专利名称：纳豆芽孢杆菌nt-6菌株生产的复合抗菌肽及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽及其方法，属于生物技术领域。该方法生产的抗菌脂肽具有广谱的抗菌活性和生物表面活性，在医药、农业、食品和环境治理等领域有广泛的应用前景。
背景技术：
细菌性豆豉(在日本称为纳豆)在中国是一种非常普遍的富含风味物质的大豆发酵食品，已有2000多年的历史。其发酵菌株是纳豆芽孢杆菌(feciBm natto)。纳豆芽孢杆菌能产生许多功能因子，使发酵产品对人体具有许多有益功能。目前，国内外针对纳豆菌的研究，主要集中在具有溶栓作用的代谢产物纳豆激酶。而其产生的抗菌作用，近些年来才受到人们重视。据文献报道，纳豆菌对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及大肠杆菌等致病菌的作用，其抗菌谱较广，而且具有一定的耐热性(钟青萍等，食品科学，2002，23 (10) 109- 112)。尽管对纳豆菌的抗菌性已有一些研究报道，但对其产生的抗菌物质多没有明确的研究报告。有研究者认为产生的抗菌物质是2，6-吡啶羧酸，也有人认为是多粘菌素或杆菌肽或抗菌蛋白，但没有鉴定的资料(纪宁等，食品研究与开发，2006，27 (1): 138-142);曹小红等对feciB^s natto TK-I菌株产生的抗菌物质进行了研究，发现了一种有抗菌活性的分子量为1036Da的脂肪酸链上有15 个碳的环状脂肽surfactin (曹小红等，中国生物工程志，2009，29 (2) :54-58).除此之外未见其它相关纳豆菌抗菌物质的鉴定文献，特别是未见一种菌株同时产生二十多种抗菌脂肽同系物的文献报道。抗菌脂肽具有生物表面活性和广谱的抗菌活性，对细菌、真菌、原虫和癌细胞具有很强的杀伤作用，在医药、农业、食品及化妆品、石油开采和环境治理等领域有重要的应用前景。特别是由于抗菌脂肽具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产的要求，在食品防腐、饲料添加剂、动物防病和农业生物防治等领域受到广泛的关注。
发明内容
本发明的主要目的是利用纳豆芽孢杆菌{Bacillus natto)通过深层发酵或固态发酵及下游工艺生产一种复合抗菌脂肽，此抗菌肽具有广谱的抗菌活性、PH适应范围广、耐热性能好、安全，可作为食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂和环境治理剂等。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是
1.本发明利用纳豆芽孢杆菌(feciBm /^ ο) NT-6菌株产生的抗菌肽，特征如下 该抗菌肽主要含有三组抗菌物质，它们的分子量分别为一组10432、1057.2、 1071. 0,1071. 0 ； 二组1491. 7、1492. 5、1505. 7、1519. 7 ；三组994. 3、1009. 0、1008. 8、 1009.9,1008. 7,1022.7,1022.6,1036.8,1036.5,1036. 6,1051. 8,1050. 6,1051. 2,1051. 6、1065.8,1080.2 (LC-MS图谱见附图1)。该抗菌肽为抗菌脂肽类物质，由一系列同系物组成，第一组物质为iturin系列，第二组物质为fengycin系列，第三组为surfactin系列；它们的比例分别是10 20%、25 35%和5(Γ60% ；纯品为黄色粘稠物；在水中溶解性好；能耐受 IOO0C 30min的加热；在pH 2_12活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；有广谱的抗菌活性，它对食源性致病菌，如金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血链球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌0157、单增李斯特氏菌、沙门氏菌等具有很好的抑制作用；对食品腐败细菌，如藤黄微球菌、大肠埃希氏杆菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、肠膜明串珠菌等，食品腐败霉菌， 如黑曲霉、米曲霉、少根根霉、青霉、镰孢菌、黄曲霉等抑制作用较好；对许多植物致病菌，如扩展青霉、点青霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病、小麦纹枯病菌、八角炭疽病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等显示了很强的抑制作用；对动物致病菌，如猪肠炎沙门氏菌、溶血性大肠杆菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、水霉、鳃霉、链弧菌等也有较好的抑制作用。 2.本发明生产上述复合抗菌肽是通过以下方法实现的
该方法采用的生产菌株为纳豆芽孢杆菌feciBm natto NT-6菌株，16SrRNA基因序列 GenBank 登录号为 JN180628 ； 所用培养基的组成为
1)种子培养基(g/L):胰蛋白胨8.(Tl2.0g，酵母膏3.0 8.0g，NaCl3.0 7.0g，水 IOOOmL, ρΗ7· 0 7· 5 ；
2)液体发酵培养基培养基-1:葡萄糖8.(Tl2.0g，谷氨酸钠3.(T7.0g，MgS04 0. 3 0. 7g, KCl 0. 3 0. 7g, KH2PO4 0. 8 1. 2g, FeSO4 0. 10 0· 20mg, MnSO4 3. 0 7· Omg, CuSO4 0. 15 0· 18mg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5 7· 0;或培养基-2:葡萄糖 8 12g，土豆 80 120g，水 IOOOmL ；
3)固体发酵培养基稻壳或甘蔗渣5(T80g，麸皮15 25g，谷氨酸钠;T7g，葡萄糖 3 7g，水 150mL ；
方法一将纳豆芽孢杆菌mcillus菌株通过种子培养基进行种子的扩
大培养，接种量为种子培养基体积的洲，28 35°C，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心， 沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；
方法二将纳豆芽孢杆菌iBacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩
大培养，接种量为种子培养基体积的洲，28 35°C，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；
方法三将纳豆芽孢杆菌iBacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩
大培养，接种量为种子培养基体积的2%，观 35°C，在液体培养基中进行液体深层发酵 30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品； 方法四将纳豆芽孢杆菌^Bacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩
大培养，将5-10%接种于固体发酵培养基，在观 37°C的条件下培养2 4天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混勻，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。上述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。本发明的主要优点和积极效果如下
1.本发明首次利用纳豆芽孢杆菌mcillus natto)生产抗菌肽，用于食品防腐和动物饲料添加剂、农用生物防治剂、动物防病剂等。目前实践中应用的天然抗菌肽如Msin、天蚕素、爪蟾素(magainins)等，其抗菌谱和pH适应范围相对较窄，使用范围受到一定限制。 而本发明的复合抗菌肽抗菌谱广(对多株革兰氏阴性、阳性细菌和霉菌有明显的抑制作用， 其中包括食源性致病菌、食品腐败菌、植物病原菌和动物病原菌等。)，在PH 2-12活性不丧失，因此，其适应范围较现使用的抗菌肽广。该抗菌肽能耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解，在动物消化道内仍能保持活性；且在100°C条件下加热30min活性不丧失，显示了能耐受食品加工及饲料制粒的高温处理的优越性。2.纳豆芽孢杆菌来源于食品，且其产生的抗菌肽经小鼠口服毒性试验证实无毒， 因此，在实际使用中具有极高的安全性。目前科学家经过实验证实，抗菌肽作为一种新型的食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性的特点，符合当今绿色安全食品生产及对环境友好的要求。3.本发明采用纳豆菌生产抗菌肽，可大规模工业化生产，生产周期短，且不受季节和气候变化等外在环境的影响，相对于动物来源的抗菌肽具有明显优势。4.本发明方法简便，成本低。
图1NT-6菌株发酵提取物的LC-MS离子流谱图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1
通过种子的扩大培养，再于发酵罐28 35°C，进行液体深层发酵30 48h，积累抗菌代谢产物，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心，沉淀用3-5倍甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。实施例2
纳豆芽孢杆菌(Bacillus菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵
罐在上述液体发酵培养基中进行液体深层发酵观 35°C，积累抗菌代谢产物30 48h，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。实施例3
纳豆芽孢杆菌(Bacillus菌株通过上述种子培养基的扩大培养后，于发酵
罐在上述液体发酵培养基中进行液体深层发酵观 35°C，积累抗菌代谢产物30 48h，发酵液经离心去除菌体，然后上清液经浓缩、3-5倍甲醇提取、干燥，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于500g/kg。实施例4
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)m-&菌株通过种子的扩大培养，5_10%接种于固体发酵培养基，经观 37°C的培养2 4天后，经甲醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混勻，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于100g/kg。实施例5
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)m-&菌株通过种子的扩大培养，5_10%接种于固体发酵培养基，经观 37°C的培养2 4天后，干燥，粉碎，得抗菌肽成品，通过高效液相色谱测定，抗菌肽含量不小于5g/kg，可用于动物饲料添加剂。
权利要求
1.纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于该复合抗菌肽是由 iturins、fengycins和surfactins三类抗菌脂肽同系物的混合物组成，它们的比例分别是10 20%、25 35%和50 60% ；其中iturins同系物分子量分别为10432、1057. 2、1071. 0、 1071. 0 ；Fengycins 同系物分子量分别为1491. 7、1492. 5、1505. 7、1519. 7 ；Surfactins 同系物分子量分别为:994. 3、1009. 0、1008. 8、1009. 9、1008. 7、1022. 7、1022. 6、1036. 8、 1036. 5,1036. 6,1051. 8,1050. 6,1051. 2,1051. 6,1065. 8,1080. 2 道尔顿(Da)，该复合抗菌肽为黄色粘稠物，水溶性好；能耐受100°c 30min的加热；在PH 2 12活性不丧失；耐受木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解；口服具有较高安全性；能抑制多种革兰氏阳性、阴性致病或腐败细菌，尤其对霉菌具有良好的抑制作用。
2.纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽的生产方法，其特征在于该方法采用的生产菌株为纳豆芽孢杆菌彻以natto NT-6菌株，16SrRNA基因序列GenBank登录号为 JN180628 ；所用培养基的组成为1)种子培养基(g/L):胰蛋白胨8.(Tl2.0g，酵母膏3.0 8.0g，NaCl3.0 7.0g，水 IOOOmL, ρΗ7· 0 7· 5 ；2)液体发酵培养基培养基-1:葡萄糖8.(Tl2.0g，谷氨酸钠3.(T7.0g，MgS04 0. 3 0. 7g, KCl 0. 3 0. 7g, KH2PO4 0. 8 1. 2g, FeSO4 0. 10 0· 20mg, MnSO4 3. 0 7· Omg, CuSO4 0. 15 0· 18mg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5 7· 0;或培养基-2:葡萄糖 8 12g，土豆 80 120g，水 IOOOmL ；3)固体发酵培养基稻壳或甘蔗渣5(T80g，麸皮15 25g，谷氨酸钠;T7g，葡萄糖 3 7g，水 150mL ；方法一将纳豆芽孢杆菌mcillus菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的洲，28 35°C，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后在上清液中加入HCl调整pH到2，静置后离心， 沉淀用甲醇或乙醇进一步提取，提取物经赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法二将纳豆芽孢杆菌iBacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的洲，28 35°C，在液体发酵培养基中进行液体深层发酵30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，经甲醇或乙醇提取后，浓缩干燥，经赋型剂吸附、得抗菌肽成品；方法三将纳豆芽孢杆菌iBacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，接种量为种子培养基体积的2%，观 35°C，在液体培养基中进行液体深层发酵 30 48 h，发酵液经离心去除菌体，然后将上清液浓缩，赋型剂吸附、干燥，得抗菌肽成品；方法四将纳豆芽孢杆菌^Bacillus菌株通过种子培养基进行种子的扩大培养，将5-10%接种于固体发酵培养基，在观 37°C的条件下培养2 4天后，再经甲醇或乙醇提取后，干燥，赋型剂吸附，混勻，得抗菌肽成品；或发酵后直接干燥，粉碎，得抗菌肽成品。
3.根据权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌NT-6菌株生产的复合抗菌肽，其特征在于所述的复合抗菌肽在食品防腐、饲料添加剂、医药和农用生物防治等方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌产生的复合抗菌肽及其生产方法，该复合抗菌肽产品为抗菌脂肽类物质iturins、fengycins和surfactins三类同系物的混合物，它们的比例分别是10~20%、25~35%和50~60%；该抗菌肽纯品为黄色粘稠物，能耐受100℃30min的加热，在pH2-12活性不丧失，对细菌、真菌具有广谱的抗菌活性，对原虫和癌细胞也具有强烈的杀伤作用，实验证实具有较高的安全性；本发明还公开了该复合抗菌肽的生产方法，用此法生产工艺简单、成本相对较低，可作为食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂、医药和动物防病剂等。
文档编号A01P1/00GK102321182SQ20111028301
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘唤明, 孙力军, 徐德峰, 王雅玲, 聂芳红 申请人:广东海洋大学