解淀粉芽孢杆菌及利用其制备的防治菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物防治烟草病害【技术领域】，具体涉及一种烟草内生细菌及利用该菌制备防治菌剂。防治烟草黑胫病的解淀粉芽孢杆菌CX-1已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7645。利用解淀粉芽孢杆菌CX-1制备的防治菌剂，通过菌种制备、菌液发酵、种子发酵液的制备、防治菌剂的制备等步骤实现。所制备的防治菌剂在稀释100~1000倍后用于防治烟草黑胫病。由于解淀粉芽孢杆菌CX-1本身为烟草的内生细菌，相较于其他外来引进菌种，更利于烟草病害的防治，对生态环境本身也更加安全。本发明所提供的防治菌剂的制备方法是在现有生物发酵工程基础上的简单改进，因此便于推广应用。
【专利说明】解淀粉芽孢杆菌及利用其制备的防治菌剂
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治烟草病害【技术领域】，具体涉及一种防治烟草黑胫病的烟草内生细菌解淀粉芽孢杆菌及利用该菌制备的防治菌剂。
【背景技术】
[0002]烟草既是我国重要的经济作物之一，也是受病害威胁最为严重的农作物之一。烟草从育苗到采收的各个阶段，都可受到病原物的侵害。烟草黑胫病(Tobacco Black Shank)是烟草生产上最具毁灭性病害之一，又称“烟草疫病”，它是由寄生疫霉烟草致病变种{Phytophthora parasitica var.nicotianae (Breda de Hean) Tucker)引起的一种土传性真菌病害。该病菌可在烟草苗期和大田期进行侵染，对烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有栽培烟草均可造成严重危害，但主要危害移栽后的大田烟株。病菌侵染后，大田烟株的茎基部出现黑褐色凹陷病斑，并很快扩展至髓部，病株叶片自下而上依次变黄，雨后如遇高温天气整株叶片呈现凋萎。
[0003]烟草黑胫病最早发现于印度尼西亚的爪哇，随后迅速蔓延到世界各地。目前该病害已遍布于全世界温带、亚热带和热带地区的烟田。我国烟草黑胫病危害严重的省份主要有安徽、河南、云南、四川、贵州、湖南、山东、福建等，据估测我国每年因黑胫病造成的直接经济损失超过I亿元。
[0004]目前对于烟草黑胫病的防治主要有农业防治、化学药物防治和筛选培育抗病苗株等几类措施。农业防治措施主要是实行与烟草黑胫病病菌非寄主植物进行轮作，生产实践中这一措施对于发生黑胫病严重的田块防效甚微，并且在我国人多地少的情况下实施轮作可行性较低。筛选培育抗病苗株的育种措施看似能从根本上解决黑胫病危害，但生产实践中面临很大的局限性，主要 表现为一方面可供区域栽培的抗性品种有限，另一方面抗病品种丧失抗病性的周期越来越短，甚至出现了育种速度赶不上品种抗性丧失的速度。化学药物防治黑胫病害近年来得到了极为广泛的应用，一些化学农药如甲霜灵、敌克松等在生产上已广为使用，但对黑胫病的防治效果并不十分理想，并且黑胫病菌对此类化学药剂已经逐渐产生了抗药性，同时化学农药的大量使用，势必会降低烟叶的质量和使用安全性，也给生态环境带来严重的破坏。
[0005]近年来，随着人类环境保护和自身健康意识的增强，利用生态学规律对各类病虫害进行生物防治成为了研究热点。生物防治具有防治成本低、绿色安全、环保无污染等优良特点，因此是未来病虫害综合防控的最重要手段和发展方向。现有技术中，对于烟草黑胫病采用生物防治措施已有一些较好的实施例，例如中国专利号2007103000874(—种防治烟草黑胚病的菌株及其菌剂)所公布一种淡紫拟青霉ZY-19-2 {Padlomyces hVaci/HAs),属于内寄生性真菌；中国专利号200810233500.4 (一种防治烟草黑胫病的地衣芽孢杆菌菌剂及其制备方法)所公布的一种地衣芽孢杆菌GP13 {Bacillus 7icAe/7i/br?i5.),为革兰氏阳性杆菌；再如中国专利号201210159083.X (一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3)所公布的一种枯草芽孢杆菌Trb3 (.Bacillus也为革兰氏阳性菌。以上这些工作为防治烟草黑胫病的提供了一些新的选择和方法，但是更加有效的防治黑胫病则仍然需要提供更多新的微生物菌种和防治方法。
[0006]解淀粉芽孢杆菌(ifeci77i/5.amyloliquefaciens)是一种工业生产上应用较为普遍的菌种，主要用于生产各类酶制剂(中国专利，201210277040.1)。近年来，对解淀粉芽孢杆菌的进一步研究发现，这类细菌在自身的生产过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物具有广泛地抑制真菌和细菌活性的作用，利用这一特性可以将其应用于植物病害防治例如植物炭疽病防治和果蔬保鲜等方面(车晓曦、李校堃，解淀粉芽孢杆菌amyloli quefaci ens )的研究进展,2010,北京农业)。但是,解淀粉芽孢杆菌作为一种烟草内生细菌，将其用于防治烟草黑胫病，则尚未见到有关报道和应用。
【发明内容】
[0007]本发明目的在于提供解淀粉芽孢杆菌、利用其制备的防治菌剂。
[0008]本发明采用的技术方案如下:
一种用于防治烟草黑胚病的解淀粉芽孢杆菌CX-1 {Bad Ilus amyloli quefaci ensCX-1),已于2013年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.7645。
[0009]一种利用解淀粉芽孢杆菌CX-1制备的防治烟草黑胫病的防治菌剂，通过以下步骤制备:
(O囷种制备
将解淀粉芽孢杆菌CX-1菌 种接种到试管斜面培养基上，32°C恒温培养72小时，获得试管种，斜面培养基配方为:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，琼脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(2)菌液发酵
将在步骤(1)制备的试管种中加入IOml无菌水，用接种环洗下菌苔，充分震荡形成细菌悬浮液，按照体积比1:200的比例将细菌悬浮液接种到无菌且容积为600ml的三角瓶中，三角瓶中装有无菌且温度低于35°C的培养液1，在转速为120rpm、温度为32 °C条件下的震荡培养72小时，培养液I配方为:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏Ig/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(3)种子发酵液的制备
将步骤(2)制备的菌液与培养液2按照体积比为1:100的比例接入到容积为30L的种子罐中，种子罐内的溶氧量为18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵至细菌含量大于2 X IO11 CFU/ml为止，培养液2配方为:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母膏
1.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ；
(4)防治菌剂的制备
将步骤(3)制备的种子发酵液与培养液3按照体积比1:100的比例接入生产发酵罐，生产罐的溶氧量为18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，当菌含量大于2X IO11CFU/ml，酸碱度为7.0~7.6时，存储作为防治菌剂，培养液3配方为:蔗糖10 g/L，土豆200g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L ；
步骤(4)所制备的防治菌剂在稀释100-1000倍后用于防治烟草黑胫病。
[0010]步骤(4)所制备的防治菌剂在稀释100倍后于烟苗移栽7d和14d后灌根施用，施用量为50ml/株。
[0011]本发明所采用的解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株，属于革兰氏阳性细菌，对此类细菌在生物防治方面的应用是目前的研究热点，本发明所提供的此类细菌在烟草黑胫病防治方面的应用为进一步开发利用此类细菌提供了新的可能。另一方面，由于此类细菌本身即为烟草的内生细菌，当其作为烟草病害的防治菌种时相较于其他外来引进菌种，更利于烟草病害的防治，对生态环境本身也更加安全。由于芽孢杆菌类细菌在工业生产应用过程中的发酵制备技术较为完善，对其稍加改变即可用于制备生物防治菌剂，因此本发明所提供的生防菌剂的制备方法有利于此类细菌在生物防治应用方面的推广使用。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0013]实施例1
解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株已与2013年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7645。
[0014]利用解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株制备的防治烟草黑胫病防治菌剂，通过以下方法步骤制备:
(O囷种制备
将解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株接种到试管斜面培养基上，32°C恒温培养72小时，获得试管种，斜面培养基配方为:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，琼脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(2)菌液发酵
在步骤(1)制备的试管种中加入IOml无菌水，用接种环洗下菌苔，充分震荡形成细菌悬浮液，按照体积比1:200的比例将细菌悬浮液接种到无菌且容积为600ml的三角瓶中，三角瓶中装有无菌且温度低于35°C的培养液1，然后在转速为120rpm、温度为32 1:条件下的震荡培养72小时，培养液I配方为:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L, ρΗ6.8~7.0 ；
(3)种子发酵液的制备
将步骤(2)制备的菌液与培养液2按照体积比为1:100的比例接入到容积为30L的种子罐中，种子罐内的溶氧量18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵至细菌含量大于2 X IO11 CFU/ml为止，培养液2配方为:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 8/1，酵母膏1.5g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ；
(4)防治菌剂的制备
将步骤(3)制备的种子发酵液与培养液3按照体积比1:100的比例接入生产发酵罐，生产罐的溶氧量为18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，当菌含量大于2X IO11CFU/ml，酸碱度为7.0~7.6时，存储作为防治菌剂，培养液3配方为:蔗糖10 g/L，土豆200g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L ；
实施例2
为检验本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株针对烟草黑胫病的防治效果，发明人在温室条件下进行了解淀粉芽孢杆菌CX-1菌株针对烟草黑胫病的防治实验。
[0015]温室实验所用烟草试验材料为品种K326，试验地点为云南农业大学国家工程中心。本实验中用于盆栽烟苗的土壤来自往年烟草黑胫病发病较重的田块，即利用带菌土壤中的病原菌诱发烟草黑胫病。本领域技术人员也可根据实际情况利用土壤稀释法从土壤中分离得到病原真菌，再回接烟株使烟株发病。
[0016]将实施例1所制备的解淀粉芽孢杆菌CX-1的防治菌剂分别稀释成100倍、500倍、1000倍，分别在烟苗移栽7d和14d后灌根施用，施用量为50ml/株。以25%甲霜灵可湿性粉剂500倍液为药剂对照，以清水为空白对照。每个处理3次重复，各处理随机排列。
[0017]移栽后40天和60天各调查一次病情指数，病情指数计算方法如下:
病情指数=Σ [各级病株数X该病级值]X 100 /调查总株数X最高病级数值；其中烟草黑胫病分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(YC / T39-1996)规定执行，即根据烟草发病病情分为5级，具体标准为:
O级:不发病；
I级:茎基部变为黑褐色，病基长度不超过茎长1/4 ；
2级:黑褐色病茎长度达茎长1/4~1/2 ；
3级:病茎长度超过茎长1/2，且全株萎蔫；
4级:全株基本变为黑褐色，死亡。
[0018]根据病情指数最终计算防治菌剂的相对防效，并据此数值判断防治效果，相对防效的计算方法如下:
相对防效=(对照病情指数一处理病情指数)XlOO /对照病情指数 具体调查结果如下表:
表1防治菌剂对烟草黑胫病防效的温室试验
【权利要求】
1.解淀粉芽抱杆菌CX-1 (.Bacillus amyloliquefaciens CX-1), 2013 年 5 月 27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7645。
2.一种利用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌CX-1制备的防治烟草黑胫病的防治菌剂，通过以下步骤制备: (O囷种制备 将解淀粉芽孢杆菌CX-1菌种接种到试管斜面培养基上，32°C恒温培养72小时，获得试管种，斜面培养基配方为:葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，琼脂 18 g/L, ρΗ6.8~7.0 ； (2)菌液发酵 在步骤(1)制备的试管种中加入IOml无菌水，用接种环洗下菌苔，充分震荡形成细菌悬浮液，按照体积比1: 200的比例将细菌悬浮液接种到容积为600ml的无菌三角瓶中，三角瓶中装有温度低于35°C的无菌培养液1，在转速为120rpm、温度为32 1:条件下的震荡培养72小时，培养液I配方为:蔗糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，酵母浸膏I g/L，ρΗ6.8~7.0 ； (3)种子发酵液的制备 将步骤(2)制备的菌液与培养液2按照体积比为1: 100的比例接入到容积为30L的种子罐中，种子罐内的溶氧量为18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵至细菌含量大于2 X IO11 CFU/ml为止，培养液2配方为:蔗糖10 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母膏 1.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.1 g/L, MnSO4 0.02g/L, KH2PO3 I g/L ； (4)防治菌剂的制备 将步骤(3)制备的种子发酵液与培养液3按照体积比1: 100的比例接入生产发酵罐，生产罐的溶氧量为18%~20%，搅拌速度为180rpm，32°C条件下发酵，发酵5小时后，每隔2小时对发酵罐进行发酵质量检测，观察含菌量、测定发酵液的酸碱度，当菌含量大于2 X IO11〇?~1111、？!1为7.0~7.6时，存储作为防治菌剂，培养液3配方为:蔗糖10 g/L，土豆200 g/L, MgSO4 0.5 g/L, MnSO4 5g/L。
3.权利要求2所述防治菌剂的应用，用于防治烟草黑胫病。
4.如权利要求3所述防治菌剂的应用，其特征在于:防治菌剂稀释100-1000倍后灌根使用。
5.如权利要求4所述防治菌剂的应用，其特征在于:防治菌剂稀释100倍后分别于烟苗移栽7d和14d时灌根施用，施用量为50ml/株。
【文档编号】A01N63/00GK103602610SQ201310440630
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】陈小龙, 王军, 冯剑, 谢剑, 吴庆华, 高尊华, 刘爱玲, 王墨染, 张展, 王逸飞, 尹光庭, 韩冰, 王建忠 申请人:河南中烟工业有限责任公司