专利名称：人工合成用于转基因抗除草剂植物的epsps基因的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，本发明涉及一种抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因及其在抗草甘膦植株选育、组织细胞培养中的应用。
背景技术：
N-膦酰甲基甘氨酸，也称草甘膦，是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物难以对其产生抗性，低土壤残留量、易于被微生物分解等特点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的除草剂品种。然而由于草甘膦无选择性的杀死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了其在农业上的应用。为了获得抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反`应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。该酶只在植物和微生物中存在，在动物体中不存在。在一些极端环境下，如长期喷洒草甘膦的农田、草甘膦工厂的废液池以及人为的加大对某植株草甘膦的选择压力等，发现了部分对草甘膦具有耐受能力的细菌和植物。如Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，分离到一个耐受草甘膦的矮牵牛细胞系；Baers0n等人在长期喷洒草甘膦的果园中发现了一株耐受草甘膦的牛筋草，经过后期实验证明这些抗性的产生均为EPSPS基因发生了突变，导致了其与草甘膦的结合能力降低，并且保证了正常的催化能力。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、突光假单胞菌G2和Salmonella typhimuriumCT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。在植物和某些细菌中发现的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)对草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通过表达与草甘膦具有较低亲和力的EPSPS而获得，存在草甘膦时此酶也仍然保持其催化活性。植物对草甘膦耐受或对草甘膦具有抗性是指用草甘膦除草剂喷施植物后，植物可以正常生长发育。现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成酶不发生交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50%。在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如:CTP2, Klee 等，Mol.Gen.Genet.210:47_442，1987)，CTP 在叶绿体膜上从 EPSPS 酶上裂解下来，产生成熟的EPSPS。叶绿体转运肽对EPSPS酶行使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前提下，如果去掉信号肽，虽然整个植物组织EPSPS蛋白表达量一致，但是植株确不具有草甘膦抗性，不同来源的信号肽对EPSPS蛋白在不同转化受体中行使功能的效率存在差异(Guy della Cioppa 1988, Guy della Cioppal986)。密码子偏爱性是一个阻碍细菌基因在植物中表达的障碍。对于一个给定氨基酸的同义密码子，不同的物种会有不同的偏爱性。例如在苜蓿中精氨酸的密码子CGU出现的概率是罕见密码子CGG的50多倍。而在玉米中AGG和CGC是精氨酸常用密码子，CGG也经常被使用。玉米中许多常用密码子却在细菌中很少见，反之亦然。来源于细菌P.1uminescens的两个杀虫蛋白基因(tcdA和tcbA)的密码子使用频率中可以发现(Patent N0.US6，590，142B1)，丙氨酸的GCG密码子，谷氨酸的GAA密码子，亮氨酸的CTG密码子并没有在这两个细菌基因中使用。但是这些密码子在玉米中的使用频率大约是23%、20%和26%。所以对于来源于细菌的基因在转入植物之前都要根据宿主植物进行基因改造和密码子优化。在植物分子生物学领域内需要可提供阳性选择标记表型的各种基因。具体地说，草甘膦耐受可在植物中广泛地用作阳性选择标记，并且用在农作物生产中是很有价值的表型。当使用不同的阳性选择标记基因时，扩展了现有的转基因性状与新开发性状的堆积和组合。标记基因提供了不同的表型如抗生素或草甘膦耐受，或者通过DNA检测方法可区别的分子差异。通过多重抗生素或除草剂耐受分析，或通过DNA检测方法检测新型DNA分子的存在，可以筛选叠加性状的转基因植物。本发明提供了抗草甘膦EPSP合酶的DNA和蛋白组合物。本发明也提供了用于植物的DNA构建和展示草甘膦抗性的转基因植物。
发明内容
根据CP4EPSPS不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对CP4EPSPS (SEQ IDNo:1)的密码子及编码框进行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No:2)与原始的EPSPS同源性仅为88%，而G的含量由原来的31.2%变为35.5% ;C的含量也由原来的34.6%变为32.7%汀的含量由原来的16.4%变为15.2%，A的含量由原来的17.8%变为16.7%。同时我们在优化后的EPSPS 基因5’端增加了一个来源于高粱的叶绿体转运肽(SEQ ID No:3)，整合了叶绿体信号肽并经过密码子优化的CP4EPSPS基因我们命名为CC-M EPSPS (SEQID No:4) ο通过对转CP4EPSPS基因及CC-M EPSPS基因的玉米不同转化事件的分析，我们发现转CC-M EPSPS基因更容易获得高表达的转化事件。本发明的一方面是包含启动子的DNA构建物，此启动子在植物细胞中有功能，有效与优化后的CC-M分子连接。本发明的另一方面是一个制备转基因植物的方法，包括提供具有CC-M基因的植物表达载体，在允许植物表达载体能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体植物细胞与植物表达载体接触；选择包含植物表达载体的受体植物细胞；从选择的受体植物细胞再生植株；鉴定耐受草甘膦的转基因植物。本发明的又一方面是可育的草甘膦耐受的转基因植物，它包含具有CC-M基因的植物表达载体，将此转基因植物与其他植物杂交，以提供耐受草甘膦的子代植物。本发明的还一方面提供了在作物田地中杂草防除的方法，其中作物田地用有效量的含草甘膦除草剂处理，并且田间作物包含具有CC-M基因的植物表达载体。
附图简述
图1.CP4EPSPS基因的植物表达载体图2.CC-M EPSPS基因的植物表达载体图3.转CP4EPSPS基因的玉米检测结果图4.转CC-M EPSPS基因的玉米检测结果图5.转CP4EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果图6.转CC-M EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤参考(Sambrook 等人，分子克隆实验指南，New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。实施例1、CP4EPSPS基因的密码子优化。根据CP4EPSPS不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对CP4EPSPS (SEQ IDNo:1)的密码子及编码框进行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No:2)与原始的EPSPS同源性仅为88%，而G的含量由原 来的31.2%变为35.5% ;C的含量也由原来的34.6%变为32.7%汀的含量由原来的16.4%变为15.2%，A的含量由原来的17.8%变为16.7%。
权利要求
1.一种耐受草甘膦除草剂的EPSPS基因，其特征是该基因的序列如SEQ ID NO:2所/Jn ο
2.含有权利I所述的EPSPS基因的植物表达载体。
3.权利要求1所述的EPSPS基因在转化植物以使植物具备对草甘膦除草剂产生抗性的用途。
4.利用权利要 求1所述的EPSPS基因转化植物时，筛选转化阳性细胞组织的用途。
全文摘要
本发明涉及人工合成用于转基因抗除草剂植物的EPSPS基因，它较其密码子优化前更容易获得高表达的转基因植株。本发明也涉及利用该基因培育抗草甘膦植物的应用。
文档编号A01H5/00GK103074351SQ20121040617
公开日2013年5月1日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者赖锦盛, 赵海铭, 宋伟彬 申请人:中国农业大学