专利名称：hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程领域的植物基因序列及转基因的方法，具体涉及一种 hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法。
背景技术：
肝细胞癌(h印atocellular carcinoma,HCC)恶性程度极高，发病隐匿、转移早、死 亡率高，严重地危害人类健康，在众多致死性肿瘤中居第4位，在我国居于第2位。传统的手 术和放、化疗方法治疗肝癌有易复发、杀伤肿瘤细胞靶向性差的缺陷；抗体是目前肿瘤治疗 中靶标最明确的特异靶向药物。不过完整抗体存在分子量大(难以进入肿瘤组织)、有免疫 原性(目前抗体多为鼠源)、用量大和价格昂贵等缺陷，临床应用受限。因而，小分子量、人 源化的单链抗体是目前肿瘤靶向治疗的主要趋势，基因工程技术为人源化单链抗体的设计 和生产提供了可能。同时，牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana RNase, Rcr)分子量小、细 胞毒性强，是临床恶性肿瘤治疗常用的细胞毒素。目前临床用Rcr主要通过组织提取法获 得，因受组织来源和Rcr含量限制，限制了 Rcr临床应用(廖有地等，蛋白表达和纯，1996， 7(2) :194-202)。随着分子生物学和基因工程技术的发展和应用，利用基因工程技术生产 Rcr已成为可能，为Rcr生产和缓解或解决临床供不应求问题提供了一种新思路。经对现有技术文献的检索发现，虽然利用基因工程技术在人源化抗肝细胞癌单 nj^gjjxf^ (human-originate hepatocellular carcinoma single chain variable
fragments, hHscFv)表达研究取得了 一些进展，如付勇等(生物技术通讯，2003，14 (5) 353-356)、袁清安等(生物工程学报，2000，16(1) :86-90)和张静等(世界胃肠病学杂志， 2004,10(13) :1872-1875)利用原核系统(大肠杆菌)成功地表达了人源化抗肝细胞癌单 链可变区抗体。付勇等(肿瘤研究与临床，2004，16 ) =217-220)利用原核系统(大肠杆 菌)成功地表达了 Rcr，不过包括细菌在内的原核表达系统与某些真核表达系统如酵母、动 物细胞和转基因动物与高等植物表达系统相比，在安全性、生产成本和规模化生产方面存 在明显缺陷(Fischer等.转基因研究，2000，9 :279-299 ；Ma等.自然遗传学综述，2003，4 794-805)，目前尚未见有按植物偏爱密码子设计合成融合基因hHscFv-Rcr，在植物中表达 hHscFv-Rcr的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种hHscFv-Rcr基因序列及转 基因烟草的制备方法，通过构建植物表达载体，在植物中表达hHscFv-Rcr活性多肽，产品 对防止和治疗肝癌方面具有重要应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及一种hHscFv-Rcr氨基酸序列，具体如SEQ ID N0. 2所示。本发明涉及一种hHscFv-Rcr核苷酸序列，具体如SEQ ID NO. 1中第56-1258位所不。
在本发明提供的在植物中表达的hHscFv，它包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列 的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO. 2序列的多肽。在本发明的几种表达载体，它包含上述的DNA分子。本发明涉及一种利用植物系统表达上述hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，该方法包 括如下的步骤第一步、含hHscFv-Rcr表达载体的构建将含有融合基因hHscFv-Rcr的克隆载体 质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后 将其克隆到植物表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框 架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得包含目的基因表达载体 的工程菌；第二步、植物遗传转化，具体步骤为2. 1)将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周左右的无菌叶片，作为 外植体用于转化；2. 2)将灭菌后的植物(如烟草，不仅限于烟草)种子播于发苗培养基上，取生长两 周左右的烟草的无菌叶片，作为外植体用于转化；2. 3)将含有目的基因表达载体的工程菌(携带植物表达载体的根癌农杆菌)于 28°C摇菌培养至OD600 = 0 . 8 1. 0时，室温6，OOOrpm离心5 8分钟；2. 4)弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的外植体浸泡8 10分 钟；2. 5)将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养 培养基上在25°C共培养36小时；2. 6)共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25 光照下培养，培养 7 15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出；2. 7)待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养， 7 10天左右生根；2. 8)形成完整根系后，将植株取出，用自来水洗去附着在根系上的固体培养基，在 珍珠岩中驯化并用质量体积百分比为的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土 中。第三步、hHscFv-Rcr功能蛋白提取3. 1)取5g转基因烟草叶片，在加有液氮的研钵中研磨成粉末，然后转移至50mL 聚丙烯离心管中，并加入 5mL IXPBS (KH2PO4 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)；3. 2) 13000rpm 4°C离心 30 分钟；3. 3)收集上清于另一新离心管中备用。3.4)蛋白定量参考 Bradford 法(Bradford，1976)，取 2μ L 蛋白样品加 98μ L Bradford试剂混勻后，在酶标仪下(Bio-TEK，USA)测OD595的吸光值。所述的工程菌是指携带烟草表达载体的根癌农杆菌；所述发苗培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0. 22%，蔗糖为3%，植物凝胶为0.沈％，余量为蒸馏水；该发苗培养基的PH值为5. 8。所述液体MS培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0. 44%，蔗糖为3%， 余量为蒸馏水。该液体MS培养基的pH值为5. 8。所述共培养培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0. 44%，蔗糖为3%，植 物凝胶为0.，6-苄氨基嘌呤为0. 0001 %，α -萘乙酸为0. 00001%，余量为蒸馏水。该 共培养培养基的PH值为5.8。所述分化培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0. 44%，蔗糖为3%，植物 凝胶为0.沈％，6-苄氨基嘌呤为0. 0001 %，α -萘乙酸为0. 00001%，卡那霉素为0. 005 %， 羧苄青霉素为0. 025%，余量为蒸馏水。该分化培养基的pH值为5. 8。所述生根培养基的各组成成分的质量百分比为MS粉为0. 44%，蔗糖为3%，植物 凝胶为0.沈％，6-苄氨基嘌呤为0. 0001 %，α -萘乙酸为0. 00001%，卡那霉素为0. 005 %， 羧苄青霉素为0. 025%，余量为蒸馏水。该生根培养基的pH值为5. 8。本发明开辟了 hHscFv-Rcr蛋白生产的新途径，本发明的方法按植物偏爱密码子 设计人工合成的hHscFv-Rcr在植物系统表达其活性的生物产品对治疗癌症方面具有重大 作用及应用价值。本发明还提供了一种检测、分析DNA样品中是否存在hHscFv-Rcr基因， 蛋白样品中是否含有hHscFv-Rcr蛋白的研究方法，并对所述的蛋白生物活性和功能进行 了初步研究，为进一步的研究奠定了基础。
图1转基因烟草聚合酶链式反应(PCR)检测结果图；其中泳道M为DL2000 DNA分子量标准；泳道P为含表达载体质粒 p35S: hHscFv-Rcr (pCAMBIA2300骨架)的农杆菌EHA105作模板的阳性对照；泳道N为非 转基因烟草的阴性对照；其它泳道为独立的转基因烟草植株1-13。图2转基因烟草DNA分子杂交(Southern blot)分析图；其中左侧的数字是与酶切的基因组DNA共分离的λ /Hind III的DNA分子量标 准；泳道P为P35S: IhHscFv-Rcr质粒作模板的阳性对照；泳道ck为非转基因烟草植株；其 它泳道为独立的转基因烟草植株1-12。图3用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测hHscFv-Rcr基因在转基因烟 草的转录水平表达示意图；其中左图表示hHscFv-Rcr基因在转基因烟草株系中表达；CK为从非转基因烟草 植株叶片中提取RNA ；泳道1至泳道12分别为独立的转基因烟草植株1-12 ；Actin基因为 RNA用量的标准对照；图中数字为3次重复的平均值。图4转hHscFv-Rcr基因烟草总可溶蛋白免疫印迹(Western blot)分析图；其中泳道M为蛋白分子量标准；泳道ck为源自非转基因烟草叶片的总可溶蛋 白；其它泳道源自转基因烟草株系1，2，3，5，6，9，11，12总可溶蛋白；图左侧的数据为蛋白 分子量大小标准。图5转基因烟草表达的hHscFv-Rcr蛋白与不同肿瘤细胞的结合亲和力曲线其中HL_7702为人正常肝细胞，HepG2为人肝癌细胞，DV145为前列腺癌细胞， SGC-7901为人胃癌细胞，SPC为人肺癌细胞。
图6转基因烟草的hHscFv-Rcr蛋白的肿瘤抑制活性分析(MTT)其中!fepG2和SMMC7721为人肝癌细胞，DV145为前列腺癌细胞，HL-7702为人正 常肝细胞。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例包括以下步骤hHscFv-Rcr基因合成及载体构建1.基因合成(gene synthesis)本实施例的按植物偏爱密码子设计合成的hHscFv-Rcr基因全长为1272bp (包括 保护碱基和酶切位点组成的接头)，详细序列见SEQ ID NO. 1 ；合成之后连入pUC57载体，即 pUC57-hHscFv-Rcr。2.酶切(digestion of the restriction enzyme)用Bam H I 及 Sac I 双切 pUC57_hHscFv-Rcr，获得带有 Bam H I 及 Sac I 粘性末 端(与表达载体相同)的hHscFv-Rcr基因DNA片段；3.连接(ligation)将切下的hHscFv-Rcr基因连入已经用Bam H I及Me I切好的用pBI121改造过 的PCAMBIA2300植物双元表达载体大片段中，构建p35S:: hHscFv-Rcr，用PCR方法检测转化 的大肠杆菌，从而获得阳性克隆。4.基因PCR检测植物双元表达载体质粒p35S hHscFv-Rcr检测PCR 扩增体系 25μ L，包括弓丨物 hHscFvF(5，-atg gag gtt caa ctt gtt gag_3，) 禾口 RcrR(5，-tatggg cat ctt cca aat tcc agc_3，)各 1 μ L(10 μ mol/L),0. 3 μ L Taq DNA 聚合酶(5units/ μ L)，2· 5 μ L 的 10XPCR 缓冲液，1· 5 μ L 的 Mg Cl2 (25mmol/L)，2 μ L 模板 (待检菌液)，1. 5 μ L的dNIPs (2. 5mmol/L)，15. 2 μ L去离子无菌水，上覆20 μ L灭菌石蜡 油；PCR 条件:94°C 8min ；94°C 45s，55°C 45s, 72°C Imin (35 循环)；72°C延伸 8min ；电 泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1208bp。实施例2hHscFv-Rcr在烟草细胞中进行真核细胞表达1.含目的基因(hHscFv-Rcr)表达载体构建用Bam H I和Sac I将含有hHscFv-Rcr基因的克隆载体质粒pUC57_hHscFv-Rcr 进行酶切，用胶回收试剂盒(华舜生物技术有限公司，上海)回收目标DNA片段，获 得带有相应的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后将其克隆到植物双元表达载体pCA2300-twin (不限于此，也包括如pBI121或改造过的pCAMBIA2300等植物表达载体)中， 通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载 体质粒用冻融法转入农杆菌(如EHA105)中，并通过农杆菌介导法转化烟草。2.烟草遗传转化①将灭菌后的植物种子播于发苗培养基上，取生长两周左右的烟草的无菌叶片， 作为外植体用于转化；②将含有目的基因表达载体的工程菌于摇菌培养至0D_ = 0. 8 1. 0时，室 温6，OOOg离心5 8分钟；③弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的外植体浸泡8 10分 钟；④将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培 养基上在25°C共培养36小时；⑤共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25 光照下培养，培养 7 15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出；⑥待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，7 10天左右生根；⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩 中驯化并用质量体积百分比为的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。3.转基因烟草PCR检测①基因组DNA提取用CTAB法提取烟草基因组DNA (Stewart and Via, 1993)，取 50ng烟草基因组DNA作模板进行PCR检测；②PCR扩增体系25μL，包括引物hHscFvF(5’_atg gag gtt caa ctt gtt gag_3，) 禾口 RcrR (5，-tat ggg cat ctt cca aat tcc agc_3，)各 1 μ L (10 μ M/L), 0. 3 μ L Taq DNA 聚合酶(5units/y L)，2· 5μ L 的 10XPCR 缓冲液，1. 5 μ L 的 Mg Cl2 (25mmol/L)，2 μ L 烟草 基因组 DNA 模板(50ng)，1. 5 μ L 的 dNIPs (2. 5mmol/L)，15. 2 μ L 去离子无菌水，上覆 20 μ L 灭菌石蜡油；③PCR 条件94°C 8min ;94°C 45s，55°C 45s，72°C Imin (35 循环)；72°C延伸 8min; 电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1208bp ；④PCR产物检测用带有EB(ethidium bromide)的1. 0 % (w/v)琼脂糖胶在 IXTAE电泳缓冲液中电泳，然后在凝胶成像系统紫光下检测并拍照；见附图I。4.转基因烟草Southern blot分析①烟草基因组DNA提取和转膜用CTAB法提取烟草嫩叶基因组DNA(Stewart and Via，1993)，取30 μ g烟草 基因组DNA，用Hin dill酶切，琼脂糖胶进行电泳分离，然后转移到Hybond N+膜上 (Amersham Pharmacia，Uppsala，Sweden)；②探针标记、杂交和信号检测以质粒p35S: IhHscFv-Rcr为模版扩增得到含hHscFv-Rcr基因DNA片段，用于探 针标记；探针标记、杂交和信号检测使用Gene Images Random Primer Labeling method和 CDP-Stardetection module试剂盒(Amersham Pharmacia)，按生产厂家操作说明书指导进行。在62°C杂交12小时后，用洗膜液1(1 XSSC和0. 1% SDQ在62°C下洗杂交膜2次(各 15分钟)，然后用洗膜液II(0.5XSSC和0. 1% SDS)在62°C下洗杂交膜1次(15分钟)； 滴加显色液后将杂交膜置于富士 X-光片上暴光2-3小时检测杂交信号；见附图II。5.用RT-PCR检测hHscFv-Rcr在转基因烟草中转录①RNA提取按植物抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，上海)厂家说明抽提烟 草叶片总RNA ；RNA模板预先用DNase I (RNase-free, TaKaRa)处理以去除来自于烟草基因 组DNA的污染；②RT-PCR 体系用 one-step RT-PCR 试剂盒(TaKaRa，Japan)进行 RT-PCR 分析；RT-PCR扩增体系为50 μ L，包括5μ L的10 X One-st印RNA PCR缓冲液， 10 μ L 的 MgC12(25mM)，5μ L 的 dNTPs (IOmM)，1 μ L 的 RNase Inhibitor (40U/μ L)， IyL 的 AMV-Optimized Taq (5U/μ L) , 1 μ L 的 AMV-RTase XL(5U/y L) , HFl (RT) (5，-aggacttgttcaaccaggag-3，) (10 μ Μ)禾口 HRl(RT) :(5，_tccaatagcagaaacccac_3，) (10 μ Μ)各 1 μ L，1 μ L 的 Total RNA (1 μ g/ μ L)，24 μ L 的 RNase Free water ；③RT-PCR扩增条件RNA模板在50°C条件下逆转录30min ；95°C变性2min，随后 95°C变性45s，52°C退火45s and 72°C延伸Imin ( 个循环)；最后72°C再延伸Snin。④管家基因(Actin) RT-PCR检测作为Actin内源标准RT-PCR检测引物为Act-F 1 (5，-ggtagctcccacctgagaggaagt_3，)和 Act-Rl (5，_gcctttgcaatccacatatgc_3')；反应 体系和反应参数与烟草样品RT-PCR条件相同。⑤RT-PCR产物检测用1 %琼脂糖胶分离RT-PCR产物，每个样品hHscFv-Rcr转 录水平通过使用凝胶成像系统FR-200A(FuRi Tech, Shanghai, China)自动分析功能进行计 算；附图III。6.用western blot检测hHscFv-Rcr蛋白在转基因烟草叶片中的表达①蛋白提取(在冰浴上进行)a.取5g烟草叶片，在加有液氮的研钵中研磨成粉末，然后转移至50mL聚丙烯离心 管中，并加入 5mL IXPBS(KH2PO4 0. 2g/L, Na2HPO4 1. 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)；b. 13000rpm 4°C离心 30 分钟；c.收集上清于另一新离心管中备用。②蛋白定量参考Bradford法(Bradford，1976)，取2 μ L蛋白样品力口 98 μ L Bradford试剂混勻后，在酶标仪下(Bio-TEK，USA)测OD595的吸光值。③SDS-PAGE分离蛋白SDS_PAGE制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a.样品中加入等体积的含50mM DTT加样缓冲液QX加样缓冲液甘油2. 4g， IMTris-HCl ρΗ6· 8 ImL ；溴酚兰0. 01%, H2O定容至20mL)，沸水浴10分钟后置于冰上，冷 却后上样；b. 4°C冰箱中在100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前 沿达到凝胶底部；c.聚丙烯酰胺凝胶，其中一块用于考马斯亮兰(w ν = 2. 5% )染色，另一块用 于 Westernblot 分析。④蛋白质向PVDF膜上转移a.转移之前，用转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0. 037% SDS，20%甲醇)平衡凝胶和PVDF膜30分钟；b.室温下用半干式电转仪转移Ih，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；⑤PVDF膜蛋白检测c.将PVDF膜浸在封闭液中，37°C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶 粉溶于IOOmL的1 X PBS (含0. 5g叠氮钠))；d.再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37°C洗涤两次，每次15分钟；e.加入第一抗体(抗his tag的抗体)，37°C温育30分钟；同步骤b，洗涤三次；f.加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37°C温育30分钟；同步骤b，洗 涤两次；g.加入底物显色观察蛋白条带，见附图IV。7.烟草表达hHscFv-Rcr蛋白抗原结合的亲和力检测①消化各种癌细胞，调整细胞浓度为105/mL，将癌细胞倍比稀释为1 2、1 4、 1 8。以不同浓度的细胞(即细胞浓度分别为lX105/mL、0. 5X105/mL、0. 25X 105/mL、 0. 125X 105/mL)作为抗原铺板，200uL/孔，置5% C02孵箱中培养Mh。每个浓度抗原加10 个孔；②弃上清，以PBS轻轻洗板1次；③加4°C 预冷 0.05% 戊二醛，200 μ L/孔，以 PBS/0.05% Tween 洗 3 次；④30% H2A 1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物 酶。蒸馏水洗1-2次。⑤滴加5% BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗。⑥对于每个浓度抗原分别加入不同浓度的纯化scFv，100 μ L/孔，浓度依次为 160ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL，置 37°C 2h。PBS (pH7. 2-7. 6)洗 3 次，每次 2分钟；⑦每孔加入以封闭液稀释1 10000的HRP标记抗His-Tag抗体，100 μ L/孔，置 于 37°C lh。以 PBS (pH7. 2-7. 6)洗 3 次，每次 2 分钟。⑧滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，置于20-37°C 20分钟。PBS (pH7. 2-7. 6)洗3次， 每次2分钟。⑨滴加试剂SABC,置于20-370C 20分钟。PBS (ρΗ7· 2-7. 6)洗4次，每次5分钟。⑩DAB显色使用DAB显色试剂盒，室温显色，镜下控制显色时间，一般在5_30分 钟之间。蒸馏水洗涤。11置酶标仪(Bio-TEK，USA)中，在490nm波长读数。以OD值为纵坐标，抗体浓度 对数为横坐标作图。可作出四条曲线，找出50% OD值时抗体浓度。代入以下公式Ka = η-1/2 X (nAb，-Ab)8.烟草表达hHscFv-Rcr蛋白生物活性检测M MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 法检测烟草表达的 hHscFv-Rcr 蛋白生物活性[Mosmann，T. (1983) J. Immunol. Methods 65， 55-63]。①用PBS法提取转基因和非转基因烟草叶片总可溶蛋白，经滤膜(Millipore， 0. 45 μ m)除菌后，用IXPBS将浓度调整至0.5 μ g/μ L。
②用RPMI-1640液体培养基配成单个细胞悬液，以每孔IO3 4个细胞接种到96孔 板，每孔体积200 μ L C02，370C，饱和湿度下培养Mh。③随后取100 μ L烟草总可溶蛋白(不同浓度梯度)加入96孔板，3次重复。④实验同时设肝细胞、前列腺癌细胞、无药和无细胞对照组。⑤将96孔板放在37°C的C02 (v/v = 5% )细胞培养箱中培养48h，然后每孔中加 入20 μ L的MTT试剂，再培养4小时；⑥在倒置显微镜(Olympus CKX31, Japan)下定期地观察96孔板细胞，当有清晰可 见的紫色沉淀产生时，每一孔中加入150μ L的DMSO (dimethyl sulfoxide)，随后轻轻地摇 动96孔板，并将96孔板在室温下(黑暗)放置15分钟；⑦在酶标仪(Bio-TEK，USA)读OD57tl的吸光值，以样品剂量为横坐标，吸光值为纵 坐标绘制细胞生长曲线。⑧肿瘤细胞生长的抑制率(IC% )由下式求得ICV0=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]X 100%转基因烟草的hHscFv-Rcr蛋白生物活性的MTT检测结果见图VI。以上实施例中，“hHscFv-Rcr保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列 相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸替 换所形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表IhHscFv-Rcr保守性变异多肽氨基酸替换表
权利要求
1.一种hHscFv-Rcr氨基酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO. 2所示。
2.一种hHscFv-Rcr核苷酸序列，其特征在于，如SEQ ID NO. 1中第56-1258位所示。
3.一种根据权利要求1所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征 在于，包括如下的步骤第一步、构建含hHscFv-Rcr基因的表达载体将含有融合基因hHscFv-Rcr的克隆载体 质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因hHscFv-Rcr，然后 将其克隆到烟草表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框 架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得携带烟草表达载体的根 癌农杆菌；第二步、烟草遗传转化将灭菌后的烟草种子播于发苗培养基上，取生长两周左右的无 菌叶片，作为外植体用于转化；第三步、hHscFv-Rcr功能蛋白提取。
4.根据权利要求3所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的第二步具体包括2. 1)将含有目的基因表达载体的携带烟草表达载体的根癌农杆菌于摇菌培养至 OD600 = 0 . 8 1. 0时，室温6，OOOrpm离心5 8分钟；2. 2)弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的外植体浸泡8 10分钟；2. 3)将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养 基上在25°C共培养36小时；2. 4)共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25 光照下培养，培养7 15天可见愈伤组织的形成，约20天后可见分化芽长出；2. 5)待再生芽长至约3-4厘米时，将其切下移植到生根培养基上进行生根培养，7 10 天左右生根；2. 6)形成完整根系后，将植株取出，用自来水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠 岩中驯化并用质量体积百分比为的MS粉水溶液补充营养和水分，一周后移入土中。
5.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的发苗培养基的组分及其质量百分比为MS粉0. 22%、蔗糖3%、烟草凝胶0.沈％，余 量为蒸馏水；该发苗培养基的PH值为5. 8。
6.据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的液体MS培养基的组分及其质量百分比为MS粉0. 44%、蔗糖为3%，余量为蒸馏水； 该液体MS培养基的pH值为5. 8。
7.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的共培养培养基的组分及其质量百分比为MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶0. 26%, 6-苄氨基嘌呤0. 0001 %、α -萘乙酸0. 00001 %，余量蒸馏水；该共培养培养基的pH值5. 8。
8.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是， 所述的分化培养基的组分及其质量百分比MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶0.沈％、6-苄 氨基嘌呤0. 0001 %、α -萘乙酸0. 00001%、卡那霉素0. 005%、羧苄青霉素0. 025%，余量 蒸馏水；该分化培养基的PH值5. 8。
9.根据权利要求4所述序列的烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，其特征是，所述的生根培养基的组分及其质量百分MS粉0. 44%、蔗糖3%、烟草凝胶0.沈％、6-苄氨 基嘌呤0. 0001%、α -萘乙酸0. 00001%、卡那霉素0. 005%、羧苄青霉素0. 025%，余量蒸 馏水；该生根培养基的PH值5. 8。
全文摘要
一种基因工程技术领域的hHscFv-Rcr基因序列及转基因烟草的制备方法，该基因序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其烟草系统表达hHscFv-Rcr功能蛋白的方法，包括构建含hHscFv-Rcr基因的表达载体、烟草遗传转化以及功能hHscFv-Rcr蛋白提取，本发明通过构建植物表达载体，在植物中表达hHscFv-Rcr活性多肽，产品对防止和治疗肝癌方面具有重要应用价值。
文档编号A01H4/00GK102060930SQ20101056472
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者宋维, 崔丽洁, 张冉, 彭会珍, 赵凌侠 申请人:上海交通大学