专利名称：一种木质纤维素降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌剂领域，具体地说，涉及一种含有扩张青霉的木质纤维素降 解微生物菌剂。
背景技术：
我国是一个农业大国，据粗略统计，每年产生农作物秸秆约8亿吨，但利用率很 低，既造成生物资源的浪费，也对环境造成严重污染，因此如何充分利用这些生物资源已成 为制约我国农业可持续发展的关键问题之一。双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或称白蘑菇，其培养料一般是由农作物秸秆、畜禽 粪便和少量化肥混合配制而成。如能将农作物秸秆在蘑菇生产中得到充分利用，将大大提 高生物资源的有效利用率，并减缓农业废弃物对环境的压力。目前我国很大一部分的双孢 菇依靠农民的小作坊生产，因此经常受到环境温度过低、堆肥发酵时间过长、堆肥品质低下 的困扰。缩短堆肥发酵时间，提高堆肥品质已成为小作坊双孢菇生产亟待解决的问题。大量的研究表明，用于蘑菇栽培的培养料，是经过一个复杂的微生物群直接参与 的生物转化过程形成的(Burton，1997)。蘑菇菌丝利用的主要是培养料生物转化结束后，在 作物秸秆表面沉积的一种暗褐色物质，该复合物来源于代谢后的木质素产物，其中含有大 量的氮和完整的微生物细胞成分以及部分分解后残留下来的碎片，同时，这种复合物除蘑 菇菌丝外，其他微生物或杂菌几乎都难利用(Adams，2008)。蘑菇培养料生物转化过程的完 成是依赖于微生物群落的共同作用实现的，研究人员对堆置阶段培养料中细菌、放线菌、真 菌三大类型菌群的出现、发展规律，各自的作用特点以及他们之间的相互性、拮抗性都进行 了大量的研究(姜成，2003 ;Ashraf，2007)。蘑菇生长所利用的碳源，根本上是来自秸秆木 质纤维素的降解产物。因此，在培养料生物转化过程中添加外源木质纤维素降解菌具有潜 在的加快培养料发酵腐熟速率，提高堆肥品质的作用。目前有很多研究人员开展了在农业废弃物和城市垃圾堆肥过程中添加外源木质 纤维素降解菌的研究，虽然在添加外源木质纤维素降解菌是否能够加快堆肥发酵腐熟速 率、提高堆肥品质上还存在有争议，但添加外源木质纤维素降解菌在堆肥中的作用已成为 研究人员的研究重点。由于作物秸秆的纤维素与半纤维素、木质素形成致密的网状结构，且内部高度的 结晶化导致其很难被微生物作为碳源利用，因此筛选获得高效的秸秆木质纤维素降解菌成 为该技术的关键。降解木质纤维素的细菌种类很多，放线菌是公认的降解能力较强的一类丝状细 菌，包括链霉菌(Streptomyces) lif (Arthrobacter)、小单胞菌(Micromonospora) 卡氏菌(Nocardia)等(Li，1997 ；刘东波，1990)。放线菌对木质素的降解作用主要在于增 加它的水溶性。由于放线菌可以穿透木质纤维素等不溶基质，因此在中性、微碱性土壤或堆 肥中，放线菌参与有机质的初始降解和腐殖化。Crawford(1983)等人对放线菌中的链霉菌 进行了研究，发现该菌菌丝分枝多且产量大，在高斯培养基上菌落质地紧密，与培养基结合牢固不易挑起。在初级代谢阶段该菌有降解木质素能力，主要是通过脱甲基、芳环断裂和侧 链氧化三种途径降解木质素。虽然链霉菌生长过程中会产生抗生素抑制其它微生物的生 长，是较好的试验菌种，但这导致其很难与其它木腐微生物协同降解木质素，使其在工业应 用上受到很大限制。降解木质素的非丝状细菌在一定程度上也能引起木质素的降解。例如细菌中 的厌氧梭菌(Clostridium)、假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、芽孢 杆菌(Bacillus)、黄杆菌(Flavobacterium)禾口黄单胞菌(Xanthomonas)。木腐细菌的 耐热性高于木腐真菌，国外学者从环境温度在65 82°C条件下分离得到多种木腐细菌 (Beffa，1996)。由于木腐细菌耐热性强，能够适应堆肥内部环境中的高温，国外已开始 利用这些细菌将含有木质素的生活垃圾降解转化为肥料(TuOmela，2000 ；杨晓寰，2007)。 目前分离的具有纤维素降解能力的细菌较多，其中属于革兰氏阳性菌属(G+)的有噬纤 维菌(Cytophaga)，热杆菌属(Caldibacillus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，生孢嗜纤维菌 (Sporacytophga)等；属于革兰氏阴性菌属(G_)的有假单孢菌属(Pseudomonas)，欧文氏菌 属(Erwinia)，纤维单孢菌属(Cellulomonas)，镰状纤维菌属(Cellfacicula)等(Schwarz， 2001 ；Lynd, 2002 ；Kenyon, 2005) 0但由于这些原核生物所分泌的木质素纤维素降解酶都是 胞内酶，这就决定了其在木质素降解菌的研究中处于一个相对次要的地位。真菌的胞外纤维素酶活较强，尤其以青霉属(Penicillium)，木霉属 (Trichderma)，毛壳霉属(Chaetomium)曲霉属(Aspergillus)禾口根霉属(Rhizopus)，其中 以木霉属(Trichderma)、黑曲霉(Aspergillus niger)研究的较多，它们往往被用在工业 酶的生产，以提高纤维素类物质的资源转化率(Wood，1994 ； Itavaara, 1999 ；Lynd, 2002)。 根据木材腐朽的类型，降解木质素的真菌可分为褐腐菌、白腐菌和软腐菌三类，前两者属于 担子菌，软腐菌属于半知菌。褐腐菌对多糖(如纤维素)要比木质素更为敏感。它首先降 解纤维素并分泌黄褐色的色素使木材呈褐色，而后才部分缓慢的降解木质素；软腐菌在潮 湿的条件下使木材腐烂，主要降解纤维素，对木质素的降解较缓慢且不彻底，因使木质表面 变软而得名；白腐菌是一种丝状真菌，降解木质素的能力优于降解纤维素的能力，这类菌首 先使木材中的木质素发生降解并且不产生色素、使木质仍保持白色(吴坤，2000)。由于大部分的木质纤维素降解真菌在生长活动中能够在胞外同时分泌木质素降 解酶、纤维素降解酶以及半纤维素降解酶，已有研究表明将真菌应用到堆肥中，可以有效地 降解秸秆中的木质纤维素，将木质纤维素转化为腐殖质(王连稹，2003)。黄丹莲等(2005) 在农作物秸秆堆肥中加入白腐真菌后，木质素的降解率达到43. 86%，远高于未接种菌剂 的堆肥中木质素的降解率，表明在堆肥中接种白腐真菌菌剂，可加速堆肥过程，使堆肥中 的木质素降解的更彻底。随着科研人员对蘑菇生产基质堆肥的深入研究，发现在堆肥中 添加具有分泌纤维素降解酶系的嗜热真菌，能够提高堆肥质量，及蘑菇产量(曾伟，1996 ； Sabatini,2006)。综上所述，木质纤维素降解菌是提高蘑菇培养料生物转化速率和蘑菇栽培基质品 质的一个有效途径。目前已有关于利用木质纤维素降解菌促进农业废弃物和城市垃圾堆肥 的研究，但将木质纤维素降解菌添加到蘑菇培养料中，用于提高培养料的生物转化速率及 其获得的蘑菇栽培基质的品质的研究未见报道；具有木质纤维素降解能力的青霉属的菌株 的筛选已有报道，但具有高效木质纤维素降解作用的扩张青霉生物菌剂的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种木质纤维素降解菌(扩张青霉W4)及其在制备蘑菇培养 料生物处理的微生物菌剂中的应用。为了实现本发明目的，本发明的扩张青霉W4，其分类命名为Penicillium expansum，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳 区北辰西路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 4077，保藏日期2010年8月9日。本发明的扩张青霉W4菌株分离自北京郊区腐烂的秸秆。本发明的扩张青霉W4的形态学特征为菌株W4在PDA培养基上30°C恒温培养 2d即可看到清晰的白色菌落。菌落开展，绒状，表层着生一层暗绿色分生孢子粉，菌株生 长后期背面观察呈褐色。分生孢子梗光滑，不对称分支3-6个，排列紧密，其顶端着生5-8 个短小的瓶状小梗，8. 7-10. 6X 3. 0 μ m，分生孢子多，呈椭圆形，部分变亚球形，光滑，长径 3. 1-3. 5 μ m0本发明的扩张青霉W4菌株的培养方法为将菌株加入到PDA液体培养基中，300C， 170r · mirT1 振荡培养 3d。PDA液体培养基成分及用量(g/L):马铃薯200(去皮)，葡萄糖20，？!17.2 7.4， 以水配制。本发明还提供扩张青霉W4在降解木质纤维素中的应用。本发明的蘑菇培养料的微生物菌剂包括如下重量份的组分扩张青霉W4 1-2份； 稻糠和/或麦糠10-15份。有效成分主要为扩张青霉W4。本发明的蘑菇培养料的微生物菌剂在蘑菇培养料生物转化过程中的应用，主要通 过降解培养料中的农作物秸秆，所述的农作物秸秆包括麦秸和/或稻草等。本发明首次分离出具有高效木质纤维素降解作用的扩张青霉W4，保藏编号为 CGMCC NO. 4077。该菌株能够产生纤维素酶和漆酶，能够降解秸秆木质纤维素，将其作为蘑 菇培养料的微生物菌剂中的主要有效成分，具有缩短蘑菇培养料生物转化时间、提高蘑菇 栽培基质品质的作用。尤其是针对家庭作坊堆置的少量蘑菇培养料的生物转化，在温度较 低的环境下，具有明显的优势。
图1为培养时间对菌株W4胞外纤维素酶活的影响。图2为培养时间对菌株W4漆酶酶活的影响。图3为本发明蘑菇稻草培养料中微生物群落的变化特征， 未添加菌剂，■添加 菌剂。图4为本发明蘑菇麦秸培养料中微生物群落的变化特征， 未添加菌剂，■添加 菌剂。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例蘑菇培养料微生物菌剂的制备
发酵罐培养液配方为(重量百分比)=KH2PO4 0.1%, NaCl 0.01%, MgSO4 · 7H20 0. 03%,NaNO3 0. 25%,FeCl3 0. 001%, CaCl2 0. 01 %，結秆粉 0. 5%，pH 为 7. 2 7. 4，以水配制。将W4菌株接种于PDA培养基上，28-30 °C培养72h，然后接入500mL三角瓶，在 30°C，静态培养48h。然后按接种量接入到15L种子罐中，pH7. 2，通气量0. 5vvm下，培 养48h后，再按5%的接种量装入到100L的发酵罐中，pH7. 2，通气量0. 6vvm下，培养5d。发酵完成后，按照2 10 15的重量比将菌株W4加入到灭好菌的稻糠或麦糠中， 无菌装袋封口，常温保存。实验例1菌株W4产酶活力实验液体发酵培养基(重量百分比)=KH2PO41. Og5NaCl 0. lg，MgSO4 ·7Η20 0. 3g，NaNO3 2. 5g，FeCl3 0. Olg，CaCl2 0. lg，秸秆粉 20g，pH 为 7. 2 7. 4，以水配制。纤维素粗酶液的制备将在PDA上培养的菌种孢子转移到生理盐水中，用血球计 数板计数，按(IO8个孢子量)的接种量到300ml产酶培养基中，28°C，170rmp液体发酵 培养，每24h取样测定纤维素的酶活力，将培养好的液体发酵产酶培养基先用两层纱布过 滤，滤液再于4°C，5000rmp离心lOmin，取上清液即为制备的粗酶液。全酶活的测定取适当稀释后的酶液0. 5ml，加入到含有50mg处理过的无淀粉新 华滤纸和1. 5ml 0. 05M pH5. O柠檬酸缓冲液的具塞刻度试管中，50°C水浴中保温Ih后，立 即按DNS法测定还原糖含量。外切酶活的测定将无淀粉新华滤纸改为脱脂棉，其它同全酶 活的测定。内切酶活力的测定取适当稀释后的酶液0. 5ml，加入到含有1. 5ml 1% CMC柠 檬酸缓冲液的具塞刻度试管中，50°C水浴中保温30 min后，立即按DNS法测定还原糖含量。 β-葡萄糖苷酶活力的测定将CMC柠檬酸缓冲液改为水杨苷醋酸缓冲液，其它同 内切酶活的测定。以上酶活力单位(U/ml)定义为每ml酶液在上述反应条件下在Imin内使底物降 解生成1 μ mol葡萄糖所需的酶量。酶活力的转换公式如下
权利要求
扩张青霉W4(Penicillium expansum)菌株，保藏编号为CGMCC NO.4077。
2.权利要求1所述菌株的培养方法，其是将菌株加入到PDA液体培养基中，30°C， 170r · mirT1 振荡培养 3d ；其中，PDA液体培养基为去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，pH7. 2 7. 4。
3.权利要求1所述菌株在降解木质纤维素中的应用。
4.权利要求1所述菌株在蘑菇培养料生物转化过程中的应用。
5.权利要求1所述菌株在制备蘑菇培养料的微生物菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述蘑菇培养料的微生物菌剂包括如下 重量份的组分扩张青霉W4 1-2份；稻糠和/或麦糠10-15份。
7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，所述的蘑菇培养料主要为农作 物秸秆。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的农作物秸秆为麦秸和/或稻草。
9.一种蘑菇培养料的微生物菌剂，其包括如下重量份的组分扩张青霉W4 1-2份；稻 糠和/或麦糠10-15份。
全文摘要
本发明公开了一种木质纤维素降解菌及其应用，所述木质纤维素降解菌为扩张青霉W4，保藏编号为CGMCC No.4077。该菌株能够产生纤维素酶和漆酶，能够降解秸秆木质纤维素，将其作为蘑菇培养料的微生物菌剂中的主要有效成分，具有缩短蘑菇培养料生物转化时间、提高蘑菇栽培基质品质的作用。尤其是针对家庭作坊堆置的少量蘑菇培养料的生物转化，在温度较低的环境下，具有明显的优势。
文档编号C05F11/08GK101974436SQ20101029014
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者王洪媛, 范丙全 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所