专利名称：丙烯甲烷共氧化制备环氧丙烷的生物催化方法
技术领域：
本发明涉及一种利用甲烷氧化细菌催化丙烯甲烷共氧化反应制备环氧丙烷的生物催化方法。
环氧化物是有机合成中的重要原料，作为许多化合物的前体大规模地应用于化学工业，运用生物技术合成环氧化物尤其是光学活性环氧化物是有机合成中一个极富挑战性的课题(D.J.Leak，P.J.Aikens，M.Seyed-Mahmoudian.Themicrobial production of epoxides Trends Biotechnology，1992，10(7)256-261)。目前，环氧化物主要采用氯醇法和过氧化物法合成。这些方法均为多步反应过程，存在副产物多，废水处理昂贵等缺点。生物酶是一种独特的有机合成催化剂。生物催化具有反应条件温和，选择性强等特点。广泛存在于自然界中的甲烷氧化细菌(Methanotrophic bacteria)是一类以甲烷为唯一碳源和能源生长的细菌，能利用依赖辅酶NADH的甲烷单加氧酶(Methane Monoxygenase，MMO)活化分子氧，催化烷烃羟基化和烯烃环氧化反应。
作为环氧化物合成的一条崭新途径，该催化过程可以利用空气中的分子氧实现烯烃的直接环氧化；但由于在丙烯环氧化制备环氧丙烷的生物催化反应过程中，随着产物环氧丙烷的积累和辅酶NADH的消耗，细胞会很快失去活性，这成为进行连续催化反应所要解决的首要问题。通过将环氧化产物不断抽提出来，可以解决环氧化产物对细胞的毒副作用。对仅由能量短缺导致失活的细胞，外源性电子给体的加入可使细胞获得再生；高灿柱(高灿柱，李树本，宁治中等，分子催化，1990，4，291；高灿柱，李树本，宁治中等，分子催化，1991，5，227)曾报道甲烷是Methylomonas sp.GYJ3细胞最好的再生剂。但高灿柱进行的是将细胞环氧化与甲烷再生反应交替进行的间歇式反应，环氧化连续反应仍无法进行。曾报道与丙烯等体积存在的甲烷可明显抑制甲烷氧化细菌的环氧化活性(Ching T.hou，Ramesh Patel，Allen I.Laskin Microbial Oxidation ofGaseous hydrocarbonsEpoxidation of C2 to C4 n-Alkenes by MethylotrophicBacteria Applied and Environmental Microbiology，July 1976，127-134)。
本发明的目的在于解决上述问题而提出一种以甲烷利用菌为催化剂，催化丙烯甲烷共氧化反应连续制备环氧丙烷的生物催化方法。
本发明的目的可由如下措施实现首先对甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3进行培养，然后将收获的细胞用含有磷酸盐的缓冲溶液悬浮，充入含有丙烯、甲烷和空气的混合气体启动反应，32-40摄氏度、150-200转/分钟反应一定时间后得到含有产物环氧丙烷的水溶液。
下式是由甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶催化完成的烯烃环氧化反应。随反应的进行， 由于还原型辅酶NADH的不断消耗和体系中的毒性产物环氧丙烷的积累导致细胞很快失活。甲烷作为甲烷氧化细菌的天然底物，可以通过以下途径再生出还原型辅酶NADH，为反应体系提供还原能量。 (注NADH2，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；PQQ，氧化型吡咯并喹啉醌；PQQH2，还原型吡咯并喹啉醌；)本发明将甲烷与丙烯按一定比例混合，实现了在环氧化反应的同时辅酶NADH的原位再生，解决了甲烷氧化细菌催化丙烯环氧化制备环氧丙烷的关键性问题。
丙烯甲烷共氧化制备环氧丙烷的生物催化方法，其特征在于采用甲烷作为辅助底物，与一定比例的丙烯混合，在甲烷氧化细菌细胞存在下，32-40摄氏度、150-220转/分钟反应得到环氧丙烷。
本发明采用的甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3的浓度为2-30毫克/毫升。
本发明采用的丙烯和甲烷的体积比为1∶0.5-1∶1.5。
本发明采用的反应介质为含有50-100毫摩尔/升的磷酸氢二钠，50-100毫摩尔/升的磷酸二氢钠，5毫摩尔/升的氯化镁的磷酸盐缓冲溶液，ph＝6.5-6.9。
本发明采用的反应温度为32-40摄氏度，转数为150-220转/分钟。
本发明有如下特点a 采用生物催化的方法在温和的条件下以丙烯、甲烷为底物反应得到环氧丙烷；b 采用一定比例的丙烯甲烷混合气体同时反应，实现了辅酶NADH的原位再生，使反应得以连续进行，解决了甲烷间歇式再生导致反应无法连续进行的问题。
c 采用甲烷作为外源性电子给体，与甲酸钠等相比，反应成本更低廉，而且不用间断反应，更符合将来工业化的要求。
现进一步通过最佳实施例来阐述发明的实现方式。
实施例1培养甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3，收获后离心，将其添加到20毫升含有下列成分的反应液的100毫升锥形瓶中，甲烷氧化细菌Methylomonassp.GYJ3的细胞在该反应液中的浓度为2-30毫克/毫升浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸氢二钠，浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸二氢钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁，ph＝6.5-6.9。其中一个瓶子密封后抽出60毫升空气，加入20毫升丙烯和20毫升氧气，用氮气平衡剩余的气相，作为对照；另一个瓶子密封后抽出空气60毫升，加入20毫升丙烯、20毫升氧气和10毫升甲烷，用氮气平衡剩余的气相；32摄氏度，150转/分钟摇床反应；环氧化物的检测和定量分析在气相色谱仪上进行。每隔1小时用注射器抽取0.5毫升反应液，8000转/分钟，4分钟，取上清。色谱条件为SE-54弹性石英毛细管柱(25m×0.25mm i.d.)，载气N2，检测器氢火焰，分流进样。进样器、检测器温度分别控制在180摄氏度、200摄氏度，柱温60摄氏度，进样体积1微升，外标法定量。结果如表1所示
比较发现，丙烯∶甲烷＝1∶0.5(V/V)混合充入反应体系时，甲烷氧化细菌的环氧化活性被轻微激活。
实施例2其它同实施例1，仅将丙烯甲烷比例改为1∶1；32摄氏度，150转/分钟摇床反应，每次批式反应5-7小时，反应完毕后，离心分离产物，回收细胞继续进行下一批反应。每隔1小时从密封的反应瓶中取0.5毫升细胞液，离心后得上清液，用气相色谱检测产物环氧丙烷，然后比较其产量变化趋势。结果见表2
比较发现，丙烯∶甲烷＝1∶1(V/V)混合充入反应体系时，甲烷氧化细菌的环氧化活性被较大程度激活。
实施例3其它同实施例1，仅将丙烯甲烷比例改为1∶1.5，32摄氏度，150转/分钟摇床反应，每次批式反应5-7小时，反应完毕后，离心分离产物，回收细胞继续进行下一批反应。每隔1小时从密封的反应瓶中取0.5毫升细胞液，离心后得上清液，用气相色谱检测产物环氧丙烷，然后比较其产量变化趋势。结果见表3
比较发现，丙烯∶甲烷＝1∶1.5(V/V)混合充入反应体系时，甲烷氧化细菌的环氧化活性被最大程度激活。
实施例4其它同实施例1，仅将丙烯甲烷比例改为1∶2，32摄氏度，150转/分钟摇床反应，每隔1小时从密封的反应瓶中取0.5毫升细胞液，离心后得上清液，用气相色谱检测产物环氧丙烷，然后比较其产量变化趋势。结果见表4
比较发现，丙烯∶甲烷＝1∶2(V/V)混合充入反应体系时，甲烷氧化细菌的环氧化活性被较大程度抑制。
权利要求
1.一种丙烯甲烷共氧化制备环氧丙烷的生物催化方法，其特征在于以甲烷利用菌Methylomonas sp.GYJ3作为催化剂，以丙烯甲烷混合气体作为反应底物，在反应介质存在下，32-40摄氏度、150-220转/分钟条件下反应得到环氧丙烷，同时实现辅酶NADH的原位再生。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该反应中丙烯和甲烷的体积比为1∶0.5-1∶1.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于反应介质为含有浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸二氢钠，浓度为50-100毫摩尔/升的磷酸氢二钠，浓度为5毫摩尔/升的氯化镁组成的磷酸盐缓冲溶液，ph＝6.5-6.9。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于Methylomonas sp.GYJ3的浓度为2-30毫克/毫升。
全文摘要
本发明公开了一种利用一定比例的丙烯甲烷共氧化制备环氧丙烷的生物催化方法。采用甲烷利用菌Methylomonas sp.GYJ3作为催化剂,在同一催化体系中同时充入一定比例的丙烯和甲烷作为反应底物,解决了由于体系中辅酶NADH的消耗而导致的细胞活性降低,间歇式再生或添加其它外源电子给体所造成反应无法连续进行的问题,实现了辅酶NADH在反应体系中的原位再生。
文档编号C12P17/02GK1328161SQ0112138
公开日2001年12月26日 申请日期2001年6月11日 优先权日2001年6月11日
发明者崔俊儒, 辛嘉英, 陈建波, 夏春谷, 李树本 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所