本发明涉及亚氨基噻唑烷类化合物的新用途，具体地说，涉及2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物的新用途。
背景技术：
在植物病害的综合治理中，化学药剂能够有效地抑制病原物的生长、繁殖和侵染以及诱导寄主抗病性，从而控制病害的发生流行和为害。在世界范围内，每年使用化学药剂可挽回15％～30％农作物产量损失。与其它防治措施相比，化学防治具有防治范围广、见效快、成本低、使用方便，甚至多病兼治等优点，因而化学防治已成为保护农作物生产和健康不可缺少的重要措施。但是，随着化学杀菌剂的广泛、单独和过量使用，许多病原菌如：水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、油菜菌核病菌、苹果炭疽病菌、黄瓜黑星病菌、番茄叶霉病菌、柑桔青霉菌等已相继产生了抗药性，并且抗药性水平不断升高，严重威胁到了化学防治的有效性。
在现有化学杀菌剂中，植物病原菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性最为突出，田间灰霉病菌(Botrytis cinerea)对多菌灵的中、高抗菌株的抗药性倍数已达到262.7倍及1000倍以上，抗药性频率达到80％以上；小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)对多菌灵的抗药性水平可稳定遗传，且抗性菌株适合度高，在田间逐渐成为优势种群。部分地区田间小麦白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)对三唑酮的敏感性已下降几倍至几十倍。部分地区地黄瓜和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)已对甲霜胺普遍发生高度抗药性。甲霜灵在欧洲防治黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)一年后，该病害对甲霜灵的抗药性水平高达500倍。大量使用二甲酰亚胺杀菌剂(如：速克灵、农利灵、菌核净和异菌脲等)防治草莓灰霉病，两年即产生抗药性，防效明显降低，造成大量烂果，甚至在田间链核盘菌(Monilinia fructicola)、核盘菌(Sclerotinia homoeocarpa)和白腐小核菌(Sclerotium cepivorum)等重要的植物病原真菌已出现既抗苯并咪唑类杀菌剂又抗二甲酰亚胺类杀菌剂的双抗菌株。
综上，农用杀菌剂的抗药性已经成为农药工业所面临的最突出的问题。研究和开发具有防病效果优异、作用机制新颖、用量少且防效高或不易产生抗性的新药剂，尤其是能够降低现已产生抗性杀菌药剂选择压力的新药剂，是有效控制植物病害和延长现有杀菌剂使用寿命的重要措施。通过交替、轮换或复配使用，来减轻自然抗药菌株对杀菌剂的抗药风险，延缓或克服抗药性的发生和发展。
技术实现要素：
式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物为已知化合物(Phosphorus，Sulfur，and Silicon&the Related Elements，2006，181，2851-2861)。现该类已知化合物主要用于检测油菜菌核病菌(CN 103571910A)。随着研究的深入，本发明的发明人发现：式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物不仅可以用于检测油菜菌核病菌，而且对植物病原菌的草酸生物合成途径中的关键酶-草酰乙酸酶的活力具有明显的抑制作用(换而言之，其能抑制植物病原菌合成草酸(致病因子))。
此外，本发明的发明人还发现：式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物可作为苯并咪唑类杀菌剂(如″多菌灵″(Carbendazim)等)、二甲酰亚胺类杀菌剂(如″异菌脲″(Iprodione)等)、麦角甾醇生物合成抑制剂(如″三唑醇″(Triadimenol)等)等农用杀菌剂的增效剂。
式I中，R1～R5分别独立选自：氢(H)，卤素(F、Cl、Br或I)，甲基(CH3)或三氟甲基(CF3)中一种，且R1～R5不同时为H。
因此，本发明的目的在于，揭示式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物的新用途：
(1)式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物作为抑制植物病原菌中草酰乙酸酶活力的抑制剂的用途；或，式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物作为抑制植物病原菌合成草酸的抑制剂的应用；和，
(2)式I所示的2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物作为苯并咪唑类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂和麦角甾醇生物合成抑制剂的增效剂的应用。
附图说明
图1.为″氯噻唑烷″对植物病原菌中草酰乙酸酶活力抑制的柱状图。
具体实施方式
术语说明：本文中所述″氯噻唑烷″是式I中，R1，R2，R4和R5为H，R3为Cl的化合物(即3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷)的简称。
下面以氯噻唑烷为例，分别测定其对植物病原菌中草酰乙酸酶活力抑制活性，对植物病原菌草酸分泌的抑制活性，对植物病原菌的抑菌活性及对苯并咪唑类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂和麦角甾醇生物合成抑制剂的增效效果。
其中，采用Wadley分析模型计算增效药剂对目标杀菌剂的增效比，Wadley分析模型的参考文献分别为Wadley(1967)和Tak等(2016)。在该模型中，A和B为两种杀菌药剂，a和b是A和B两杀菌组分在混剂中含量的比值，EC50为杀菌药剂对植物病原菌生长的抑制中浓度，SR值为增效比。
计算公式为：EC50(理论值)＝(a+b)/[(a/EC50A)+(b/EC50B)]；
SR值＝EC50(理论值)/EC50(实测值)。
其中：SR≤0.5，表示拮抗作用；SR＝0.5-1.5，表示相加作用；SR≥1.5，表示增效作用。具体参见：(1)Wadley F M，Experimental statistics in entomology，Graduate School Press，USDA，Washington，DC.1967.和(2)Tak JH，Jovel E，Isman MB.Comparative and synergistic activity of Rosmarinus officinalis L.essential oil constituents against the larvae and an ovarian cell line of the cabbage looper，Trichoplusia ni(Lepidoptera：Noctuidae).Pest Manag.Sci.2016，72(3)，474-480。
实施例1
氯噻唑烷抑制植物病原菌(以油菜菌核病菌为例)中草酰乙酸酶活力的测定：
将油菜菌核病菌的菌碟(直径6mm)接入含50μg/mL的氯噻唑烷的Watanabe培养基摇瓶中，置于25℃、180rpm条件下恒温培养至2、4、6、8、10天，收集菌丝，用双蒸水冲洗3次，双层纱布过滤后，将菌丝放入已预冷的研钵中，加入2mL的0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0，含有1mmol/L的EDTA，1mmol/L的PMSF，1mmol/L的DTT)和适量石英砂在冰浴下匀浆，于4℃下14,000g离心30min，收集上清液作为粗酶。酶活力的测定反应液包括0.1mL的粗酶液、0.1mL的1.0mmol/L草酰乙酸、0.05mL的0.3mmol/LMnCl2和2.8mL的0.1mol/L咪唑缓冲液(pH7.6)，加入草酰乙酸启动反应，反应液在35℃水浴30min，而后在100℃下7min终止反应，然后在波长340nm处测定每分钟吸光度的降低值，连续记录3min内的OD值，计算酶活力。酶活力计算公式为U/mg＝(E255×3)/(0.0011×Ew)，式中：E255表示255nm处每分钟内吸光度的降低值，Ew表示酶液中含有的酶的含量(mg)，0.0011表示340nm处1μmoL的NADH的吸光度(参见图1)。
实验表明：在培养至第8天时，对照组中草酰乙酸酶活力增强至348.68pkat/mg蛋白，而50μg/mL氯噻唑烷处理中草酰乙酸酶活力均约为110pkat/mg蛋白。即，到第8天时，草酰乙酸酶活力的抑制率为68％(参见图1)。因此，氯噻唑烷对油菜菌核病菌中草酰乙酸酶的活力具有明显的抑制作用。
实施例2
氯噻唑烷抑制植物病原菌(以油菜菌核病菌为例)草酸分泌的测定：
分别将油菜菌核病菌的菌碟(直径6mm)接种于50mL含50μg/mL PMAS的PSB培养基摇瓶中，置于25℃、180rpm条件下恒温振荡培养，每隔1d收集0.2mL滤液，然后加入0.15mL溴酚蓝溶液(1mmol/L)、0.099mL硫酸溶液(1.0mol/L)、0.176mL重铬酸钾溶液(100mmol/L)和2.5mL双蒸水，摇匀。在60℃水浴中反应10min后，加入0.6mL氢氧化钠溶液(1.0mol/L)终止反应，在波长为600nm处读取OD值，根据标准曲线计算草酸的含量，具体结果见表1(不同处理时间中氯噻唑烷对油菜菌核病菌草酸分泌的影响)。
表1
实施例3
氯噻唑烷抑制植物病原菌活性的测定：
用融化的PSA培养基将氯噻唑烷母液稀释成1.563、3.125、6.25、12.5、25、50和100μg/ml系列浓度，并在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在供试病原菌的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算氯噻唑烷对病原菌生长的抑制率(％)，采用最小二乘法计算氯噻唑烷抑制病原菌生长的EC50值，具体结果见表2.(氯噻唑烷对18种植物病原菌活性抑制数据)。
表2.
续表2
由表2可知，氯噻唑烷对18种植物病原菌都具有一定程度的抑菌活性，其中对番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等生长的抑制中浓度最小，作用48h时的EC50值分别为13.37和17.83μg/ml。氯噻唑烷对小麦赤霉病菌生长的抑制作用最弱，EC50值分别为41.16μg/ml。
实施例4
氯噻唑烷对苯并咪唑类杀菌剂的增效效果的测定(以油菜菌核病菌SS01为测试菌株)：
以油菜菌核病菌SS01为测试菌株，以广泛应用的苯并咪唑类杀菌剂的典型代表一″多菌灵″(Carbendazim)为杀菌剂。用融化的PSA培养基分别将多菌灵母液、氯噻唑烷母液、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1，质量比，下同)母液稀释成0.098、0.196、0.392、0.784、1.563、3.125、6.25、12.5、25和50μg/ml系列浓度，并在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在油菜菌核病菌SS01(室内长期保存的敏感菌株)的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算杀菌样品抑制油菜菌核病菌SS01生长的EC50值。结果见表3.(多菌灵、氯噻唑烷、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)对油菜菌核病菌SS01的抑菌活性数据)。
表3.
由表3可知，多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌SS01的抑菌活性显著高于多菌灵或氯噻唑烷，所述混合物的增效系数达3.56，说明氯噻唑烷对多菌灵抑制油菜菌核病菌敏感菌株SS01具有增效作用。
实施例5
氯噻唑烷对苯并咪唑类杀菌剂的增效效果的测定(以油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25为测试菌株)：
以油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25为测试菌株，以广泛应用的苯并咪唑类杀菌剂的典型代表-″多菌灵″(Carbendazim)为杀菌剂。用融化的PSA培养基分别将多菌灵母液、氯噻唑烷母液、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)母液稀释成系列浓度，其中多菌灵单剂浓度为25、50、100、200和400μg/ml；氯噻唑烷单剂浓度为6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)混合物浓度为6.25、12.5、25、50和100μg/ml。然后在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在油菜菌核病菌Hm25(采自上海市郊油菜田，经室内分离后获得的抗性菌株)的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算杀菌样品抑制油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25生长的EC50值。结果见表4(多菌灵、氯噻唑烷、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)对油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25的抑菌活性数据)。
表4.
由表4可知，多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25生长的抑制中浓度(EC50)显著低于多菌灵、稍高于氯噻唑烷，所述混合物的增效系数为1.64，说明氯噻唑烷对多菌灵抑制油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25同样具有增效作用。
实施例6
氯噻唑烷对苯并咪唑类杀菌剂的增效效果的测定(以番茄灰霉病菌为测试菌种)：
用融化的PSA培养基分别将多菌灵母液、氯噻唑烷母液、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)母液稀释成系列浓度，其中多菌灵单剂浓度为0.016、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml；氯噻唑烷单剂浓度为6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)混合物的浓度为0.016、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0μg/ml。然后在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在番茄灰霉病菌的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算杀菌样品抑制番茄灰霉病菌生长的EC50值。结果见表5(多菌灵、氯噻唑烷、多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)对番茄灰霉病菌的抑菌活性数据)。
表5.
由表5可知，多菌灵+氯噻唑烷(1∶1)混合物对番茄灰霉病菌的抑菌活性显著高于多菌灵或氯噻唑烷，所述混合物的增效系数达2.76，说明氯噻唑烷对多菌灵抑制番茄灰霉病菌具有增效效果。
实施例7
氯噻唑烷对二甲酰亚胺类杀菌剂的增效效果的测定(以油菜菌核病菌SS01和油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25为测试菌株)：
以油菜菌核病菌SS01为测试菌株，以广泛应用的二甲酰亚胺类杀菌剂的典型代表-″异菌脲″(Iprodione)为杀菌剂。用融化的PSA培养基分别将异菌脲母液、氯噻唑烷母液、异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)母液稀释成系列浓度，其中异菌脲单剂浓度为0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml；氯噻唑烷单剂浓度为6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物的浓度为0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml。然后在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在油菜菌核病菌SS01的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算杀菌样品抑制油菜菌核病菌SS01生长的EC50值，结果见表6a(异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混剂对油菜菌核病菌SS01的抑菌活性数据)。
表6a.
以油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25替换油菜菌核病菌SS01，重复上述步骤。计算杀菌样品抑制油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25生长的EC50值，结果见表6b(异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25的抑菌活性数据)。
表6b.
由表6a可知，异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌SS01生长的抑制中浓度(EC50)显著低于异菌脲和氯噻唑烷，所述混合物的增效系数为2.41，说明氯噻唑烷对异菌脲抑制油菜菌核病菌SS01生长具有增效作用。
同样，由表6b可知，异菌脲+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌Hm25生长的抑制中浓度(EC50)等于异菌脲，而显著低于氯噻唑烷，所述混合物的增效系数为2.05，说明氯噻唑烷对异菌脲抑制油菜菌核病菌Hm25同样具有增效作用。
实施例8
氯噻唑烷对麦角甾醇生物合成抑制剂的增效效果的测定(以油菜菌核病菌SS01和油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25为测试菌株)：
以油菜菌核病菌SS01为测试菌株，以广泛应用的麦角甾醇生物合成抑制剂的商品化品种一三唑醇(Triadimenol)为例。用融化的PSA培养基分别将三唑醇母液、氯噻唑烷母液、三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)母液稀释成系列浓度，其中三唑醇单剂浓度为0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml；氯噻唑烷单剂浓度为6.125、6.25、12.5、25、50μg/ml；三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物的浓度为0.032、0.064、0.127、0.313、0.625、1.25和2.5μg/ml。然后在直径为9.0cm的培养皿中制成含药平板。在油菜菌核病菌的菌落边缘打取直径为6.0mm菌碟，接种于含药平板中央，置于25℃恒温培养48h时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算供试药剂抑制油菜菌核病菌多菌灵敏感菌株生长的EC50值，结果见表7a(三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌SS01的抑菌活性数据)。
表7a.
以油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25替换油菜菌核病菌SS01，重复上述步骤。计算杀菌样品抑制油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25生长的EC50值，结果见表7b(三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌田间抗性菌株Hm25的抑菌活性数据)。
表7b.
由表7a可知，三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌SS01生长的抑制中浓度(EC50)低于三唑醇和氯噻唑烷，所述混合物的增效系数为3.27，说明氯噻唑烷对异菌脲抑制油菜菌核病菌SS01生长具有增效作用。
同样，由表7b可知，三唑醇+氯噻唑烷(1∶1)混合物对油菜菌核病菌Hm25生长的抑制中浓度(EC50)高于异菌脲、显著低于氯噻唑烷，混合物的增效系数为0.68，说明氯噻唑烷对三唑醇抑制油菜菌核病菌Hm25具有相加作用。
以上以氯噻唑烷为例，说明了本发明所述2，3-二取代亚氨基噻唑烷类化合物(式I所示化合物)对植物病原菌中草酰乙酸酶活力具有抑制作用，能抑制植物病原菌的草酸分泌，对植物病原菌具有抑菌活性，可作为苯并咪唑类杀菌剂、二甲酰亚胺类杀菌剂和麦角甾醇生物合成抑制剂的增效剂。式I中所包含的其它化合物具有同样功效，限于篇幅，恕不在此一一赘述。