使用两组同源引物的pcr方法及其反应液和应用的制作方法

专利名称：使用两组同源引物的pcr方法及其反应液和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其反应液和在制备医学微生物核酸检测试剂中应用。
背景技术：
经典聚合酶链式反应方法发明于八十年代中期，它采用正、反引物各一个来扩增特定的基因。十几年来已发展了若干同时使用二对或更多引物的PCR方法，其中，主要有多重引物PCR和简并引物PCR。
多重PCR是在一个反应管内同时扩增二个或二个以上的目标基因，多重PCR的每一对引物顺序与相应的目标基因匹配，引物彼此之间不存在同源性。多重PCR也已用于扩增同一基因的不同区域，但引物对之间需相隔较远，否则相互干扰，这种情况下引物间相互也无同源性。
简并引物PCR方法是根据一段多肽的氨基酸顺序而非核酸顺序来设计引物的，由于氨基酸密码子的高度简并性，对应5-6个氨基酸多肽的核苷酸顺序通常有32，64，128种或更多的可能性，所以，一套简并引物往往包括几十种引物，通常是在寡核苷酸合成过程中制备的，每一个引物的长度相同。简并引物PCR方法也用来扩增病毒核酸或其他基因的高度变异区，其引物同样具有上述特征。
本发明的正反两组同源引物PCR方法也使用二对以上的引物，但是在原理、引物特性和用途上均与多重PCR和简并引物PCR大不相同。本发明的两组同原引物是根据目标基因各种变种的顺序而设计的，每组引物的数量有限，相互之间高度同源，长度可相同或有差异，其目的是能使PCR在严谨的条件下扩增各种变种，从而减少或消除PCR扩增的假阴性。
PCR已广泛用于人体内微生物的检测包括感染性疾病的临床诊断，其原理是病毒，细菌或其他微生物的基因顺序与人体不同，根据目标微生物的某种基因顺序可以设计高度专一的引物，如果人感染该微生物，则从人体某些部位如血液中提取DNA或RNA，通过PCR方法能扩增得到该微生物特定的基因片段，反之则否。但是，临床诊断实践表明现行的PCR方法往往存在较严重的假阳性和假阴性问题。假阳性是由于样品中存在干扰物质或操作过程中极微量模板的污染所造成的。针对假阳性原因可分别通过改进引物设计，提高PCR反应严谨性，增加产物检测手段如核酸杂交，和创造良好的检测环境，加强检测人员训练，规范操作程序，采取各种技术措施如加入UDG的方法或封闭式的实时荧光定量方法来加以克服。
相对而言，PCR诊断的假阴性问题更为严重，既未被充分认知，又未找到有效的克服办法。以在我国感染率极高的乙型肝炎病毒(HBV)为例，大量的关于HBV的PCR诊断和免疫诊断诊比较研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原阳性的，即用免疫方法确认感染HBV并处活动期的病人中，均有一部分未能用PCR方法检出，有时假阴性高达50％。假阴性的造成除了由于PCR反应的不稳定性，样品DNA或RNA提取过程失当等技术方面原因外，主要是由于HBV病毒的核酸顺序的多变性。至今，已提交基因库的各种HBV变种分离株和克隆的全基因或部分基因顺序已超过一千种，相互之间几乎都各不相同。所以，尽管每一位研究者都认识到并强调在HBV基因组的保守区来寻找选择引物，实际上却很难找到一对引物既具有作为优秀引物的的严谨性，同时又能与所有变种的顺序匹配。对文献报导的若干HBV引物的分析表明，几乎每对引物的顺序都与相当数量的变种的顺序存在严重的错配。在严谨的PCR反应条件下或样品中病毒浓度较低的情况下，核酸顺序与引物顺序有严重错配的变种就得不到扩增产物。为了减少假阴性可以降低PCR反应的严谨性例如降低退火温度，使引物与变种模板能在有较严重错配的情况下退火，但是低温退火必然增加非专一产物的形成。另一种方法是在引物中采用脱氧次黄嘌呤核苷酸(dITP)或其他互补专一性差的特殊核苷酸来替代A，C，T或G。但这种方法有若干缺点。1dITP或其他特殊核苷酸都是非天然核苷酸。2dITP虽能与四种核苷酸互补，但不及A与T之间或G与C之间的互补强，如果引物内需要用二个或多个dITP来取代的话，引物与模板的结合强度就更低。3当含dITP的引物掺入扩增链后，含dITP的链又成为下一轮扩增的模板，A，T，C和G都有可能掺入，最后PCR产物就分子的顺序而言将是复杂的异源性混合物。

发明内容
发明所要解决的技术问题本发明所需要解决的技术问题是提供一种使用两组同源引物的聚合酶链式反应方法及其反应液和在制备医学微生物核酸检测试剂中的应用，以突破现有技术中设计于同源基因的正反引物仅一对的常规，克服同源基因检测中不能同时避免假阴性或非转一性产物的缺陷。
技术方案本发明则采用两组数量有限，长度完全相同或略有差别，顺序高度同源的引物，在严谨的条件下进行PCR，以克服用临床诊断的假阴性问题。
所用的正、反引物为同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的2组引物，每组包括1-3条引物。也就是说，使用一组正引物和一个反引物，或者使用一组反引物和一个正引物，或者同时使用一组正引物和一组反引物进行PCR反应，根据测定需要和目标基因的变化程度而决定。
一组正引物或一组反引物的各个引物不仅有相同的目标基因，而且位于基因的同一部位，引物间彼此高度同源。
同源引物PCR方法中的引物顺序是根据目标基因的各种变种的顺序来选择设计的，每一个引物均与一个或若干变种的顺序完全匹配或高度匹配，各条引物与模板的错配碱基数为0-3。使用两组同源引物能与所有变种或比使用一个引物时与更多的变种的顺序完全匹配或高度匹配，从而减少或消除因引物顺序与模板顺序存在严重错配而导致的假阴性。
两组同源引物内引物间长度完全相同或有1-10核苷酸的差异；相应地引物在基因中的位置也完全相同或有1-10核苷酸参差，也可以说，每组同源引物的各引物在目标基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。由此，应用同源引物方法的PCR扩增产物的长度完全相同或有若干个碱基的差别。因为PCR产物的长度通常大于200碱基，所以，即使PCR产物长度有若干碱基差别，也显示出相同的电泳条带。
当样品中只存在某一种变种时，其中一个引物与模板的匹配是显著高于其他引物，在严谨的PCR条件下，该引物与模板退火，在扩增中起全部或主要的作用。
设计同源引物时，除了考虑引物顺序与目标基因各变种顺序匹配，每一个引物自身应有良好的严谨性，同时要使正同源引物之间，反同源引物之间和正、反同源引物之间均只有较低的3’端互补碱基数。从而使同源引物PCR的有效引物的作用不受其他引物的干扰。
本发明的同源引物聚合酶链式反应的反应液，其组成包括2组正反引物、四种脱氧核糖核酸、镁离子、缓冲液、耐热DNA聚合酶和目标DNA，正反引物组在反应液中的浓度范围上限比标准PCR高，单组同源引物的浓度之和为0.1-2μM。
所说的同源引物聚合酶链式反应方法在制备医学微生物核酸检测试剂中有其独特的应用，比如将正、反引物组分别设计于同种病毒的不同基因型、血清型或其亚型的基因同源区段，如乙型肝炎病毒不同血清型；或设计于同属细菌的不同种、亚种、变种或其变异株的基因同源区段，如嗜酸乳杆菌的16S RNA基因。
有益效果现有技术检测等位基因的PCR，或者是检测等位基因点突变的PCR，如果在同一管反应，往往一个引物有等位突变，同时共享另一引物，必须在引物合成时在二对或多对引物上标上不同颜色的荧光基团加以区别，否则无法区分是由于等位突变还是由于没有目标基因造成的阴性结果。
本发明针对等位突变设计同源引物组，可以不对上述情况加以区别，只要存在目标基因，即可获得可靠的阳性结果，消除了因为等位突变造成的假阴性。
现有PCR技术测定某一种、属的或其他特定范围内的微生物是一种对于多种困难因素的平衡和选择1〕需要选择高严谨性引物，则对引物的位置有较大的限制；2〕如果在基因顺序变化相对保守的区域内选择引物，由于不同种、不同属的微生物基因之间存在广泛的的同源性，PCR引物除了与所有目标微生物的基因顺序匹配，但往往也可能与一些非目标微生物的基因匹配，使PCR检测的专一性受到干扰可能产生假阳性结果；3〕如果在基因顺序变化相对活跃的区域选择引物，则PCR引物可能仅与一部分目标微生物的基因的顺序完全匹配或高度匹配，而与另一部分目标微生物的基因顺序不匹配，在严谨的PCR反应条件下，这部分微生物的基因就不被扩增而造成假阴性，如果降低PCR反应的严谨性，则会使非目标微生物的干扰大大增强。
同源引物组PCR则提供了一种新的、简单的方法，使引物的选择范围极大的扩展，可以在基因顺序变化相对保守的区域内，也可以在基因顺序变化相对活跃的区域选择引物。同时扩大了目标微生物的检测范围，在理想状态下，可以检测整个种乃至整个属的微生物，而避免漏检某些变异株。
同源引物PCR也可以进一步设计为定量检测。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1以已知的HBV变种的顺序为例，用两组同源引物方法来克服假阴性。
所设计的正引物组和反引物组均包括三个引物，表1以HBV核酸顺序(E00010，见核苷酸序列表)为准，列述了每一个引物的长度，位置和其他基本特性。
表2列述了每个引物的顺序，字体加深的碱基表示一组同源引物内相互间不完全相同的碱基。
表1.六个乙肝病毒引物的名称和基本特性

表2.六个乙肝病毒引物的顺序

表1和表2数据表明，正引物组的引物长度差最大为4个碱基，反引物组三个引物的长度完全相同。每一组引物内引物间顺序的同源性均超过90％。
表3分析了正、反引物组与HBV核酸顺序的匹配情况。由表3可知正引物HBV15’与HBV病毒E00010的顺序完全匹配，近似解链温度和专一结合强度分别高达90.4℃和574点；反引物HBV13’与HBV病毒E00010的顺序有1个碱基错配，但近似解链温度和专一结合强度仍分别高达86.9C和627点。应用以上引物组在高退火温度下至少其中的一对引物能胜任扩增。
表3.六个引物的近似解链温度和与E00010HBV的专一结合强度

根据HBV全序列的同源性和其他特性可分成7种基因型，每一种包括一种或几种血清型及其亚型。表4列述了引物与7种基因型的代表性病毒株核酸顺序的匹配情况。表4说明3个正引物与7个基因型顺序完全匹配或有一个碱基错配；而3个反引物与7个基因型顺序完全匹配或有0-2个碱基错配，但所有引物与7个基因型的模板专一结合强度都超过515点。所以用本发明引物组能在高温下扩增7个基因型的每一个代表病毒株。
表4.六个引物与各种基因型HBV代表性病毒株顺序的的匹配情况

截止2002年上半年基因库收录约220个由中国发表或与中国直接有关的HBV核酸的全顺序或部分顺序，以从为分析样本测试上述引物组的同源性特征。其中，与正引物1或3完全匹配的病毒株分别有104和101株，所以至少有205个病毒株顺序与三个正引物中的一个完全匹配。在全部220株中有三株的核酸顺序与正引物1和正引物2在3’端有严重错配，但与正引物3匹配很好。其余十来个变株的顺序与正引物仅在引物的靠近5’一侧有1-3个错配，其近似解链温度和与模板专一结合的强度分别在80℃和500点以上。
所以，本发明的正引物组能与220个变株中的每一个病毒株在高温下退火。在基因库收录的220个HBV基因顺序中多数是部分顺序而不是全顺序，在基因库中列出反引物区域顺序的约有90个，其中，与反引物1或3完全匹配的病毒株分别有61株和15株，所以至少有76个病毒株与三个反引物中的一个完全匹配。其余十来个变株的顺序与正引物仅在引物的靠近5’一侧有1-2个错配，其近似解链温度和与模板专一结合的强度也分别在80℃和500点以上，所以，本发明的反引物组能与90个变株中的每一个病毒株在高温下退火。
当前，基因库收录的人HBV核酸顺序1000个以上，从全顺序看所包括的变异比上述的220株更多，但就本发明的引物顺序区域看，上述220种变株几乎包括了所有的变异种类。所以，本发明引物组能扩增目前已知的几乎每一个HBV变种。
标准PCR只使用一对引物，设计引物时只需要考虑引物自身的互补和二个引物间的互补。本发明共有六个引物，除了考虑六个引物的自身互补还要顾及6个引物间15种可能的互补。表5列述了全部21种引物3’端碱基的互补情况。
表5.六个乙肝病毒引物自身和相互间最稳定3’二聚物形成特性

表5数据表明，六个引物自身和相互间都没有严重的3’端互补，在高退火温度下不易形成引物二聚体。
实施例2.
用两组同源引物的PCR方法对110份HBV血清样品进行检测试验，阴性对照为5份正常人血清(预先经ELISA检测HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg和HBeAb均为阴性)。PCR反应采用Clontech公司Advantage-2试剂盒。每份样品取200μL血清加入等体积的裂解液(配方为Tris.HCl，8％，Tween20，2％)，混匀，95℃水浴裂解15min。取出，12000rpm离心15min，取上清液进行PCR反应。反应母液Taq酶1μL，dNTP1μL，10Xbuffer，5μL，表2的2组六条引物各2uL使浓度为0.5μM，dd水3μL。每管加2μL反应母液，3μL血清裂解液。反应条件先95℃变性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec进行30个循环，最后72℃延伸2min。电泳检测结果显示所有HBV血清均获得PCR阳性结果，无一例阴性，阴性对照无阳性扩增产物。
实施例3实施例3是设计用两组同源引物PCR方法来测定人阴道的总乳酸杆菌。阴道微生态是一个含有很多微生物种群的复杂体系。其中，乳酸杆菌活动造成的微pH环境和H2O2对疾病包括艾滋病的防治有重要作用。乳酸杆菌共有几十个种，在人阴道中已发现的常驻乳酸杆菌有嗜酸乳杆菌(L.acidophillus)等十余种(见表9)，目前常用编码16sRNA的基因来鉴别微生物种，基因库已收录的顺序不下几万种。16sRNA基因含约1500个碱基(见核苷酸序列表)，无论是在基因的哪一区域都找不到一个引物，能与表9所列十几种菌种的16sRNA基因顺序完全匹配或高度匹配，又与阴道中存在的其他微生物的16sRNA基因顺序完全不匹配或有严重错配，所以无法用标准PCR方法来测定阴道的总乳酸杆菌。本发明设计的两组同源引物能扩增所有这十几种乳酸杆菌而不受阴道中所有非乳酸杆菌的干扰，引物的顺序，与模板和非模板顺序的结合强度及错配等特性列于表6-11。
表6.六个乳酸杆菌引物名称和基本特性

表7.六个乳酸杆菌引物的顺序

表8.六个乳酸杆菌引物对不同模板的专一结合强度

表9.六个引物与阴道主要乳酸杆菌16s rDNA基因模板的匹配情况

表10.乳酸杆菌引物与人阴道主要干扰菌群16s rDNA模板的错配情况

表11.六个乳酸杆菌引物相互间最稳定3’二聚物形成特性

实施例4.
用两组同源引物的PCR方法对嗜酸乳杆菌(L.acidophillus)、阴道乳杆菌(L.vaginalis)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、德氏乳杆菌(L.delbruekii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、短乳杆菌(L.brevis)、布乳杆菌氏乳杆菌(L.buchneri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、唾液乳杆菌(L.salivarius)和干酪乳杆菌(L.casei)菌种样品进行检测试验，阴性对照为双歧杆菌(bifidobacterium)、肠球菌(Entercoccus)、链球菌(Streptococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus)的代表菌。PCR反应采用Clontech公司的Advantage-2试剂盒。每份样品取3μL的细菌裂解液直接进行PCR反应。反应母液除用表7的2组六条引物各2μL使浓度为0.6μM外同实施例2。每管加2μL反应母液。反应条件先95℃变性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec进行25个循环，最后72℃延伸2min。电泳检测结果显示所有乳酸杆菌菌种均获得PCR阳性结果，无一例阴性，阴性对照菌种无阳性扩增产物。核苷酸序列乙型肝炎病毒HBV(E00010)1 gaattccact gccttccacc aaactctgca ggatcccaga gtcaggggtc tgtatcttcc61 tgctggtggc tccagttcag gaacagtaaa ccctgctccg aatattgcct ctcacatctc121 gtcaatctcc gcgaggactg gggaccctgt gacgaacatg gagaacatca catcaggatt
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权利要求
1.一种同源引物的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于，正、反引物为同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的2组引物，每组包括1-3条引物。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于各条引物与模板的错配碱基数为0-3。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于每组同源引物的各引物间长度差异为0-10核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于每组同源引物的各引物在目标基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。
5.一种权利要求1所述的同源引物聚合酶链式反应的反应液，组成包括2组正反引物、四种脱氧核糖核酸、镁离子、缓冲液、耐热DNA聚合酶和目标DNA，其特征在于每组同源引物的浓度之和为0.1-2μM。
6.权利要求1所述的同源引物聚合酶链式反应方法在制备医学微生物核酸检测试剂中的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同源基因的同一区段。
7.根据权利要求6所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同种病毒的不同基因型、血清型或其亚型的基因同源区段。
8.根据权利要求6或7所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计在相当于乙型肝炎病毒E00010株的第387-433Nt和第709-748Nt区段。
9.根据权利要求6所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同属细菌的不同种、亚种、变种或其变异株的基因同源区段。
10.根据权利要求6或9所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计在相当于嗜酸乳杆菌的16SRNA的第291-327Nt和第784-820Nt区段。
全文摘要
本发明属分子生物学技术，提供一种使用两组同源引物的聚合酶链式反应方法及其反应液，即将聚合酶链式反应使用正、反引物各一条扩展为使用各一组同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的引物组，每组包括1－3条引物，各引物与模板的错配碱基数为0－3，各引物间长度差异为0－10核苷酸，在基因中的5’起始位置相差0－10核苷酸。由于本方法根据已知的待测序列设计具有高严谨性的引物组，故可以减少或消除同源基因PCR检测的假阴性，在制备医学微生物如病毒、细菌等核酸检测试剂中具备广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK1511955SQ0216038
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧