)第二染色体外转移核酸只有3到6种、只有3到5种、只有3到4种、只有4到6 种、只有4到5、或只有5到6种不同的外源性多核苷酸。
127.权利要求125或权利要求1 的方法，其中每一外源性多核苷酸编码多肽，且其中各多肽是不同的。
128.权利要求125至127中任一项的方法，其中i)第一染色体外转移核酸包含两种外源性多核苷酸，它们独立地编码选自如下一组的多肽Δ 6去饱和酶、Δ 12去饱和酶和Δ 15去饱和酶，和 )第二染色体外转移核酸包含编码多肽的外源性多核苷酸，所述多肽是该组中的第三种酶。
129.权利要求125至1 中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞，且所述方法还包括从所述稳定转化的细胞再生转化植物的步骤。
130.权利要求118至129中任一项的方法，其中每一外源性多核苷酸编码形成酶途径的一部分的酶或是此种酶的候选物。
131.权利要求118至130中任一项的方法，其中每一外源性多核苷酸编码酶或是此种酶的候选物，所述酶参与脂肪酸合成、脂肪酸修饰、二酰基甘油组装、三酰基甘油组装、或其中两种或更多种的组合。
132.权利要求118至131中任一项的方法，其中所述细菌选自土壤杆菌、根瘤菌、 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium Ioti)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、 猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、单核细胞增多性李司忒菌(Listeria monocytogenes)> 大肠杆菌(Escherichia coli)、假结核病耳口尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)禾口小肠结肠炎耳口尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
133.权利要求118至132中任一项的方法，其中所述染色体外转移核酸是P-DNA、土壤杆菌T-DNA、或它们的组合。
134.权利要求118至133中任一项的方法，其中所述细胞是植物细胞或哺乳动物细胞。
135.权利要求118至134中任一项的方法，其中所述细胞是组织或器官的一部分。
136.权利要求135的方法，其中所述细胞是植物细胞，所述组织或器官是叶、茎、根、分生组织、愈伤组织、或胚珠。
137.通过权利要求118至136中任一项的方法产生的细胞。
138.产生以至少六种不同的外源性多核苷酸稳定转化的植物的方法，所述方法包括i)获得包含第一外源性基因组区的第一种稳定转化植物，所述第一外源性基因组区包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸， )获得与所述第一种稳定转化植物具有性亲和性并包含第二外源性基因组区的第二种稳定转化植物，所述第二外源性基因组区不同于所述第一外源性基因组区并包含3、4、5、 或6种不同的外源性多核苷酸，iii)使所述第一种稳定转化植物与所述第二种稳定转化植物杂交，和iv)选择由步骤iii)产生的包含所述第一和第二基因组区的植物或其子代，由此产生稳定转化植物，其中每一所述外源性多核苷酸包含启动子，所述启动子在植物中具有活性，且其中每一启动子可以独立地是相同的或不同的。
139.权利要求138的方法，其中步骤i)包括通过以下步骤产生所述第一种稳定转化植物a)将植物细胞与包含第一染色体外转移核酸的第一细菌接触，所述第一染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，b)从步骤a)的植物细胞产生稳定转化植物，和任选地c)产生来自步骤b)的稳定转化植物的子代植物；和/或步骤ii)包括通过以下步骤产生所述第二种稳定转化植物d)将植物细胞与包含第二染色体外转移核酸的第二细菌接触，所述第二染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，e)从步骤d)的植物细胞产生稳定转化植物，和任选地f)产生来自步骤e)的稳定转化植物的子代植物。
140.产生以至少六种不同的外源性多核苷酸稳定转化的植物的方法，所述方法包括 i)获得包含第一外源性基因组区的第一种稳定转化植物或植物部分，所述第一外源性基因组区包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸， )使所述第一种稳定转化植物或植物部分的细胞接触包含染色体外转移核酸的细菌，所述染色体外转移核酸包含三种、四种、五种或六种不同的外源性多核苷酸，iii)从所述细胞产生植物，且iv)任选地，选择由步骤iii)产生的包含所述至少六种不同的外源性多核苷酸的植物。
141.细胞，其至少包含a)包含第一外源性多核苷酸的第一染色体外转移核酸，b)包含第二外源性多核苷酸的第二染色体外转移核酸，和c)包含第三外源性多核苷酸的第三染色体外转移核酸。
142.转基因植物或其子代或种子，其包含包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸的第一外源性基因组区，和包含3、4、5、或6种不同的外源性多核苷酸的第二外源性基因组区。
143.转基因非人类生物体，其包含权利要求1至69、137或141中任一项的细胞。
144.权利要求143的生物体，其是转基因植物。
145.种子，其包含权利要求1至69、137或141中任一项的细胞或得自权利要求142或权利要求144的转基因植物。
146.从权利要求1至69、137或141中任一项的细胞、权利要求142的植物、权利要求143或144的转基因非人类生物体、或权利要求145的种子产生或获得的油。
147.权利要求146的油，其中所述油通过从油料种子提取油而获得。
148.权利要求146或权利要求147的油，其是介花油(欧洲油菜(Brassicanapus)、 芜菁(Brassica rapa))、芥子油(芥菜(Brassica juncea))、其他芸苔油、葵花子油(向日赛(Helianthus annus) )>^ ( ^ (Linum usitatissimum)) >^ ( XsL (Glycine max))、红花油(红花(Carthamus tinctorius))、玉米油(玉蜀黍(Zea mays))、 烟草油(烟草(Nicotiana tabacum))、花生油(花生(Arachis hypogaea))、棕榈油、棉籽油(陆地棉(Gossypium hirsutum))、椰子油(椰子(Cocos nucifera))、鳄梨油(鳄梨(Persea americana))、橄榄油(橄榄(Olea europaea))、腰果油(腰果(Anacardium occidentale))、夏威夷果油(夏威夷果(Macadamia intergrifolia))、扁桃仁油(扁桃 (Prunus amygdalus))或拟南芥籽油(拟南芥(Arabidopsis thaliana))。
149.从权利要求1至69、137或141中任一项的细胞、权利要求142的植物、权利要求 143或144的转基因非人类生物体、或权利要求145的种子产生或获得的脂肪酸。
150.产生含不饱和脂肪酸的油的方法，所述方法包括从权利要求1至69、137或141中任一项的细胞、权利要求142的植物、权利要求143或144的转基因非人类生物体、或权利要求145的种子提取油。
151.组合物，其包含权利要求1至68、137或141中任一项的细胞、权利要求95至107 中任一项的去饱和酶或延长酶、权利要求108的多核苷酸、权利要求109至114中任一项的 DNA构建体、权利要求115或权利要求116的载体、权利要求146至148中任一项的油或权利要求149的脂肪酸。
152.饲料、化妆品或化学制品，其包含权利要求1至69、137或141中任一项的细胞、权利要求142的植物、权利要求143或144的转基因非人类生物体、权利要求145的种子、权利要求146至148中任一项的油、和/或权利要求149的脂肪酸。
153.进行去饱和酶反应的方法，所述方法包括使与CoA酯化的多不饱和脂肪酸接触权利要求4至22中任一项的去饱和酶。
154.基本上纯化的抗体或其片段，其特异性结合权利要求95至107中任一项的去饱和酶或延长酶。
155.治疗或预防可能从PUFA获益的病症的方法，所述方法包括给对象施用权利要求1 至68、137或141中任一项的细胞、权利要求95至107中任一项的去饱和酶或延长酶、权利要求108的多核苷酸、权利要求109至114中任一项的DNA构建体、权利要求115或权利要求116的载体、权利要求142的植物、权利要求143或144的转基因非人类生物体、权利要求145的种子、权利要求146至148中任一项的油、权利要求149的脂肪酸和/或权利要求 152的饲料。
156.权利要求155的方法，其中所述病症是心律失常、血管成形术、炎症、哮喘、银屑病、骨质疏松症、肾脏结石、AIDS、多发性硬化、类风湿关节炎、克隆病、精神分裂症、癌症、胎儿酒精综合征、注意力缺陷多动症、囊性纤维化、苯丙酮尿症、单相抑郁、攻击敌意、肾上腺脑白质营养不良、冠心病、高血压、糖尿病、肥胖、阿尔茨海默病、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、血管成形术后再狭窄、湿疹、高血压、血小板聚集、胃肠道出血、子宫内膜异位症、经前期综合征、肌痛脑脊髓炎、病毒感染后慢性疲劳或眼部疾病。
157.权利要求1至68、137或141中任一项的细胞、权利要求95至107中任一项的去饱和酶或延长酶、权利要求108的多核苷酸、权利要求109至114中任一项的DNA构建体、 权利要求115或权利要求116的载体、权利要求142的植物、权利要求143或144的转基因非人类生物体、权利要求145的种子、权利要求146至148中任一项的油、权利要求149的脂肪酸和/或权利要求152的饲料在制备用于治疗或预防可能从PUFA获益的病症的药物中的用途。
158.植物细胞，其包含i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和 )编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子。
159.权利要求158的细胞，其中所述植物贮藏器官特异性启动子是种子特异性启动子，例如子叶特异性启动子或胚乳特异性启动子。
160.权利要求158或159的细胞，其中所述沉默阻抑物是病毒阻抑蛋白。
161.权利要求158至160中任一项的细胞，其中所述RNA分子编码多肽。
162.权利要求161的细胞，其中所述多肽参与脂肪酸或脂质的合成或修饰、是种子贮藏蛋白、参与碳水化合物的合成或修饰、或是药物。
163.权利要求158至162中任一项的细胞，其包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种额外的不同的外源性多核苷酸，每一外源性多核苷酸编码RNA分子并可操纵地连接于在贮藏器官中指导基因转录的启动子。
164.权利要求158至163中任一项的细胞，其中所述外源性多核苷酸是DNA。
165.权利要求158至164中任一项的细胞，其存在于植物贮藏器官例如种子内。
166.权利要求158至165中任一项的细胞，其中与缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因细胞相比，所述RNA分子以升高的水平存在。
167.权利要求166的细胞，其中与缺乏所述第一外源性多核苷酸的同基因细胞相比， 由至少所述额外的外源性多核苷酸编码的至少一种RNA分子以升高的水平存在。
168.转基因植物，其包含权利要求158至167中任一项的细胞。
169.植物贮藏器官，其包含权利要求158至167中任一项的细胞和/或从权利要求168 的转基因植物获得。
170.权利要求169的植物贮藏器官，其是种子。
171.获得在贮藏器官中具有升高水平的RNA分子的表型正常植物的方法，包括a)向植物细胞中引入i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和 )编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子，b)从步骤a)的细胞再生转化植物，c)生长所述转化植物直至其产生贮藏器官，d)确定所述贮藏器官中的RNA分子水平，和e)选择表型正常的植物，但其中所述贮藏器官内的RNA分子的水平与缺乏所述第一外源性多核苷酸的相应的贮藏器官相比是升高的。
172.获得在贮藏器官中RNA分子稳定表达的表型正常植物的方法，包括a)向植物细胞中引入i)编码沉默阻抑物的第一外源性多核苷酸，其可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子，和 )编码RNA分子的第二外源性多核苷酸，其可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子，b)从步骤a)的细胞再生转化植物，c)从步骤b)的植物产生包含贮藏器官的第三代子代植物，和d)选择第三代子代植物，其中所述贮藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的贮藏器官中水平的至少90%。
173.权利要求171或权利要求172的方法，其中所述外源性多核苷酸稳定整合到所述细胞的基因组中。
174.在转基因植物的贮藏器官中稳定表达RNA分子的方法，包括i)表达编码沉默阻抑物的、可操纵地连接于植物贮藏器官特异性启动子的第一外源性多核苷酸，和 )表达编码RNA分子的、可操纵地连接于在植物贮藏器官中指导基因转录的启动子的第二外源性多核苷酸，其中所述转基因植物是从以所述外源性多核苷酸转化的母本植物获得的至少第三代子代植物，且其中所述植物的贮藏器官中的所述RNA分子的水平是前代植物的贮藏器官中水平的至少90%。
175.权利要求171至174中任一项的方法，其中所述植物生长在田间。
全文摘要
本发明涉及在重组细胞(例如酵母或植物细胞)中合成长链多不饱和脂肪酸(特别是二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸)的方法。本发明还提供产生长链多不饱和脂肪酸的重组细胞或植物。此外，本发明涉及一组新的酶，它们具有去饱和酶或延长酶活性，可用于合成长链多不饱和脂肪酸的方法。具体地，本发明提供具有新活性的ω3去饱和酶、Δ5延长酶和Δ6去饱和酶。本发明还提供用于以多种基因瞬时和/或稳定转化细胞(特别是植物细胞)的方法和DNA构建体。
文档编号A01H5/00GK102317459SQ200980154876
公开日2012年1月11日 申请日期2009年11月17日 优先权日2008年11月18日
发明者A·M·麦肯齐, C·C·伍德, D·M·F·弗兰普顿, J·R·皮特里, M·P·曼苏尔, P·D·尼科尔斯, P·什雷斯塔, S·I·E·布莱克本, S·P·辛格, S·S·罗伯特, 周雪荣, 柳青 申请人:粮食研究发展公司, 联邦科学技术研究组织