一种根癌土壤杆菌scuec1菌株及其筛选方法和用途
【专利摘要】本发明提供了一种根癌土壤杆菌(Agrobacterium?tumefaciens)SCUEC1菌株，该菌株的保藏编号为：CCTCC?NO：M2014133，该菌株的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。该菌株的不仅能够运用于烟碱降解中，而且还能够加快烟叶成熟。本发明同时还提供了一种筛选分离上述菌株的方法，包括以下步骤：首先富集培养，然后分离纯化最后将分离纯化后的菌株按单菌落接种于烟碱培养基中，在室温下摇床培养1-3天后，测定烟碱培养基的发酵液中烟碱含量，根据烟碱降解率的大小来复筛菌株，从而得到根癌土壤杆菌(Agrobacterium?tumefaciens)SCUEC1菌株。
【专利说明】—种根癌土壤杆菌SCUEC1菌株及其筛选方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降解烟碱的微生物菌株，具体涉及一种根癌土壤杆菌SCUECl菌株，以及该菌株的筛选方法和用途，属于烟碱降解【技术领域】。
【背景技术】
[0002]烟碱不仅是存在于烟草中的最重要的化学成分，烟碱含量的高低对烟草产品的质量起着相当重要的作用。目前，我国烤烟烟碱含量普遍偏高，尤其是上部烟叶更加明显，如:神农架周边地区部分区域烟叶外观质量已接近国内和国际先进水平，但一些产烟县烟叶烟碱含量高达3.5%~4.5%，白肋烟上部烟碱含量更是高达6%。这不但影响了上部烟的质量，而且影响上部的可用性，给卷烟配方工业带来了困难，制约了上部烟叶市场经营。
[0003]迅速有效降低高烟碱含量烟叶中的烟碱含量是烟草行业所面临的现实问题，因而，国内外对降低高烟碱含量烟叶中的烟碱含量作了大量研究，这些研究大都集中在生态、栽培因子、物理措施降低烟碱含量，如施肥、过滤、打孔稀释、烟草薄片等，而对利用生物技术降解烟碱研究报道较少。
[0004]中国发明专利申请(申请号为:200710013068.3，200710013069.8，200710070805.3,200910097536.9，等)，这些专利涉及的菌株对烟碱具有有效的降解性能，
唯一的缺点是在室内实验室条件下进行烟碱降解，对于真实生产的田间烟叶是否具有作用还未经实验证实。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种根癌土壤杆菌SCUECl (Agrobacterium tumefaciens SCUECI)菌株，该菌株的不仅能够运用于烟碱降解中，而且还能够加快烟叶成熟。
[0006]本发明提供的根癌土壤杆菌SCUECl菌株，该菌株于2014年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学，该菌株的保藏编号为=CCTCCNO:M2014133，该菌株的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本发明同时还提供了一种筛选分离上述菌株的方法，包括以下步骤:
[0008](1)、富集培养:将烟草种植田的土壤放入烟碱培养基中，在室温条件下摇床培养，培养1-3天后，将富集液转接至新鲜烟碱培养基中继续培养，重复培养转接步骤三次以上，以达到富集的目的，收集富集培养液备用；
[0009](2)、分离纯化:采用生理盐水按梯度逐级稀释富集培养液，然后将稀释液涂布在烟碱分离培养基中，进行培养，然后选取生长速度快、生长势头好的菌株进行分离纯化；
[0010](3)、将分离纯化后的菌株按单菌落接种于烟碱培养基中，在室温下摇床培养1-3天后，测定烟碱培养基的发酵液中烟碱含量，根据烟碱降解率的大小来复筛菌株，从而得到根癌土壤杆菌(Agrobacteriu m tumefaciens) SCUECl 菌株。
[0011]所述的培养步骤具体为:在30°C条件下，采用180rpm摇床培养，培养时间为48h。
[0012]所述的生理盐水为质量浓度0.9%的生理盐水。[0013]本发明提供的根癌土壤杆菌SCUECl菌株具有以下优点:1、该菌株的降解能力强，经测试，在实验室中该菌株的降解率最高可达到96.63%，在田间试验中，该菌株的烟碱降解率最高可达26.07%。2、该菌株能够加速烟叶的成熟。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例中烟碱降解率曲线表。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0016]本实施例中所提供的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014133，该菌株的16S核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，包括1189个碱基。
[0017]本实施例中提供的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl的筛选分离方法如下:(1)、富集培养:将烟草种植田的土壤2g放入烟碱培养基20mL中，在30°C条件下采用180rpm摇床培养，培养48h后，将ImL富集液转接至新鲜烟碱培养基中继续培养，重复培养转接步骤三次，以达到富集的目的，收集富集培养液备用；
[0018](2)、分离纯化:采用质量浓度0.9%的生理盐水按梯度逐级稀释富集培养液，然后将稀释液涂布在烟碱 分离培养基中，进行培养，然后选取生长速度快、生长势头好的菌株进行分离纯化；
[0019]在此步骤中由于烟碱分离培养基以烟碱作为唯一碳源，氮源为无机盐，因此能在此分离培养基上生长的微生物就是可能具有降解烟碱的能力的微生物。
[0020](3)、将分离纯化后的菌株按单菌落接种于烟碱培养基中，在室温下摇床培养1-3天后，测定烟碱培养基的发酵液中烟碱含量，根据烟碱降解率的大小来复筛菌株，从而得到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl 菌株。
[0021]虽然能在以上烟碱分离培养基上生长的菌株有可能具有降解烟碱的能力，但还有可能只是耐烟碱并不降解它，所以本步骤中要对纯化的菌落进行复筛。
[0022]将本实施例中筛选得到的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl菌株进行实验室烟碱降解实验，经分析后确定最优降解条件为:烟碱初始浓度为2g/L、温度为30°C、初始pH为5.5-6.0、以蛋白胨和牛肉膏各0.5%作为复合氮源、微量元素的浓度为5mL/L，在此最优条件下烟喊降解率能达到96.63。实验结果如图1所不，在图1中可以看出，随着培养时间的增长，烟碱浓度逐渐降低，而吸光度不断升高。
[0023]然后进行田间烟碱降解实验，将将本实施例中筛选得到的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl菌株制成菌悬液,将菌悬液处理采收前的新鲜烟叶，试验完成后，经测定可有效降低烟叶中烟碱含量，烟碱降解率为26.07%。同时，经试验发现根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl还能加速烟叶成熟。
【权利要求】
1.一种用于烟碱降解的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl菌株,该菌株的保藏编号为=CCTCC NO:M2014133，该菌株的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—种权利要求1所述菌株的筛选分离方法，其特征在于包括以下步骤: (1)、富集培养:将烟草种植田的土壤放入烟碱培养基中，在室温条件下摇床培养，培养1-3天后，将富集液转接至新鲜烟碱培养基中继续培养，重复培养转接步骤三次以上，以达到富集的目的，收集富集培养液备用； (2)、分离纯化:采用生理盐水按梯度逐级稀释富集培养液，然后将稀释液涂布在烟碱分离培养基中，进行培养，然后选取生长速度快、生长势头好的菌株进行分离纯化； (3)、将分离纯化后的菌株按单菌落接种于烟碱培养基中，在室温下摇床培养1-3天后，测定烟碱培养基的发酵液中烟碱含量，根据烟碱降解率的大小来复筛菌株，从而得到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) SCUECl 菌株。
3.根据权利要求2所述的筛选分离方法，其特征在于:所述的培养步骤具体为:在30°C条件下，采用180rpm摇床培养，培养时间为48h。
4.根据权利要求2所述的筛选分离方法，其特征在于:所述的生理盐水为质量浓度.0.9%的生理盐水。
5.权利要求1所述的菌株在烟碱降解中的用途。
6.权利要求1所述的菌株在加快烟叶成熟中的用途。
【文档编号】A01N63/00GK103992973SQ201410216950
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】李晓华, 孔文, 郭利, 李阳, 杨振飞, 王晓丽, 何冬兰, 程国军, 刘涛, 李开, 曹丽君, 陈涛, 龚传清, 李永辉, 曹祥练 申请人:中南民族大学