专利名称：核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法
技术领域：
本发明涉及核酸片段，该片段具有促使位于下游的结构基因表达的功能，它还涉及含此核酸片段的重组载体以及使用该片段进行结构基因表达的方法，它又涉及一种根据表达方法促使所要结构基因表达的植物。
背景技术：
将遗传工程的手法应用于植物研究时促进外源基因的表达是必不可少的技术。其中一个技术就是利用DNA片段促使基因的表达并产生表达效果。作为促使外源基因表达的DNA片段，已知有若干内含子(Simpson andFilipowicz 1996.Plant Mol.Biol.321-41)，主要有玉米的乙醇脱氢酶的内含子(Callis et al.Gene & Development1，1183-1200，1987)，还有水稻磷脂酶(以下称「PLD」)的第一内含子(国际专利WO96/30510)。另外有关来自内含子的DNA片段曾有这样报道事例将内含子的内部序列删除一部分或者是在内含子的内部插入同一内含子均对基因表达具有促进作用(Mascarenhas et al.Plant Mol.Biol..15，913-920 1990；Clancy etal.Plant Sci.98，151-161 1994)。
然而，事实上能够利用的DNA片段的种类很有限，每个DNA片段的作用因植物种类不同而不同，即使是同一种植物因其器官或者是组织的不同而各有差异(Simpson and Filipowicz 1996.Plant Mol.Biol.321-41)，从这些理由来看，要求存在具有促进各种表达作用的DNA片段。现有的DNA片段，很多促进表达的效果不充分，因此我们期待能发挥更大作用的DNA片段。
发明公开本发明的目的是，提供一种新的核酸片段，它具有优异的、促使位于下游的结构基因表达的作用；同时提供一种利用该核酸片段促使位于下游的结构基因表达的方法。
本发明人经过反复钻研终于研究出水稻PLD第二内含子具有优异的、促使基因表达的作用，从而完成本发明任务。
即，本发明提供一种核酸片段，该核酸片段具有促使位于下游的结构基因表达的作用，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中置换、缺失一个或多个碱基、或者在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段。本发明又提供一种具有促使位于下游的结构基因表达的作用的核酸片段，它具有序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的核酸片段或者在严谨条件下与该核酸片段杂交的核酸片段。本发明进一步提供一种重组载体，它至少包含上述本发明的核酸片段和位于该核酸片段下游的结构基因，通过所述核酸片段促使该结构基因的表达。本发明提供结构基因表达的促进方法，由在结构基因的上游中插入本发明所述的核酸片段而构成。本发明提供能促使所要结构基因进行表达的植物或者是维持该植物性状的后代。
通过本发明提供一种新的核酸片段，该片段具有优异的、促使结构基因表达的作用。正如下面实施例所示，本发明的核酸片段与具有同样功能的公知的水稻PLD第一内含子相比其下游的结构基因的表达促进作用相差很大。总之，将本发明的核酸片段插入到结构基因的上游能大幅度地促使该结构基因的表达，因此，本发明大大地促使使用重组载体的外源基因的表达，有待于在遗传工程学等方面做出贡献。
实施发明的最佳方案如上所述，本发明的核酸片段是具有序列表中SEQ ID NO1所示的碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、或在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段，同时，它又具有促使位于其下游的结构基因表达作用的核酸片段。
本发明的范围包括序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、或者在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段，还包括具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段(以下为方便称作「修饰核酸片段」)。此时，修饰核酸片段中的与SEQ ID NO1所示序列对应的部分，优选的是其与SEQID NO1所示序列的同源性为70％以上，更优选85％以上，再优选95％以上。另外碱基序列的同源性可通过众所周知的FASTA微机软件而简便地算出。这些修饰核酸具有SEQ ID NO1所示的碱基序列核酸并最好在严谨条件下(用一般的杂交溶液即，5×Denhardt’s reagent，6×SSC，0.5％SDS或者0.1％SDS，温度在50℃-65℃之间，优选在50℃和60℃的两个温度段，或者在四个温度段如50℃，55℃，60℃，65℃)进行杂交。
本发明还包括这样一种具有SEQ ID NO1所示碱基序列核酸片段的一部分，并且具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段。本发明还包括由数个上述本发明核酸片段相连而成的核酸片段。此时，核酸片段的连接可以是直接连接也可以在它们之间有其它序列。
本发明的核酸既可以是DNA也可以是RNA，但从核酸稳定性考虑优选DNA。
通过本发明已弄清本发明核酸片段的碱基序列，它来自于水稻基因组，所以，以水稻基因组DNA为模板根据PCR等核酸扩增法易于进行制备。在本领域中，众所周知的PCR反应均可通过厂家的试剂盒及其装置简便地实施。所述修饰核酸片段通过众所周知的定位诱变法很容易地制备所要的核酸片段。
将数个本发明核酸片段连接时，可以预先将数个本发明的核酸片段连接，也可以将本发明核酸片段插入本发明的含核酸片段区域。
通过在结构基因的上游插入本发明所述的核酸片段，可以促使该结构基因的表达。结构基因受位于上游的启动子控制，本发明的核酸片段可以插入启动子和结构基因之间，也可以插入启动子的上游，优选前者。这时优选的是本发明的核酸片段和结构基因之间的距离为0bp-1000bp，同时启动子和本发明核酸片段之间的距离为0bp-1000bp也是优选的。
本发明提供的重组载体是将本发明所述方法应用于表达载体而获得的。本发明的重组载体通过在市售的表达载体的克隆位点中插入本发明核酸片段和能促进表达的结构基因是易于制备获得的。这种表达载体优选是植物用表达载体，在本领域有已知的各种各样的载体，还有市售的。这些表达载体至少包括以下几个部分为在宿主细胞内复制的复制起始点、启动子、为插入外源基因而给出的限制性内切酶的位点的克隆位点、和抗药性基因等的选择标记，通常表达载体还包括使转录顺利终止的终止子。在本发明方法中，均可采用公知的表达载体。
通过使用上述重组载体按照常规方法转化植物可以获得促使所要结构基因表达的植物。植物的转化方法在本领域中是周知的，通过原生质体的电穿孔法或者是土壤杆菌法等众所周知的方法实施。
实施例下面根据实施例具体地阐述本发明，但本发明并不限于下述实施例。
用下面的引物以公知的水稻基因组克隆(WO95/0934的SEQ ID NO5)为模板，用水稻PLD基因的第二内含子以及两端各含有37个碱基外显子的DNA片段(其碱基序列于SEQ ID NO2所示)进行PCR扩增。
5＇-aagtcccccgggccgcgccagcggaag-3′3＇-gacacccacagccgtctatagttcgta-5′CLONTECH公司制备的载体pBI221的Sma I位点上插入用Sma I和EcoRV消化所得PCR扩增片段，该载体pBI221在35S启动子的下游配置有β-Glucuronidase(GUS)基因。通过此操作过程，将上述扩增的片段配置于35S启动子和GUS基因之间。依照Sheen的方法(Sheen，Plant Cell3225-245 1991)研究瞬时基因的表达。即通过电穿孔法将构建的质粒导入到由玉米黄化叶分离的原生质体中，用所述方法测定GUS的瞬时表达。
为了比较，根据国际专利WO96/30510所述方法，通过PCR使水稻PLD基因的第一内含子(序列表中SEQ ID NO3所示)进行扩增，同上所述，将水稻PLD基因的第一内含子插入到pBI221的Sma I位点上，导入玉米的原生质体中研究其GUS的表达。其表达结果于表1所示。
表1
正如本结果所表明的，本发明的核酸片段，与具有同样功能的公知的水稻PLD第一内含子相比，促进其下游的结构基因的表达相差很大。
序列一览表<110>日本烟草工业株式会社<120>核酸片段、含该片段的重组载体以及使用该片段促使结构基因的表达方法<130>00PF210-PCT<160>5<210>1<211>540<212>DNA<213>水稻<400>1gttcggaccc ttctccttaa tctactcgtc tttgctcttg ctctttttct tttgtgtccc 60tttcttgtgt gtgcgtttgc atgagcccga atttgatctg ctagtgcaca gtacagtcag120atacactgaa acgatctgga aattctggat tattaggaaa aataaagagg tagtagacaa180gaattggaga tactttctat caagattggt ctattatgct tggccatttc ttgtttgacc240caagtacttc tttgaatcta gagtttgctg tgtgtgatgt ggtgtgtgtt tgtgtcacca300aaaatcttca ttagctaaaa ctgaaatttt atttattaac tgacctacta aaaatgtaga360gttctctgtg tgtgatgtgt gcttgtgtca ccaaaaatct tgatttgata gagtttttat420ttatttatta actgacctac tacaaatcta ttgctgtatg ctatgtgtgt ctgtatcacc480tgaaatgcaa tgtcttcttc tttgttgttc ttgatctaac acgtgagctc atgtcaacag540<210>2<211>614<212>DNA<213>水稻<400>2ccgcgccagc ggaagcgccc ccaagttcat ccgcaaggtt cggacccttc tccttaatct60actcgtcttt gctcttgctc tttttctttt gtgtcccttt cttgtgtgtg cgtttgcatg120agcccgaatt tgatctgcta gtgcacagta cagtcagata cactgaaacg atctggaaat180tctggattat taggaaaaat aaagaggtag tagacaagaa ttggagatac tttctatcaa240gattggtcta ttatgcttgg ccatttcttg tttgacccaa gtacttcttt gaatctagag300tttgctgtgt gtgatgtggt gtgtgtttgt gtcaccaaaa atcttcatta gctaaaactg360aaattttatt tattaactga cctactaaaa atgtagagtt ctctgtgtgt gatgtgtgct420tgtgtcacca aaaatcttga tttgatagag tttttattta tttattaact gacctactac480aaatctattg ctgtatgcta tgtgtgtctg tatcacctga aatgcaatgt cttcttcttt540gttgttcttg atctaacacg tgagctcatg tcaacagttt gtggagggga ttgaggacac600tgtgggtgtc ggca 614<210>3<211>173<212>DNA<213>水稻<400>3gtaagcccag tgtgcttagg ctaagcgcac tagagcttct tgctcgcttg cttcttctcc60gctcagatct gcttgcttgc ttgcttcgct agaaccctac tctgtgctgc gagtgtcgct120gcttcgtctt ccttcctcaa gttcgatctg attgtgtgtg tgggggggcg cag 173<210>4<211>27<212>DNA<213>水稻<400>4aagtcccccg ggccgcgcca gcggaag 27<210>5<211>27<212>DNA<213>水稻<400>5atgcttgata tctgccgaca cccacag 2权利要求
1.一种核酸片段，它具有序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、或者在该碱基序列中插入或附加一个或多个碱基的核酸片段，并且该核酸片段具有促使位于下游的结构基因表达的作用。
2.权利要求1所述的核酸片段与序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列具有70％以上的同源性。
3.一种核酸片段，它具有序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的核酸片段或者是在严谨条件下与该核酸片段杂交的核酸片段，并且该核酸片段具有促使位于下游的结构基因表达的作用。
4.权利要求1所述的核酸片段具有序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的核酸片段或者是该核酸片段的一部分，它具有促使位于下游的结构基因表达的作用。
5.权利要求4所述的核酸片段具有序列表中SEQ ID NO1所示的碱基序列。
6.权利要求1所述的核酸片段具有序列表中SEQ ID NO2所示的碱基序列。
7.一种重组载体，它至少包括权利要求1-6中任何一项所述的核酸片段和位于该核酸片段下游的结构基因，通过所述核酸片段促使该结构基因表达。
8.一种促使结构基因表达的方法，由权利要求1-6任何一项所述的核酸片段插入到结构基因的上游而形成。
9.根据权利要求7所述的方法，提供促使所要的结构基因表达的植物或维持该植物性状的后代。
全文摘要
公开一种新的核酸片段,它具有优异的、促使位于下游的结构基因表达的作用;公开一种方法利用该核酸片段促使位于下游的结构基因的表达。该核酸片段具有序列表中SEQID NO:1所示碱基序列的核酸片段或者是在该碱基序列中有一个或多个碱基被置换、缺失、插入或附加的核酸片段,并且具有促使位于下游的结构基因表达作用的核酸片段。
文档编号C12N15/82GK1322245SQ00802035
公开日2001年11月14日 申请日期2000年9月25日 优先权日1999年9月27日
发明者植木润, 森冈真二 申请人:日本烟草产业株式会社