一种利用杨树ABA受体PtPYRL基因培育转基因节水抗旱植物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杨树ABA受体PtPYRL基因在植物节水抗旱中的应用，通过从目的植物杨树中克隆ABA受体PtPYRL基因家族的基因，再通过分子生物学和转基因手段，采用农杆菌介导的基因转化及转基因植株的节水抗旱研究，建立了高效的外植体再生体系，进行了遗传转化条件的研究，获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因植株无菌组培苗，本发明可培育转基因节水抗旱，且抗风沙的植物品种，应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，在造林绿化以及防止土地沙化等方面有广阔的市场前景。
【专利说明】—种利用杨树ABA受体PtPYRL基因培育转基因节水抗旱植物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程，生物遗传工程，基因工程【技术领域】，涉及一种节水抗旱植物培育的转基因技术。
【背景技术】
[0002]杨属Populus L.在全世界约有100多种,广泛分布于欧亚和北美洲。我国约有62种，是世界杨树种质资源最多的国家。杨树是退耕还林的主要树种之一，具有适应地域广，生长速度快，成活率高，种植简单等特点。国内外均将其作为绿化环保的首要树种，杨树不仅用于防风固沙、保土留肥、防止土壤沙化，而且还具有广泛的工业用途，是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料。随着速生高产杨树的不断推广，各地杨树种植产业迅猛发展，目前我国杨树人工林面积已超过700万公顷，居世界首位。
[0003]山新杨，树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，侧枝细长，先端及腋芽密生绒毛，光滑无棱，几乎与主干平行向上生长，树姿秀丽整洁美观。短枝叶盾形或圆形，叶宽3-4.5厘米，长3-4.5厘米，先端短渐尖，边缘有六大锯齿，半透明边缘，叶柄及叶背具银白色绒毛，叶表暗绿色。果序长7-10厘米，有蒴果实60以上，果序自然脱落不飞絮。该品种与对照品种新疆杨比较，树冠山新杨从尖塔型到椭圆型，新疆杨一般是圆柱型或尖塔型，短枝叶山新杨是盾形或圆型，新疆杨是近圆形或椭圆形，叶缘山新杨有6大锯齿，半透明边缘，叶柄及叶背具银白色或短绒毛，新疆杨叶缘有粗缺齿，几乎无色。山新杨适应性强，抗逆性好，试验证明，该品种在最低气温-39.5摄氏度，昼夜温差22摄氏度的条件下，无冻害发生。该品种 生长速度较快，6年生平均树高7.26米，平均胸径7.3厘米，喜生长于土壤肥沃、水分充足的砂质土壤。山新杨生根能力较差，常规扦插成活率低，一般现采用嫁接方法繁殖。
[0004]一直以来，杨树的改良主要通过杂交育种的方式进行，但因其生长发育受光照、水分、温度很多因素影响，与其它农作物和园艺植物比较，有许多特有的生物学特性，如较长的生长周期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得传统的杨树育种方法已远远不能满足现代育种的要求，所以利用组织培养和基因工程方法来满足实践中对杨树育种的要求具有重要的意义。
[0005]随着分子生物学理论和技术的快速发展，功能基因的克隆和转基因技术已广泛应用到植物抗性的研究领域。尽管以木本植物为实验材料的林木基因工程因研究难度较大，进展相对滞后，但是由于杨树生长速度快，易繁殖，核基因组(约420Mb)及染色体数目相对较小，易于通过农杆菌转化，使得杨树成为研究树木分子生物学、林业生物技术及树木基因组的模式植物。
[0006]根癌农杆菌介导的基因转化方法是目前应用最广泛且技术较为成熟的转基因方法。它具有操作简便，外源基因插入一般为低拷贝，整合位点稳定，转移DNA片段明确，整合后外源基因结构变异小，可转移大片段DNA，可直接用不同的植物组织进行基因转移等优点。已经被广泛用于单子叶及双子叶植物的遗传转化研究。目前成功报道的转基因植物有烟草、拟南芥、番茄、玉米、杨树、水稻、大豆、棉花、小麦、甜菜、油菜等。
[0007]植物在应答环境胁迫(例如干旱，冻和盐)时，植物激素脱落酸(abscisic acid,ΑΒΑ)是植物生长发育的重要调节因子，ABA几乎在除了古细菌之外的所有生命王国都有存在。高水平的ABA浓度导致种子休眠(Finkelstein et al.，2008)，抑制种子萌发和侧根的形成(Xiong et al.，2006)，促进气孔关闭减少水分通过气孔的呼吸(Hetherington, 2001; Kim et al., 2010),促进器官的脱落,抑制生长和加速衰老，促进水分吸收提高抗逆性。干旱和盐胁迫都会导致ABA的积累，起始许多适应的应答反应。ABA最初是在二十世纪六十年代，人们在研究棉铃脱落以及木本植物休眠等生理过程有关的生长抑制物质时发现的。在1967年召开的第六届国际植物生长物质会议上，这种生长调节物质正式被定名为脱落酸。
[0008]植物激素与受体结合是其信号传导途径的一个至关重要的过程，因此自从植物激素发现以来，人们就对他们之间的相互作用与结合机制展开了深入的研究。受体是细胞表面或者亚细胞组分中一种天然分子，可以识别并特意地与生物活性的化学信号物质(配体)结合从而激活或者启动一系列生物化学反应，最终导致该信号物质特定的生物学效应。近年来，利用生化，遗传和分子生物学等研究手段，在植物中分离鉴定了不同的植物激素受体，并在其作用机理方面取得了较大的进展。
[0009]ABA受体是处于ABA信号通路最上游的信号调节组分，它发挥着对ABA信号的识别和启动ABA信号通路下游蛋白响应的角色。起初通过遗传学分析ABA的感知没有发现可以做为ABA受体的蛋白，表明ABA受体可能是功能冗余的。最近通过化学遗传学的方法发现，人工合成的pyrabactin可以激活ABA信号通路，pyrabactin在抑制萌发和应答环境胁迫过程中发挥着功能(Toh et al.，2008)。遗传分析发现pyrabactin在生物体内发挥作用时PYRl是必须的，但是通过检测PYRl基因缺失突变体对ABA的反应的研究发现在生物体内该基因有基因冗余现象发生(Toh et al., 2008) 0 ABA的感知和信号转导由所谓的核心信号组分组成，包括PYR/RCAR (pyrabactin抗性/ABA受体调节组分)(Ma et al., 2009; Parket al., 2009),蛋白憐酸酶 PP2Cs (Schweighofer et al.，2004)和 SNFl 相关的蛋白激酶SnRK2 (Mustilli et al., 2002; Yoshida et al., 2006; Umezawa et al.，2009)。拟南芥中PYRl被认为是配体结合的START蛋白家族的成员，它是一个ABA的受体，充当蛋白磷酸酶PP2C家族成员(ABI1，ABI2，HAB1等)的负调节因子。通过抑制PP2C的活性从而激活SNFl相关的蛋白激酶SnRK2的蛋白激酶活性，从而启动该信号通路的下游组分，包括ABF/AREB/ABI5类型的亮氨酸拉链转录因子，离子通道和NADPH氧化酶。在拟南芥基因组中有13个基因与PYRl有很高的相似性，被命名为PYL1-PYL13 (PYRl-Like)。基因芯片的数据表明，PYR/PYL mRNAs在种子，保卫细胞和应答ABA时高水平表达(Park et al.，2009)，这与其在ABA信号通路中的角色相一致。
[0010]在杨树中，至今还没有关于ABA受体基因研究的报道，我们通过序列比对的方法，在杨树中找到同源性最高的PtPYRL基因家族，并克隆了该家族的基因进行遗传学分析。
【发明内容】
[0011]本发明提供了一种山新杨(PopulusdavidianaXP.bolleana Loucne)农杆菌转基因的方法。本发明的目的在于利用转基因技术，在杨树基因组上可以有效插入外源基因并使插入的外源基因可以稳定地表达、而对受体植株的农艺性状没有明显的不良影响，并且可以改良杨树的性状。
[0012]本发明公开了杨树ABA受体PtPYRL基因家族的基因PtPYRLl_PtPYRL14在提高植物节水抗旱功能中的应用。
[0013]本发明所述的植物包括但不限于杨树，还包括油菜，小麦，大麦，大豆，棉花，水稻，烟草，玉米，番茄，芦竹，高粱、拟南芥等。
[0014]本发明还涉及利用杨树ABA受体PtPYRL基因培育转基因节水抗旱杨树的方法，是将杨树ABA受体基因家族的PtPYRL基因整合在山新杨基因组中，使其在杨树中超量表达，获得转基因节水抗旱的转基因山新杨新品种，提高林木经济价值。所改变的基因与所采用的方法不仅具有可操作性，还能明显改善植物在干旱环境中的生长状况。
[0015]所述PtPYRL基因是PtPYRLl至PtPYRL14，它们的序列分别如SEQ ID N0.1-14所示。
[0016]以培育转基因节水抗旱杨树为例，具体步骤是:
[0017](I)构建含有ABA受体PtPYRL基因的植物表达载体pCAMBIA1301，转化根癌农杆菌EHA105 ；
[0018](2)挑取单克隆农杆菌到LB培养基(含有Kan50mg/L，Spec50mg/L, Rif50mg/L)中，置于28°C摇床中180-220rpm过夜震荡培养至0D0.6 ；
[0019](3)将菌液8000rpm离心5分钟，沉淀用MS培养基悬浮；
[0020](4)将杨树(山新杨Populus davidianaXP.bolleana Loucne)的叶片外植体放入到农杆菌菌液中，侵染30分钟；
[0021](5)从菌液中取出叶片外植体，置于无菌滤纸上吸干表面残留的菌液，放在MS培养基上，28 °C共培养3天；
[0022](6)取出上述共培养的叶片外植体，直接转移到新鲜的MS培养基上(含Tim400mg/L, Hyg50mg/L, BA0.5mg/L, NAA0.lmg/L)；
[0023](7)光照培养下，待不定芽长到l_2cm左右，放入到MS生根培养基中C^NAA0.1mg/L, Tim400mg/L);
[0024](8)经过组织培养扩繁后，进行各种生理检测。
[0025]本发明还公开了一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID N0.1_14所示的核苷酸序列至少40%同源性的序列。
[0026]本发明通过从目的植物杨树中克隆ABA受体PtPYRL基因家族的基因，再通过分子生物学和转基因手段，以杨树优良品种山新杨为试材，采用农杆菌介导的基因转化及转基因植株的节水抗旱研究，建立了高效的外植体再生体系，进行了遗传转化条件的研究，获得了转基因再生植株，组培快繁了大量转基因植株无菌组培苗，本发明可培育转基因节水抗旱，且抗风沙的植物品种，应用于国家三北防护林建设以及绿化环保、防风固沙等公用事业以及林纸一体化建设项目，在造林绿化以及防止土地沙化等方面有广阔的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是转基因杨树用的构建好的植物表达载体示意图。[0028]图2是转基因杨树在含有潮霉素抗性的培养基中再生示意图。
[0029]图3是转基因杨树PCR分子鉴定电泳图谱。
[0030]图4是转基因杨树的⑶S染色。
[0031]图5是转基因杨树和野生型杨树节水抗旱实验结果。
[0032]图6是转基因杨树和野生型杨树干旱后复水实验结果。
[0033]图7是转基因烟草和野生型烟草干旱节水实验结果。
[0034]图8是转基因芦竹在含有潮霉素的培养基中再生出转基因小苗示意图。
[0035]图9是转基因玉米和野生型玉米干旱处理8天的结果。
[0036]图10是转基因大豆在含有潮霉素抗性的培养基中再生示意图。
[0037]图11是转基因水稻示意图。
[0038]图12是转基因甜菜在节水条件下生长示意图。
【具体实施方式】
[0039]以下实施方式步骤将结合附图对本发明作进一步说明。
[0040]实施例一
[0041]1、分别以SEQ ID N0.15和16所示序列以及SEQ ID N0.17和18所示序列为引物，毛果杨基因组为模板，克隆得到目标序列PtPYRLl (如SEQ ID N0.1所示)和PtPYRL5 (如SEQ ID N0.5所示)，PtPYLRl和PtPYRL5基因同源性为53.67%，将所述目标序列分别通过多克隆位点Xbal、Sail和BamH1、Sail构建到植物表达载体pCAMBIA1301 (购买自南京百思禾生物科技有限公司)上(如图1)；
[0042]5’ GGGTCTAGAATGACTGACCCAGCACAACAAGAAC3’ (SEQ ID N0.15)
[0043]5’ GGGGTCGACTTATTTACCGTCACCGTCACGAGC3’ (SEQ ID N0.16)
[0044]5’ GGGGGATCCATGCCTGCATCACTACAGCTCCAG3’ (SEQ ID N0.17)
[0045]5’ GGGGTCGACTCATGATGATGTAGAAATCTGGGCAT3’ (SEQ ID N0.18)
[0046]2、将克隆到的含有ABA受体PtPYRLI和PtPYRL5基因的植物表达载体转化到EHA105农杆菌细胞中，28°C暗培养2天；
[0047]3、挑取单克隆农杆菌到LB培养基(含有Kan50mg/L，Spec50mg/L, Rif50mg/L)中，置于28°C摇床中180-220rpm过夜震荡培养至0D0.6 ；
[0048]4、收集菌液，8000rpm离心5分钟，沉淀用MS培养基悬浮至0D0.5 ；
[0049]5、将杨树的叶片切成正方形小块，去掉边缘，用镊子将叶片进行小规模的创伤，然后放入到农杆菌菌液中，侵染30分钟；
[0050]6、从菌液中取出 叶片外植体，置于无菌滤纸上吸干表面残留的菌液，放在MS培养基上，28°C共培养3天；
[0051]7、取出上述共培养的叶片外植体，直接转移到新鲜的MS培养基上(含Tim400mg/L, Hyg50mg/L, BA0.5mg/L, NAA0.lmg/L)；
[0052]8、光照培养下，待不定芽长到l-2cm左右，放入到MS生根培养基中(含NAA0.1mg/L, Tim400mg/L)(如图 2);
[0053]9、经过组织培养扩繁后，进行各种生理检测。
[0054]10、利用pCAMBIA1301载体上的N0S-T序列设计反向PCR引物SEQ ID N0.19，并分别利用PtPYRLl和PtPYRL5的正向引物SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.5进行转基因植株的PCR鉴定(如图3)；
[0055]5’CGCAAGACCGGCAACAGG3’ (SEQ ID N0.19)
[0056]11、剪取转基因PtPYRLl和PtPYRL5的叶片进行⑶S染色分析，鉴定转基因植株，转基因植株⑶S染色会显蓝色(图4)；
[0057]12、对转基因苗进行节水耐旱生理学分析，干旱处理5天可以看到PtPYRLl和PtPYRL5转基因植株与野生型有明显的区别(图5)。
[0058]13、干旱处理8天后，对转基因植株和野生型植株分别做复水处理，PtPYRLl和PtPYRL5转基因植株大部分可以正常存活，而野生型不能复活(图6)。
[0059]14、研究结果表明，虽然PtPYRLl和PtPYRL5基因同源性在53.67%，但他们在节水抗旱研究中具有相似的生物学功能。
[0060]实施例二
[0061]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到PtPYRL3和PtPYRL4，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，用含有pCAMBIA1301/PtPYRL3和4的农杆菌培养液感染野生型烟草叶片切片，在共培养培养基(MS培养基)上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+lmg/L6-BA、0.lmg/L NAA、25mg/L潮霉素)，20-23天后，将再生的转基因幼苗切下，转移到生根培养基上(MS+0.lmg/L NAA)诱导生根，并进行转基因鉴定，具体方法与实施例一相同。
[0062]2、研究发现，转基因烟草相`比较野生型在干旱处理后可以延长萎蔫时间达到3-5天以上。干旱处理后复水恢复烟草的生长，转基因烟草的存活率相比较野生型提高42%。
[0063]实施例三
[0064]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到PtPYRL6和PtPYRL7，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，用含有pCAMBIA1301/PtPYRL6和7的农杆菌培养液感染野生型芦竹基部，在共培养培养基(MS培养基)上共培养2天后，转移到再生培养基上(MS+lmg/L6-BA、0.lmg/L NAA、25mg/L潮霉素)，25-30天后，将再生的转基因幼苗切下(如图8)，转移到生根培养基上(MS+0.lmg/L NAA)诱导生根，并进行转基因鉴定，具体方法与实施例一相同。
[0065]2、研究发现，转基因芦竹相比较野生型芦竹在干旱处理后可以延长萎蔫时间达到5天以上。干旱处理后复水恢复芦竹的生长，转基因芦竹的存活率相比较野生型提高86%。
[0066]实施例四
[0067]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到PtPYRL8和PtPYRLlO，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，用含有pCAMBIA1301/PtPYRL8和10的农杆菌培养液感染野生型玉米外植体，在共培养培养基(MS培养基)上共培养2天后，转移到生根培养基上(MS+0.lmg/L NAA)诱导生根，并进行转基因鉴定，具体方法与实施例一相同。
[0068]2、研究发现，通过干旱处理，转基因玉米萎蔫速度明显比野生型慢，干旱处理8天后，野生型植株大部分已经萎蔫，失去了生长活力，而转基因玉米仍然可以保持较为充沛的生命活力(图9)。
[0069]实施例五
[0070]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到？丨?￥此11和？丨?￥此12，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，并转化到大豆中(图10)，并进行转基因鉴定，具体
方法与实施例一相同。
[0071]2、转基因大豆抗旱试验，研究发现，转基因大豆在200mM甘露醇中萌发，萌发率明显高于野生型大豆，萌发率提高24-28%，通过多次试验在25%。经过干旱试验，转基因大豆可以延迟植物在干旱条件下萎蔫的速度，萎蔫速度明显慢于野生型植株。
[0072]实施例六
[0073]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到PtPYRL9和PtPYRL13，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，并转化到水稻中(图11)，并进行转基因鉴定，具体 方法与实施例一相同。
[0074]2、转基因水稻抗旱试验，研究发现，转基因水稻在200mM甘露醇中萌发，萌发率明显高于野生型水稻，萌发率提高19-24%，通过多次试验在20%。
[0075]实施例七
[0076]1、利用与实施例1相同的方法从杨树种克隆得到PtPYRL14，并将该基因插入到植物表达载体PCAMBIA1301中，并转化到甜菜中(图11)，并进行转基因鉴定，具体方法与实施例一相同。
[0077]转基因甜菜抗旱试验，研究发现，转基因和野生型甜菜间断性给水试验的结果表明，转基因甜菜的生长速度和生长量明显高于野生型甜菜(图12)。
【权利要求】
1.杨树ABA受体PtPYRL基因家族的基因PtPYRLl-PtPYRLH在提高植物节水抗旱功能中的应用，所述PtPYRLl-PtPYRLH的序列分别如SEQ ID N0.1_14所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物是杨树，油菜，小麦，大麦，大豆，棉花，水稻，烟草，玉米，番茄，芦竹，高粱或拟南芥。
3.一种利用杨树ABA受体PtPYRL基因培育转基因节水抗旱杨树的方法，其特征在于，将PtPYRL基因整合在山新杨基因组中，使其在杨树中超量表达，获得转基因节水抗旱的转基因山新杨新品种 。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述PtPYRL基因是PtPYRLl-PtPYRLH之一。
5.一种分离的蛋白质，其具有与SEQ ID N0.1-14所示的核苷酸序列至少40%同源性的序列。
【文档编号】A01H5/00GK103773801SQ201410061177
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】杨磊, 唐仁杰, 刘华, 兰文智 申请人:南京大学