专利名称：神经元一氧化氮合酶蛋白质与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质键合抑制剂筛选新方法
神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质键合抑制剂筛选新方法本发明涉及神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)键合(liaison)抑制剂筛选新方法。本发明还涉及鼠和任何其它种类动物，其中包括人的nNOS蛋白质的胰腺形式，以及编码所述蛋白质的核酸。本发明还涉及在制备用于治疗糖尿病前期和胰岛素分泌过多的药物中蛋白质或肽的用途。
一氧化氮合酶蛋白质(NOS)是一种酶，该酶由其底物即精氨酸合成一氧化氮(NO)。这种蛋白质存在三种形式两种基本NOS形式，其中包括内皮一氧化氮合酶(eNOS)和神经元一氧化氮合酶(nNOS)以及由白细胞介素诱导的诱导型NOS。
神经元NOS首先曾由D.S.Bredt于1991年在鼠脑中鉴定和克隆(Bredt et al.，1991)。在中枢神经系统中，神经元NOS在长期记忆现象(LTP)中和末梢神经系统中起作用，其存在于脉管(vessel)、肠等非肾上腺素能的非胆碱能神经元(NANC)中。然而，病理学状态下，如中风，过量产生NO可能是有害的，而且是造成神经毒性现象的原因。现在的研究更多的关注于研究可阻断在神经残留物上NO毒性作用的nNOS抑制剂。
S.R.Jaffery和S.H.Snyder(1996)鉴定了神经NOS的特异性内源抑制剂神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)。在nNOS的163-245位氨基酸上，该抑制剂与神经NOS(nNOS)相互作用，因此可预防nNOS均二聚作用并阻断NO的生成。因此，PIN蛋白质可调节nNOS活性，并阻止过量产生有害于细胞功能的NO。
美国专利US 5908756描述了提高或降低在生成NOS神经元形式(nNOS)的一氧化氮过程中催化活性的化合物的筛选试验。首先，将试验化合物与PIN蛋白质和两种nNOS单体的混合物接触，然后，通过测量其与PIN蛋白质竞争时影响两种nNOS单体的均二聚作用的能力测定试验化合物的活性而PIN蛋白质抑制其均二聚作用。因此，该试验用于研究修饰神经元NO合酶催化活性的化合物。
II型糖尿病，以前称为非胰岛素依赖型糖尿病(DNID)，是一种多因素起因的异源疾病(hetergeneous disease)，其突然暴发同时取决于遗传和环境因素，如饮食卫生、超重、缺乏锻炼和抽烟。与工业化国家的社会经济背景相关，该疾病是一个公共健康的主要难题估计在2007年将影响220百万人。
II型糖尿病的特征在于两种主要不足，其相对重要性是不同的第一个不足与胰岛素增加末梢组织对葡萄糖的吸收能力降低，即胰岛素抗性相关，第二个不足与胰腺β-细胞中的分泌异常相关，这种异常致使胰腺不能分泌足够量的胰岛素以补偿胰岛素抗性。这两种异常是在称为糖尿病前期的无症状前驱期之前的，该前驱期可以持续几年至几十年。此糖尿病前期状态的特征不是胰岛素不足，而相反地是分泌高活性，该分泌高活性导致血胰岛素过多症。
血胰岛素过多症通常是与肥胖相联系的，在具有遗传缺陷的受试者中，特别是某些肥胖和II型糖尿病发生率非常高的人群中，如比马人印第安人(Pima Indians)，这是非常重要的危险因素。通常如果高血胰岛素过多症发展以补偿胰岛素抗性，异常的高活性或胰岛素过多症在转化过程中还伴随着前胰岛素和其转化中间体(intermediaire)的高血浆水平。在大部分具有不耐受葡萄糖的受试者，即糖尿病前期受试者的研究中，已证明这种不适当分泌未成熟或成熟得不好的胰岛素。其分泌未成熟或成熟得不好的胰岛素形成了非常不好的预兆；事实上，前胰岛素/胰岛素的比例增高与2-5年后II型糖尿病和心血管并发症的发展是相关联的。
II型糖尿病的高发生率使得有必要研究一种药物，提供给病人更宽治疗选择，以便调整在糖尿病前期和II型病人糖尿病期的功能障碍。
实际上，用于调整胰岛素缺乏的唯一药物是低血糖的硫酰胺和glinides；然而，这些胰岛素分泌剂不可用于调整糖尿病前期病人或胰岛素过多症病人的胰腺β-细胞功能障碍。
迄今为止，还没有适合于治疗糖尿病前期或胰岛素过多症状态的治疗药物。
不过，本发明尤其提供一个这个难题的解决方法。
本发明的一方面提供一种新型检测方法，该方法有可能快速筛选能降低PIN蛋白质和nNOS相互作用的化合物。
本发明的另一方面还提供一种PIN蛋白质与nNOS相互作用抑制剂的新检测方法，而该方法不会改变神经元NOS的催化活性。
本发明的另一方面是检测在糖尿病前期、胰岛素过多或II型糖尿病病人中重建正常胰岛素反应的化合物。
本发明涉及一种化合物检测方法，该化合物可以调节用序列SEQID NO2表示的神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，该复合作用的调节作用可导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的改变，其中-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的可能显著变化，例如对应于*在没有经经检测方法检测的化合物的情况下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间生成复合物的量，或*没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，这是没有PIN蛋白质，或者没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量；和-当没有如上所定义的明显变化时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体是键合的，这样可导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间的复合作用。
“调节神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用”是指-在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质复合作用的化合物的作用下，降低在nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间形成的复合物的量，与没有试验化合物存在下的对照值(100％)相比，这种降低是所述复合物量的至少约20％，优选地至少约50％，或-在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，增加在nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间形成的复合物的量，与没有试验化合物存在下的对照值(100％)相比，这种增加是所述复合物量的至少为约120％，优选地至少约150％。
“nNOS蛋白质或其中一种变体”是指在不同组织中表达的所有物种，尤其是人的所有神经元nNOS，其组织可以存在点突变或特殊的可变基因剪接或同时为两者。
“胰岛素反应的改变”是指在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，降低胰岛素反应，或在上述化合物作用下增加胰岛素反应。
由调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物所诱导的胰岛素反应的改变可以通过细胞试验进行测量，尤其在下述2种条件下通过使用INS-1细胞系(Asfari等人，1992)进行测量-如果试验化合物是脂溶性的，并可以穿过细胞膜，在待试验化合物存在下，在清蛋白盐Krebs-Ringer缓冲液中，使用浓度递增的葡萄糖(0.5-1-1.5-2g/L)刺激这些细胞(Asfari等人，1992)，-如果试验化合物不是脂溶性的，并因此不能穿过细胞膜，在Staphylococcus aureus α-毒素(Maechler等人，1997)存在下，渗透这些细胞，在有或没有上述化合物存在下，用胰岛素分泌化合物(composé insulino-sécréteur)刺激这些细胞。
“在PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间形成的复合物的可能显著变化”是指与相应于没有试验化合物的对照值相比，在试验化合物作用下所生成的复合物量增加或降低至少20％，优选地50％。
为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，本发明使用一种检测方法，该方法涉及使用一种物质，如放射性元素、荧光元素或发光元素、酶或生物素，分子标记至少一种配偶体(即PIN蛋白质和/或nNOS蛋白质)。这种标记，通过发射(放射性射线、光线或荧光光线)或信号的消耗(光信号或荧光信号的吸收)，自发地或在加入酶底物或光激发后有可能直接或间接的物理定量测量。为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，还可以使用表面等离子共振技术(résonance plasmoniqe de surface)(如Biacore AB)，该技术不涉及标记两种配偶体中的一种配偶体，其条件是将PIN蛋白质或nNOS蛋白质固定在生物传感器通道中。为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，还可以使用酵母或细菌双杂交(doublehybride)类型的技术，如特别在美国专利US5283173和5468614中描述的技术。该技术在生物体内实施，不需要生成和纯化PIN蛋白质或nNOS。
在本发明的一种实施方式中，如果使用可进行能量交换的物质标记PIN蛋白质和nNOS蛋白质，可以在溶液中检测形成复合物(或其变体)的量。复合物的形成伴随着两种配偶体接近，这样有可能在二种标记物之间进行能量转换，这时可引起2种标记物中的一种标记物所发射荧光信号强度增加或降低。
在本发明的另一种实施方式中，如果2种结合配偶体中的一种配偶体固定在固态支持物(support solide)上，如果采用表面等离子共振或采用如上所述的显示系统标记该配偶体，检测另一个配偶体的键合，则可在固相中检测复合物(或其变体)的量。
第一种配偶体，即nNOS蛋白质或PIN蛋白质，可以以下述方式固定共价方式(化学反应)，或通过物理化学相互作用(疏水塑料表面上的吸附)，或通过生物特异性相互作用，其中生物传感器预先被固定在板上(如果第一配偶体涂覆生物素时，第一配偶体的特异性抗体或卵白素)非共价方式。
第二种配偶体，即PIN蛋白质或nNOS蛋白质，可以以下述方式检测所生成的复合物(或其变体)的量采用表面等离子共振直接方式，或通过测量其标记物的量间接方式。该标记物可以是通过化学键与第二配偶体连接的元素(放射性元素、荧光或发光元素、酶、生物素)，或可以是其它的生物特异性物质，如对着第二种配偶体的抗体(它自身直接或间接被标记)或卵白素(直接或间接标记)。
对照值可以通过下述途径获得-进行一种试验，将包含PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物在一定条件下温育，该条件有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物，并测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；或
-进行一种试验，仅温育PIN蛋白质，这样导致与PIN蛋白质和nNOS蛋白质之间不形成复合物；或-进行一种试验，仅温育nNOS蛋白质，这样导致在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间不形成复合物；或-进行一种试验，含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物与参照抑制剂在一定条件下温育，该条件有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物，并测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；或-进行一种试验，将与参照抑制剂一起预温育的PIN蛋白质加入到已固定在生物传感器(如Biacore AB)上的nNOS蛋白质中，并尤其采用表面等离子共振技术测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该量对应于对照值。
参照抑制剂例如可以选自用序列SEQ ID NO3和序列SEQ ID NO4所代表的肽。
PIN与nNOS生成的复合物可以根据上述技术进行检测。
该试验运用NOS胰腺形式的胰岛素调节性质及其内源PIN抑制，选择II型糖尿病早期、胰岛素过多症和明显II型糖尿病。
本发明还涉及上述定义的检测方法，其特征在于该化合物基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性。
术语“基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性”是指试验化合物仅轻微影响由nNOS产生NO的活性。
有两种可能的情况-如果所述化合物仅结合PIN蛋白质，则不改变催化活性，-如果所述化合物结合nNOS，则相应于没有所述化合物，不改变或增加或降低不超过20-30％的nNOS基本催化剂活性。
可以，例如通过由其底物，即放射性标记的精氨酸，并在辅因子如BH4、FAD、FMN、NADPH、Ca2+和钙调节蛋白的存在下产生放射标记瓜氨酸的能力可以评估nNOS催化剂活性。产生的瓜氨酸可以通过离子交换色谱从精氨酸中分离出来，并且通过放射活性计数进行定量。
本发明涉及一种化合的检测方法，该化合物可降低神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)复合作用，这种复合作用降低可导致由nNOS或其中一种变体调节的胰岛素反应减弱，其中-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤在一定条件下进行，该条件有可能·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，·使所述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或所述化合物与nNOS或其中一种变体形成复合物；-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量或许明显降低，例如对应于*在没有用检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量，*PIN蛋白质或nNOS蛋白质或其中一种变体之间没有复合物，这是没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；和-当存在如上所定义的明显的降低时，推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用的降低。
“胰岛素反应的降低”是指在降低nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，与相应于没有试验化合物的对照值相比，胰岛素分泌降低至少约20％，优选至少约50％。
“PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量可能明显降低”是指，与相应于没有试验化合物的对照值相比，试验化合物存在时生成复合物的量变化至少约20％，优选地至少约50％。
本发明还涉及一种化合物的检测方法，该化合物能增加神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，该复合作用的增加可导致nNOS蛋白质或其中一种变体所调节的胰岛素反应增大，其中-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件有可能·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS或其中一种变体形成复合物；-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物量的可能明显增加，例如对应于*在没有进行检测方法的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量，*没有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体存在，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量；和-当如上所述明显增加时，推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体是键合的，这样导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间的复合作用增加。
“胰岛素反应增大”是指在可增大nNOS蛋白质与PIN蛋白质的复合作用的化合物的作用下，与相应于没有试验化合物的对照值相比，胰岛素分泌增加至少约20％，优选地至少约50％。
本发明还涉及如上所定义的检测方法，其中所使用的nNOS蛋白质是nNOS蛋白质的胰腺形式，或存在于脑中的形式。
存在于胰腺细胞中的鼠nNOS蛋白质是胰腺nNOS涉及鼠神经元NOS的突变形式。
相对于鼠脑nNOS蛋白质，鼠胰腺nNOS具有三个突变的氨基酸；当这些突变没有定位于酶功能结构域(如上所述的辅因子键合区域)，或没有定位于PIN与nNOS相互作用的区域，但是它们影响其三维构象，因此赋予其胰腺特异性。
所使用的nNOS蛋白质还可以是存在于鼠脑中的nNOS蛋白质。
一种本发明有利的检测方法是如上定义检测方法，其中测试变体，尤其测试与第一对照值、第二对照值和第三对照值相比，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物量的可能明显降低，其中一个对照值相应于在没有用检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；这些对照值中的另一个对照值对应于PIN蛋白质与nNOS之间没有复合物，这是由没有PIN蛋白质或没有nNOS造成的，这些对照值中的另一个对照值对应于在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量。
PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量可以使用上述技术中的一种技术进行检测。
例如，进行下述试验可以得到第一对照值-在一定条件下温育含有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物，在该条件下有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物，-测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；例如，进行下述试验可以得到第二对照值，该试验相应于-仅温育PIN蛋白质，导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体不形成复合物；-仅温育nNOS蛋白质或其中一种变体，这导致nNOS蛋白质或其中一种变体与PIN蛋白质不形成复合物；例如，进行下述试验可以得到第三对照值-温育含有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体和参比抑制剂的混合物，-测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述对照值。
例如，还可以通过进行下述试验得到第三对照值-将与参比抑制剂一起预温育的PIN蛋白质加入到已固定在生物传感器(如Biacore AB)上的nNOS蛋白质中，-尤其采用表面等离子共振技术测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该数量对应于对照值。
本发明有利的检测方法是如上定义中的方法，其中制备含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和用检测方法检测的试验化合物的混合物-同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，或-依次加入PIN蛋白质、经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，或依次加入nNOS蛋白质、经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，-加入预先与PIN蛋白质或nNOS蛋白质温育的所述化合物，然后分别加入nNOS蛋白质或PIN蛋白质。
当同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和所述化合物，可以制备含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物，有利于检测化合物，该化合物与在PIN蛋白质nNOS蛋白质所形成的复合物连接，并离解所述的复合物，还有利于检测仅连接两种配偶体(即PIN或nNOS)中一种配偶体的化合物，而这些化合物对参与同复合物生成竞争是充分有效的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过依次加入PIN蛋白质、所述化合物和nNOS蛋白质制备得到的时，有利于检测连接PIN蛋白质的化合物，但也有利于寻找非常好的nNOS蛋白质配体(对nNOS蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，从动力学方面来看这是不利的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过依次加入下述物质制备得到的nNOS蛋白质、所述化合物和PIN蛋白质时，有利于检测键合nNOS蛋白质的化合物，但同样有利于寻找非常好的PIN蛋白质配体(对nNOS蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这其从动力学方面看是不利的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过加入预先与PIN蛋白质温育的所述化合物和nNOS蛋白质制备得到时，在加入nNOS蛋白质之前促进所述化合物与PIN蛋白质的键合，从而有利于检测键合PIN蛋白质的化合物。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过加入预先与nNOS蛋白质温育的所述化合物和PIN蛋白质制备得到时，在加入PIN蛋白质之前促进所述化合物与nNOS蛋白质的键合，从而有利于检测键合nNOS蛋白质的化合物。
当同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和上述化合物时，可以在溶液中使用荧光标记物和采用荧光偏振法(或转移)定量所生成的复合物。该方法具有快速的优点(仅一步温育的步骤，不洗涤)，并提供直接检测系统。
当依次加入PIN蛋白质、上述化合物和nNOS蛋白质，或在PIN蛋白质或nNOS蛋白质与上述化合物预温育之后，两种配偶体中的一种配偶体必须先被固定在固体支持物上。可以采用表面等离子共振方法分析或标记其它配偶体定量所生成的复合物。该方法能够测定与化合物键合的任何配偶体，即PIN蛋白质、nNOS蛋白质或这两种蛋白质之间生成的复合物。
一种有利的检测方法是如上定义的一种检测方法，其中nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上。
术语“固定在固体支持物上”是指一种方法，其中nNOS蛋白质以共价方式(化学反应)或非共价方式(在塑料上非特异性吸附，卵白素-生物素系统，抗体)固定在固体支持物上。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，采用表面等离子共振方法或使用检测系统标记(放射性、发光或荧光标记物，酶，生物素)检测PIN蛋白质键，这样可以测量所生成的复合物的量。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，同时加入并没有预混合的PIN蛋白质和经检测方法检测的化合物，可以同时检测nNOS蛋白质、PIN蛋白质和两种蛋白质所生成复合物的配体。该方法有助于检测抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质缔合的分子，并因此可以研究离解两种蛋白质所生成的复合物的化合物。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，依次加入经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，可以检测仅抑制nNOS蛋白质的化合物。实际上，如果试验化合物没有与nNOS蛋白质固定，它将在加入PIN蛋白质前洗涤时被除去。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，加入与PIN蛋白质预温育的经检测方法检测的化合物，可以同时检测PIN蛋白质、nNOS蛋白质和PIN蛋白质与nNOS蛋白质所生成复合物的配体。此实施方式促进所述化合物与PIN蛋白质在所述化合物与nNOS温育前键合，并可以研究PIN蛋白质的配体。该实施方式还可以选择非常好的nNOS蛋白质配体(对nNOS蛋白质非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这在此情况下是不利于动力学的。
本发明还涉及如上述定义的检测方法，其中PIN蛋白质预先被固定在固体支持物上。
术语“固定在固体支持物上”是指一种方法，其中PIN蛋白质以共价方式(化学反应)或非共价方式(在塑料上非特异性吸附，卵白素-生物素系统，抗体)固定在固体支持物上。
当PIN蛋白质预先固定在固体支持物上时，采用表面等离子共振方法或利用检测系统标记(放射性、发光或荧光标记物，酶，生物素)检测nNOS键，这可以测量所生成复合物的量。
当PIN蛋白质预先固定在固体支持物上时，同时加入并没有预混合的nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，可以同时检测nNOS蛋白质、PIN蛋白质和两种蛋白质所生成复合物的配体。该方法因此有助于检测抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质缔合的分子，并还可以研究解离由两种蛋白质所生成复合物的化合物。
当PIN蛋白质离先固定在固体支持物上时，依次加入经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，可以检测仅抑制PIN蛋白质的化合物。实际上，如果试验化合物没有固定在PIN蛋白质上，它会在加入nNOS蛋白质前洗涤时被除去。
当PIN蛋白质预先被固定在固体支持物上时，加入与nNOS蛋白质预温育的经检测方法检测的化合物，可以同时检测PIN蛋白质、nNOS蛋白质和PIN蛋白质与nNOS蛋白质所生成复合物的配体。此实施方式促进在与PIN蛋白质温育前所述化合物与nNOS蛋白质键合，并可以研究nNOS蛋白质配体。该实施方式还可以选择非常好的PIN蛋白质配体(对PIN蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这在此情况下是不利于动力学的。
一种本发明有利的检测方法是如上述定义的检测方法，其中PIN蛋白质和nNOS蛋白质是处于溶液中。
当PIN蛋白质和nNOS蛋白质处在溶液中时，使用荧光化合物标记这两种蛋白质，并测量荧光偏振作用，可定量测定所生成的复合物。
本发明还涉及一种蛋白质，其特征在于它含有或由序列SEQ IDNO2或由包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段组成，其条件是所述片段会有位(269)的氨基酸。
序列SEQ ID NO2是从鼠中分离出的新蛋白质，对应于神经元NOS的胰腺形式。
nNOS的胰腺形式是nNOS的突变形式。它在位(269)、(953)、(1008)和(1299)有四个核酸突变。最后一种突变是不活动突变；因此，它没有引起氨基酸的变化。
本发明涉及下述序列的肽
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO3)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO4)，-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO5)，-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO6)，-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO7)，-Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO8)，-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO9)，-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO10)，-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO11)，-Lys-Asp-Lys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO12)，-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO13)，-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO14)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO15)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Cys-Arg-Asp(SEQ ID NO16)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asn-Arg-Asp(SEQ ID NO17)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Leu-Asp(SEQ ID NO18)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Cys-Asp(SEQ ID NO19)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Phe-Asp(SEQ ID NO20)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp(SEQ ID NO21)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO22)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Trp(SEQ ID NO23)，-Val-Asp-Thr-GIy-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr(SEQ ID NO24)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO25)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO26)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO27)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp(SEQ ID NO28)，-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO29)，-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO30)，-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO31)，-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO32)，-Cys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO33)，-Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO34)，-Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO35)，-Ile-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO36)，
-Val-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO37)，-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO38)，-Cys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO39)，-Ile-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO40)，-Val-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO41)，-Cys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO42)，-Ile-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO43)，-Val-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO44)，-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO45)，-Cys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO46)，-Ile-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO47)，-Val-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO48)，-His-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO49)，-Ser-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO50)，-Thr-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO51)，-Lys-Glu-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO52)，-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO53)，-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO54)，-Lys-Asp-Gln-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO55)，-Lys-Asp-Val-Ala-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO56)，-Lys-Asp-Val-Gly-Val-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO57)，-Lys-Asp-Val-Gly-Thr-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO58)；-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Ile-Asp(SEQ ID NO59)，-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Glu(SEQ ID NO60)，-Ala-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO61)，-Arg-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO62)，-Asn-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO63)，-Asp-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO64)，-Gln-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO65)，-Gly-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO66)，-Pro-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO67)，-Ser-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO68)，-Thr-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO69)，-Glu-Phe-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO70)，
-Glu-Ile-Asn-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO71)，-Glu-Ile-Asp-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO72)，-Glu-Ile-Cys-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO73)，-Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO74)，-Glu-Ile-Glu-Ala-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO75)，-Glu-Ile-Glu-Arg-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO76)，-Glu-Ile-Glu-Asn-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO77)，-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO78)，-Glu-Ile-Glu-Gln-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO79)，-Glu-Ile-Glu-Glu-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO80)，-Glu-Ile-Glu-Gly-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO81)，-Glu-Ile-Glu-His-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO82)，-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO83)，-Glu-Ile-Glu-Met-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO84)，-Glu-Ile-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO85)，-Glu-Ile-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO86)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Ile-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO87)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Pro-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO88)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ala-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO89)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Val-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO90)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn(SEQ ID NO91)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Asn(SEQ ID NO92)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Trp-Leu-Asn(SEQ ID NO93)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Tyr-Leu-Asn(SEQ ID NO94)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Val-Leu-Asn(SEQ ID NO95)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala(SEQ ID NO96)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asp(SEQ ID NO97)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gln(SEQ ID NO98)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Glu(SEQ ID NO99)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gly(SEQ ID NO100)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-His(SEQ ID NO101)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Met(SEQ ID NO102)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro(SEQ ID NO103)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ser(SEQ ID NO104)，-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Thr(SEQ ID NO105)和-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO106)，所述肽是可以采用如上述定义的方法检测的化合物，其化合物对PIN蛋白质的亲合力大于如上述定义的其中一种蛋白质对PIN蛋白质的亲合力。
这些模拟nNOS的肽是nNOS蛋白质的片段，可采用简单或组合的突变分析方法进行选择，可采用化学合成得到。
用序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的这两种肽，用序列SEQID NO3表示的肽在位9有一个突变(Arg突变为Trp)，用序列SEQ IDNO4表示的肽有三个突变(在位1Lys突变为Ile；在位3Thr突变为Val；在位9Arg突变为Trp)。这两种肽抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质的相互作用，用序列SEQ ID NO3表示的肽，Ki(IC50)(对应于抑制作用百分比为50％时的抑制常数)为4μmol/L；用序列SEQ IDNO4表示的肽，Ki(IC50)为0.4μmol/L，如在实施例2和3中所证实的。
序列SEQ ID NO3至序列SEQ ID NO106对应于突变nNOS蛋白质的片段。
本发明还涉及编码如上述定义的其中一种蛋白质、其中一种蛋白质片段或其中一种肽的核酸。本发明还涉及具有序列SEQ ID NO1的核苷酸序列。
SEQ ID NO1是已在鼠中得到鉴定的新核酸序列，编码对应于用序列SEQ ID NO2表示的神经元NOS胰腺形式的新蛋白质。
本发明涉及药物组合物，其特征在于它含有如上定义的蛋白质、蛋白质片段或肽，和药物可接受的赋形剂。
对于平均体重为60kg的成人，使用的剂量可以是每天约10mg至1g。
本发明还涉及药物组合物，其特征在于它含有所有通过如上所述筛选方法检测的非肽物质，和药物可接受的赋形剂。
本发明还涉及药物组合物，其特征在于它含有下式分子和药物可接受的赋形剂。
本发明还涉及如上定义的蛋白质、蛋白质片段或肽在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态或明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途。
对于平均体重为60kg的成人，使用的剂量可以是每天约10mg至1g。
本发明还涉及采用如前面定义的筛选方法检测的所有非肽物质在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态和明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途。
本发明还涉及下式分子在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态和明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途 前期糖尿病状的特征在于略微高的基础血糖，为6mM(108mg/dl)-7mM(126mg/dl)。此外，前期糖尿病状的特征还在于葡萄糖不耐受性，即在口服葡萄糖试验两小时后血糖为7.8mM(140mg/dl)-11mM(200mg/dl)。
胰岛素过多症相应于文献中所给出的正常人血浆水平(10μU/ml≈20pmole/L)的1.5-10倍的胰岛素血。
II型糖尿病的特征在于禁食血糖大于或等于7mM(126mg/dl)。II型糖尿病的特征还在于口服葡萄糖耐受试验两小时后血糖高于11mM(200mg/dl)。
如上所提到的，使用上述定义的蛋白质、蛋白质片段、肽或非肽物质得到的药物，可以在前期糖尿病或胰岛素过多的病人中重建正常和双阶段的胰岛素分泌。
术语“双阶段和正常的胰岛素反应”是指胰岛素分泌具有5-10分钟的第一分泌期，和较长的第二分泌期，该第二分泌期中其强度随葡萄糖摄入而变化(约1-2小时)。
如上所提到的使用如上述定义的蛋白质、蛋白质片段、肽或非肽物质得到的药物，可以在II型糖尿病人中重建其量正常的胰岛素分泌。
本发明涉及试剂盒或包(trousse)，该试剂盒或包用于检测调节，尤其降低PIN蛋白质与nNOS复合作用的化合物，其中包括-nNOS蛋白质，特别是胰腺形式nNOS蛋白质，-PIN蛋白质，-稀释所需的介质或缓冲液，-任选地洗涤介质，-介质或缓冲液，其可以在PIN蛋白质和nNOS蛋白质之间生成复合物，和PIN蛋白质或nNOS蛋白质与检测化合物之间生成复合物，-检测变化的设备，尤其是nNOS蛋白质和PIN蛋白质之间所生成复合物量降低的检测设备。
稀释所需的介质或缓冲液例如是-PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.4mMK2HPO4)，-在PBS中添加0.1％Tween 20和1％BSA(牛血清蛋白)。
合适的洗涤介质是例如添加0.1％Tween 20的PBS。
在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间生成复合物以及在PIN蛋白质或nNOS蛋白质与经检测方法检测的化合物之间生成复合物的介质和缓冲液是例如添加0.1％Tween 20和1％BSA的PBS。
用于检测在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间生成复合物量的变化的方法例如是
-使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗标记抗体(GST或(HIS)6)，-使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗nNOS抗体，-使用荧光、生物素酰化或放射性标记的抗标记抗体或(GST或(HIS)6)或抗nNOS抗体，-使用两种放射性标记或用两种荧光化合物标记的蛋白质，-使用未标记的nNOS和PIN蛋白质的表面等离子共振。
图1显示在鼠胰腺胰岛(lot pancréatique)和INS-1细胞中使用RT-PCR进行的PIN蛋白质表达分析(Asfari等人，1992)。分离全部RNA，通过逆转录合成互补DNA，然后用基于PIN蛋白质序列和β2微球蛋白(β2m)细胞的引物通过PCR扩增，它用作阳性对照。阴性对照在没有互补转录DNA(C)的情况下得到。已知大小(2000、1200、800、400、200和100碱基对)的DNA片段用作分子量(PM)的标记物。
图2显示采用蛋白质转移分析在INS-1细胞中存在PIN蛋白质(Western blot)。从INS-1细胞和鼠脑(Cerv.)中提取的蛋白质在13.5％麦黄酮凝胶上分离，转移至硝基纤维素膜上，然后与单克隆抗PIN抗体温育。信号是使用与过氧化酶偶联的抗小鼠抗体进行检测得到的，随后进行化学发光反应。16和7kDA显示分子量标记物。
图3A和3B显示通过免疫荧光法在INS-1细胞中PIN蛋白质和神经元NO合酶的共定位作用(colocalisation)。使用单克隆抗PIN抗体(图3A)和使用兔的神经元抗NO合酶抗体(图3B)双重标记INS-1细胞。使用荧光素偶联抗兔抗体和罗单明偶联抗小鼠抗体检测荧光，然后使用双道聚焦显微镜(microscope confocal àdoubles canaux)分析其荧光。刻度指示为10μm。
图4A和图4B显示在INS-1细胞中葡萄糖诱导胰岛素分泌的PIN蛋白质过表达的效果。
图4A显示采用RT-PCR分析在INS-1细胞中PIN蛋白质过表达。INS-1细胞用空表达载体(C柱)或含有PIN蛋白质互补DNA(PIN柱)的表达载体转染。分离全部RNA，并采用RT-PCR用基于PIN序列的引物通过PCR扩增互补DNA。已知大小(2000、1200、800、400、200和100碱基对)的DNA片段用作分子量的标记物(PM柱)。
图4B显示与对照细胞(C柱)相比，过表达PIN的INS-1细胞胰岛素分泌分析结果(PIN柱)。转染后48小时，这些细胞在1g/L葡萄糖存在下温育，采用放射免疫测量测定胰岛素分泌。
图5A和图5B显示对应于表面等离子共振分析得到的传感图，所述分析是分析PIN蛋白质与正常nNOS肽(图5A)之间的相互作用，或PIN蛋白质与用序列SEQ ID NO3表示的突变nNOS肽(图5B)之间的相互作用。这些肽被固定在CM5生物传感器的通道(canal)上(Biacore AB)，以递增的浓度注入源自用凝血酶消化GST-PIN产生的PIN蛋白质5μg/ml(图5A有规律的虚线曲线4和图5B有规律的虚线曲线d)；10μg/ml(图5A交错虚线曲线3，图5B交错虚线曲线c)；20μg/ml(图5A带点的曲线2，图5B带点的曲线b)；40μg/ml(图5A实线曲线1，图5B实线曲线a)。PIN蛋白质与正常肽(图5A)的键合以及PIN与突变肽的键合(图5B)记录在传感图上，随后可以检测缔合与离解常数。这些传感图给出以RU表示的反应随时间的变化，1RU(共振单位)相应于生物传感器上结合的蛋白质数量为1pg/mm2。
图6A和图6B显示对于不同浓度的用序列SEQ ID NO3和序列SEQID NO4表示的正常和突变的肽，GST-PIN蛋白质与nNOS蛋白质键合的抑制作用。将nNOS蛋白质固定在ELISA板上，并与浓度递增的肽预先温育的GST-PIN蛋白质接触。通过过氧化酶偶联抗GST抗体，然后测量在490nm处的吸收率这样可以检测这两种蛋白质之间的相互作用。
图6A显示吸收率随使用肽浓度(以μg/ml表示)的变化。黑色圆球的曲线相应于正常肽，黑色正方块的曲线相应于用序列SEQ ID NO3表示的肽，黑色菱形块的曲线相应于用序列SEQ ID NO4表示的肽。
图6B显示PIN蛋白质与nNOS键合的抑制作用百分比随肽浓度(以μM表示)的变化。黑色圆球的曲线相应于正常肽，黑色正方块的曲线相应于同序列SEQ ID NO3表示的肽，黑色菱形块的曲线相应于用序列SEQ ID NO4表示的肽。
图7A、7B、7C和7D表示采用表面等离子体方法分析正常nNOS肽(图7A)或用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的突变nNOS肽(图7B和7C)抑制PIN蛋白质与nNOS肽之间相互作用所对应的传感图。图7A、7B和7C给出其反应(以RU表示)随时间的变化，其反应相应于生物传感器上结合蛋白质的量。
图7A显示正常肽(Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp)对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线1为没有肽的情况；曲线2、3和4分别为正常肽浓度为20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的情况。
图7B显示用序列SEQ ID NO3表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线a为没有所述肽的情况；曲线b、c、d、e和f分别为所述肽浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml。
图7C显示用序列SEQ ID NO4表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线1为没有所述肽的情况；曲线2、3、4、5和6分别为所述肽浓度为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、5μg/ml和10μg/ml。
图7D显示用序列SEQ ID NO3(曲线a，圆球)和SEQ ID NO4(曲线b，正方块)表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用曲线。该图显示了PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合抑制作用百分数随突变肽浓度(以μM表示)的变化。
图8显示在递增浓度的分子C24H18N4O5S存在下，与没有所述分子的存在下得到的胰岛素分泌相比，Zucker fa/fa鼠胰岛的胰岛素分泌的分析结果。分离后，首先在0.75g/L葡萄糖存在下稳定鼠胰岛，然后在有或没有所述分子存在下，在刺激浓度为2g/L的葡萄糖存在下分三组温育。然后采用放射免疫测定测量胰岛素的分泌。
在图8中，显示胰岛素的分泌(以ng/ml表示)随所述分子浓度的变化。黑色柱为对照测量结果(没有所述分子)；灰色柱相应于在所述分子浓度为20μM存在下的测量结果；白色柱相应于在所述分子浓度为50μM存在下的测量结果；垂直阴影线柱相应于在所述分子浓度为100μM存在下的测量结果。与对照组相比(重复数n＝5)，P＜0.05(*)P＜0.001(***)表示显著性。
原料与方法存在于胰腺β-细胞中的神经元一氧化氮合酶对碘氧基苯甲醚(isoforme)互补转录DNA排序互补转录DNA互锁片段(fragment chevanchant d’ANDcomplémentaire)(450-650碱基对)是采用RT-PCR由Langerhans鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系INS-1得到(Asfari et al.，1992)。通过胶原酶消化作用从雄性Wistar鼠胰腺分离该胰岛，并通过菲柯尔梯度(gradient de Ficoll)从外分泌组织分离(Ahibata等人，1976)。INS-1细胞来自鼠胰岛素瘤(insulinome)，而且在RPMI1640中温育，该RPMI1640含有10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷酰胺、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠和50μM β-巯基乙醇。使用TRIzol(Life technologies)提取分离胰岛和INS-1细胞的全部RNA。互补转录DNA的第一条链(brin)是在3μg无规引物(amorces aléatoires)(Life technologies)、1μg Oligo引物(dT)(Life technologies)和Superscript II Rnase H-逆转录酶(Life technologies)存在下由10μg全部RNA合成得到(Lifetechnologies)。在Taq聚合酶(Life technologies)存在下使用下表所列的引物对进行PCR。
用于胰腺形式神经元一氧化氮合酶序列的有义和反义引物表
在94℃下5分钟开始变性后，运行40周期PCR，其中包括以下步骤在94℃下变性步骤持续1分钟，在60℃下杂交步骤持续1分钟，在72℃下延伸步骤持续1分钟，然后最后的延伸步骤持续10分钟。
迁移至1.5％琼脂糖凝胶后，使用QiaEx II提取试剂盒(Qiagen)纯化互补转录DNA片段。然后，使用dCTP[αS35]和Thermo SequenaseCycle Sequencing试剂盒(Amersham)对这些片段手工排序两次，使用自动测序仪(ABI PRISM 377，PE Applied生物系统)和dRhodamineTerminator Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied生物系统)排序一次。正如SEQ ID NO2所表明，已鉴定在胰腺形式神经元一氧化氮合酶序列中具有四个点突变，这意味着99.8％与鼠脑序列同源。这些突变中的三个突变修饰氨基酸序列在位269缬氨酸突变为异亮氨酸；在位953丙氨酸突变为脯氨酸；以及在位1008丝氨酸突变为苯丙氨酸。因此，胰腺神经元NO合酶与先前在鼠脑中所鉴定的神经元NO合酶具有轻微差别(Bredt et al.，1991)。
在内分泌胰腺β-细胞中存在PIN蛋白质信使RNA为了证实在内分泌胰腺β-细胞中存在的神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)信使RNA(Jaffrey等人，1996)，Langerhans鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系INS-1被用作胰腺β-细胞源。使用TRIzol(Life technologies)提取分离胰岛的全部RNA和INS-1细胞。互补转录DNA的第一股是在3μg无规引物(Life technologies)、1μg Oligo引物(dT)(Life technologies)和Superscript II RnaseH-逆转录酶(Life technologies)存在下由10μg全部RNA合成得到的。然后在Taq聚合酶(Life technologies)存在下使用下述引物对进行PCR对于PIN-5’TTGAGCGGCGCCAGCACCTTCCCT3’和-5’CGAGGTGTTCCCTTAGCAAGGCTG3’对于β2-微球蛋白 -5’ATCTTTCTGGTGCTTGTCTC3’和-5’AGTGTGAGCCAGGATGTAG3’在94℃下开始5分钟变性后，PCR运行40个周期，其中包括在94℃下变性步骤持续1分钟，在60℃下杂交步骤持续1分钟，在72℃下延伸步骤持续1分钟，然后最后的延伸步骤持续10分钟。然后，在1.5％琼胶糖凝胶上分离PCR产物，并采用溴化乙锭染色法进行目测。在胰腺胰岛和INS-1细胞中同时使用PIN引物得到预期大小(443个碱基对)的片段(参看图1)。因此，RT-PCR分析证实了在鼠胰腺β-细胞中存在PIN的信使RNA。因此，证实了在内分泌胰腺胰岛素分泌细胞中神经元NO合酶以及PIN自然抑制剂的同时表达。PIN互补转录DNA被排序，并观察到它与源自鼠脑的PIN序列完全同源(Jaffrey等人，1996)。
在INS-1细胞中存在PIN蛋白质在溶胞缓冲液中使INS-1细胞和鼠脑匀化，该溶胞缓冲液含有50mM三羧甲基氨基甲烷(Tris)(pH为7.4)、150mM NaCl、2mmol/LEDTA、1mmol/L苯基甲基磺酰基氟、10μg/ml亮抑蛋白酶肽和10μg/ml抑肽酶。通过离心去除不溶物质。通过考马斯蓝染色法(Bleu deCoomassie)(考马斯蛋白质试剂，Pierce)测定上清液中的蛋白质浓度。通过电泳在13.5％两性离子缓冲凝胶上分离80μg蛋白质，并转移至硝基纤维素膜。首先，使用在添加0.1％Tween 20的PBS中5％脱脂乳粉饱和这些膜，然后使用单克隆抗-PIN抗体(稀释1∶250，Transduction Laboraories)温育过夜。在PBS-Tween中洗涤3次后，最后该膜与过氧化物酶偶联抗小鼠抗体(稀释1；5000，SigmaAldrich)一起温育。通过化学发光试验测定免疫反应性(ECL，Amersham Life Science)。蛋白质印迹(Western blot)分析证实PIN的存在，该PIN蛋白质的大小与在鼠脑中表达的PIN蛋白质是相同的(参看图2)。
在INS-1细胞中PIN蛋白质与神经元NO合酶共定位将INS-1细胞植入Lab-Tek载玻片系统(systèms delameLab-Tek)中，并在使用前培养4天。然后使用在PBS中2％仲甲醛(磷酸酸缓冲溶液)固定20分钟，并使用0.1％Triton X-100浸渍5分钟。在用2％BSA(牛血清白蛋白)饱和非特异性位点后，使用单克隆抗-PIN抗体(稀释1∶100，Transduction Laboraories)和兔神经元抗-NO合酶抗体(稀释1∶100，Euro-Diagnostica)温育这些细胞过夜。在洗涤几次后，使用荧光素-偶联抗小鼠抗体(稀释1∶100，Biosys)和罗丹明-偶联抗兔抗体(稀释1∶100，Biosys)作用于细胞1小时。在洗涤几次后，将这些细胞放置于Citifluor(CitifluorLtd.)中，并用氩和氪激光器(Biored)共焦显微镜进行观察。PIN蛋白质存在于INS-1细胞的细胞质中(图3A)。此外，PIN的荧光信号(图3A)和神经元NO合酶的荧光信号(图3B)是严重重叠的，这表明这两种蛋白质被牢固地共定位于鼠胰腺β-细胞中。实际上，已证实在生物体外和体内，在163-245位氨基酸，PIN蛋白质与神经NO合酶相互作用(Jaffrey et al.1996)。从而看来神经元NO合酶和PIN在胰腺β-细胞内部相互作用。
在INS-1细胞系中用葡萄糖诱导胰岛素分泌的PIN的调节剂作用在INS-1细胞中过表达PIN蛋白质，并测定胰岛素对葡萄糖的反应。在真核细胞表达媒介物pCR 3.1中克隆在RT-PCR(见上述内容)后得到的PIN互补转录DNA(TA克隆试剂盒，Invitrogen)。然后以1.5μg(空的或含有PIN的)质粒使用Lipofectamine plus Reagent试剂(Life Technologies)转染INS-细胞(约8.105)。然后采用RT-PCR使用5μg全部RNA和上述所列的引物(参看表1)验证PIN的过度表达。转染48小时后，在没有葡萄糖的含碳酸氢盐的Krebs-Ringer缓冲液(pH为7.4)(108mM NaCl、1.19mM KH2PO4、4.74mM KCl、2.54mM CaCl2、1.19mM MgSO4·7H2O和18mM NaHCO3)中洗涤这些细胞，然后在37℃下在相同的缓冲液中预温育1小时。除去介质后，将这些细胞在37℃下在含有1g/L葡萄糖的Krebs中温育1小时。然后回收上清液，并通过放射免疫测定法测定胰岛素的分泌(Herbert等人，1965)。与对照细胞相比，PIN媒介物转染后，在细胞中存在多约5倍的PIN信使RNA(参看图4A)。此外，与对照细胞相比，在过表达PIN的细胞中，葡萄糖诱发的胰岛素分泌增加25％(参看图4B)。因此看来PIN在葡萄糖-诱发胰岛素分泌中起着积极的调节作用。
筛选试验实施为了产生PIN蛋白质，在媒介物pET21b(在C-端位含有多组氨酸标记，(HIS)6，如由Novagen提供)和媒介物pGEX-2T(在N-端位含有谷胱甘肽s-转移酶标记，GST，如由Pharmacia提供)中克隆在RT-PCR(见下述实施例1)后得到的PIN互补转录DNA。在通过重组质粒转变BL21细菌(DE3)(如由Novagen提供)后，该细菌在37℃下在LB介质中培养至OD为0.6。然后在30℃下用1mM IPTG(异丙基硫基-β-D-半乳糖苷)诱导5小时后产生蛋白质。离心回收该细菌，然后在标准条件下将其溶解(Short Protocols in Molecular Biology，2nd Edition，John Wiley and Son)。离心除去不溶物质，并按照提供者的建议，多组氨酸标记(如Ni NTA琼脂糖，Qiagen提供)使用nickel柱，GST标记(如Pharmacia提供)使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱纯化蛋白质。然后PIN蛋白质存储在-80℃下。
为了得到胰腺nNOS蛋白质，在病毒启动子P10控制下，在媒介物p119L中克隆含有多组氨酸标记的胰腺nNOS互补转录DNA(Poul等人1995)。采用脂转染技术(DOTAP，Roche Diagnostics)，在Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，共转染负荷媒介物和杆状病毒得到重组病毒。然后采用溶胞噬菌斑方法分离的病毒克隆，选择它们用抗nNOS抗体(Transduction Laboraories)，通过转移蛋白质(Western Blot)产生nNOS蛋白质的能力。最后按照提供者的建议，在nickel柱(如，Ni NTA琼脂糖，Qiagen提供)上纯化蛋白质。然后，将nNOS蛋白质存储在-80℃下。
根据本发明的第一种实施方式，在4℃下以在200μl PBS中1-5μg/ml的浓度，胰腺nNOS固定在塑料MaxiSorp板(Nunc)底部一夜。在含有0.1％Tween20的PBS中洗涤后，在37℃下使用100μl PBS/1％BSA饱和该板1小时，然后在存在或不存在待试验化合物的情况下，在37℃下以在100μl PBS/0.1％Tween20-1％BSA中0.1-10μg/ml的浓度，与含有GST(GST-PIN)-或多组氨酸(PIN-(HIS)6)标记的PIN蛋白质温育2小时。然后洗涤该板，再在37℃下与100μl抗标记抗体、抗GST或过氧化物酶-偶联抗(HIS)6(在PBS/0.1％Tween20-1％BSA中稀释1∶2000，Sigma Aldrich)温育1小时。在黑暗中，在过氧化物酶底物，即邻-苯二胺的存在下，通过30分钟的显色反应测定nNOS-PIN-抗体复合物的生成，在490nm处测量颜色的强度。
根据本发明第二种实施方式，将呈GST-PIN或PIN-(HIS)6形式的PIN蛋白质固定在塑料板底部，然后与胰腺nNOS接触。然后使用过氧化物酶-偶联抗nNOS抗体测定反应活性。
实施例1此实施例证实采用表面等离子共振分析，用序列SEQ ID NO3表示的nNOS突变肽与nNOS未突变的同样肽(Lys Asp Thr Gly Tie GinVal Asp Arg Asp)相比，对PIN具有较好的亲合力。
通过在固相上Fmoc化学合成(Gausephol，1992)，用AMS 422自动装置(robot AMS422)(Abimed)制备nNOS的可溶肽。这些具有10个氨基酸的nNOS肽对应于与PIN相互作用的区域(nNOS的229-238位氨基酸)。然后，这些肽去保护，并采用合适的传感器用三氟乙酸处理除去其树脂。这些肽经冻干，用分析HPLC检验它们的纯度。如果需要，随后采用制备HPLC纯化这些肽至90％，然后采用质谱进行分析。
采用BIACORE 2000(Biacore AB)分析PIN与固定肽的键合。采用NHS/EDC方案(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，Biacore AB；N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，Biacore AB)将这些在10mM(pH为4)乙酸缓冲液中浓度为10μg/ml-的肽偶联在CM5生物传感器(Biacore AB)的通道上，这样得到固定肽密度约100pg/mm2。由GST-PIN(Pharmacia)与凝血酶(Pharmacia)消化作用产生的浓度递增的PIN蛋白质(5，10，20和40μg/ml)以30μl/min流速注入生物传感器中，并记录相应于PIN-肽键合的传感图，其缔合时间为180秒，离解时间为400秒。利用BIA评估3.0软件(Biacore AB)和所谓的全程分析法(méthode d’analyse dite globale)(同时分析相应于全部使用PIN浓度的传感图的动力学缔合和离解常数)由传感图确定缔合和离解常数。作为对照，几种肽(Lys Ala Val Asp LeuSer His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp Gln Ser Leu)是nNOS片段(nNOS蛋白质的131位氨基酸至147位氨基酸)，但是不对应于PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间相互作用区域，这样的肽以相同的方式固定并以相同浓度加入至PIN中。
PIN蛋白质对用序列SEQ ID NO3表示的突变肽(参看图5B，Ka＝1.86×108；Kd＝5.38×10-9)的亲合力为正常肽(参看图5A，Ka＝8.43×107；Kd＝1.19×10-8)的2倍。在nNOS肽中引入突变(SEQ IDNO3，在位9精氨酸突变为色氨酸)增加对于PIN蛋白质的亲合力。
实施例2此实施例可证实使用上述本发明的第一种实施方式用序列SEQ IDNO3和SEQ ID NO4表示的突变肽，能够减小nNOS蛋白质与PIN蛋白质的相互作用，其中该突变肽对PIN蛋白质的亲合力高于nNOS蛋白质。
4℃下，nNOS在100μl PBS中以浓度为1μg/1ml被固定在ELISAMaxisorp板(Nunc)上过夜。在含有0.1％Tween 20的PBS中洗涤后，在37℃下使用100μl PBS-1％BSA饱和该板1小时。在相同缓冲液中，在37℃下在100μl PBS-0.1％Tween20-1％BSA中0.5μg/mlGST-PIN蛋白质预先与递增浓度(突变肽为0.01-100μg/ml；非突变肽为10-1000μg/ml)的几种肽(如上定义的)、正常肽(Lys Asp ThrGly lIe Gln Val Asp Arg Asp)或突变肽(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)温育1小时。在板上温育肽和PIN蛋白质混合物2小时。洗涤该板，然后在37℃下与100μl过氧化物酶-偶联抗GST抗体(在PBS-0.1％Tween20-1％BSA中稀释1∶2000，Sigma Aldrich)温育1小时。在过氧化物酶底物即邻-苯二胺存在下，在黑暗中通过20分钟显色反应，以证实PIN和nNOS之间复合物的形成在490nm处测量着色强度。使用如上述定义的几种肽进行对照。
在正常nNOS肽(参看图6A)存在下，对于所述肽浓度为50μg/ml，抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质键合达到14％。相反，对于50μg/ml的浓度，用序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的两种突变肽导致PIN与nNOS键合的抑制作用达到71％(用SEQ ID NO3表示的肽)和78％(用SEQ ID NO4表示的肽)。
根据PIN与nNOS蛋白质键合的抑制作用曲线(参看图6B)，用序列SEQ ID NO3表示的肽的抑制作用常数(KiIC50)为5μM，用序列SEQ ID NO4表示的肽的抑制作用常数为0.5μM，而正常肽抑制这种相互肽作用的抑制常数仅为300μM。
实施例3此实施例使用表面等离子共振分析可以证实，用序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO4表示的nNOS突变肽，该突变肽对nNOS蛋白质的亲合力高于PIN蛋白质，可以抑制nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间的相互作用。
采用Biacore 2000(Biacore AB)在合成肽存在或不存在下分析PIN与固定的nNOS蛋白质(Alexis)的键合。采用NHS/EDC方案，将在10mM(pH为5.5)乙酸缓冲液中浓度为10μg/ml的nNOS蛋白质偶联(couplée)在CM5生物传感器的通道上(如Biacore AB)，这样得到固定蛋白质密度为约6000pg/mm2。浓度为5μg/ml的PIN蛋白质在浓度递增的肽(1-100μg/ml)存在下预温育30分钟，然后以30μl/min流速注射至切片上。记录肽与nNOS蛋白质键合的传感图，缔合时间180秒，离解时间400秒。采用BIA评估3.0软件(BiacoreAB)和所谓全程分析法(同时对于分析相应于整个使用肽浓度的传感图的动力学缔合和离解常数)由传感图确定缔合和离解常数。将一些与PIN预温育的肽注射到nNOS上进行对照。
在正常nNOS肽存在下(参看图7A)，肽浓度为20μg/ml时，抑制PIN与nNOS蛋白质键合达到19％，肽浓度为50μg/ml和100μg/ml时，抑制作用达到极限45％。相反，用序列SEQ ID NO3表示的突变肽(参看图7B)在肽浓度为5μg/ml时抑制PIN与nNOS蛋白质键合达59％，而肽浓度为30μg/ml和40μg/ml时几乎完全阻断其相互作用(分别为90％和91％)。用序列SEQ ID NO4表示的突变肽(参看图7C)同样如此，在肽浓度为1μg/ml时抑制PIN与nNOS蛋白质键合达75％，而肽浓度为10μg/ml时完全抑制其相互作用(达98％)。根据PIN与nNOS键合抑制作用随所使用的肽浓度变化的曲线(图7D)，用序列SEQ ID NO3表示的肽所具有的抑制常数(KiIC50)为4μM，用序列SEQ ID NO4表示的肽的抑制常数为0.4μM。因此，两种突变肽可以抑制PIN和nNOS蛋白质之间的相互作用。
实施例4此实施例可证实，根据上述本发明的方法在生物体外筛选3000化学化合物库(Chembridge)所得到的化学式C24H18N4O5S分子，该分子可以降低胰岛素过多症和胰岛素抗性的肥胖动物中的胰岛素分泌(Zucker fa/fa鼠鼠的细胞系具有称为fa的基因突变(“fatty”的简写))。
所使用的化学分子具有如下式 根据上述方法得到的重组nNOS(100ng)在4℃，在100μl PBS中浓度为1μg/ml下被吸收于微温育板底部过夜。在37℃下在200μl1％PBS-1％BSA中饱和该板1小时，然后在37℃下，nNOS与5μl该分子(最终浓度为10μM)和0.5μg/ml GST-PIN蛋白质混合2小时。在37℃下与抗-GST抗体(稀释1/2000)温育1小时以测定PIN-nNOS复合物的生成，然后通过与邻苯二胺温育30分钟进行显色，并在490nm处读数。认为是阳性的这些分子是导致抑制该相互作用约达30-50％的分子。
根据Lacy等人的技术，(Diabetes，1967)，用胶原酶消化后术分离Zucker fa/fa鼠Langerhans的胰岛。分离后，在37℃下该胰岛在包含有0.75g/L葡萄糖的Krebs-Ringer中稳定化45分钟。然后在37℃下在含有递增浓度分子C24H18N4O5S(20-100μM)的2g/L葡萄糖Krebs-Ringer中温育多组胰岛，每组为三种，温育1小时。然后回收液体上清液，并采用放射免疫学技术(参看图8)测量胰岛素分泌。
降低PIN-nNOS相互作用的式C24H18N4O5S分子式以与剂量相应的方式(起始浓度为50μM)阻断在从胰岛素过多症鼠分离的胰岛中用2g/L葡萄糖所诱发的胰岛素分泌。实际上，浓度分别为50和100μM时，胰岛素反应分别降低36％和79％。
因此，该化学分子可以降低在这些糖尿病前期动物中的胰岛素过度分泌。
参考文献-Asfari et al.(1992)内分泌学，130，167-178，-Bredt et al.(1991)自然，351，714-718，-Gausephol(1992)肽研究(Peptide Research)，5，315-320，-Herbert et al.(1965)J.Clin.Endorinol.Metabol 25，1375-1384，-Jaffrey et al.(1996)科学(Science)，274，774-776，-Lacy et al.(1967)糖尿病(Diabetes)，16(1)，35-39，-Maechier et al.(1997)Embo J，16n°3，3833-3841，-Poul et al.(1995)免疫技术(Immunotechnology)，1，189-196，-Shibata et al.(1976)糖尿病(Diabetes)，8，667-672，-Short Protocols in Molecular Biology，2ndEdition，JohnWiley and Son.
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<221>CDS<222>(1)..(4287)<223>
<400>1atg gaa gag aac acg ttt ggg gtt cag cag atc caa ccc aat gta att48Met Glu Glu Asn Thr Phe Gly Val Gln Gln Ile Gln Pro Asn Val Ile1 5 10 15tct gtt cgt ctc ttc aaa cgc aaa gtg gga ggt ctg ggc ttc ctg gtg96Ser Val Arg Leu Phe Lys Arg Lys Val Gly Gly Leu Gly Phe Leu Val20 25 30aag gaa cgg gtc agc aag cct ccc gtg atc atc tca gac ctg att cga 144Lys Glu Arg Val Ser Lys Pro Pro Val Ile Ile Ser Asp Leu Ile Arg35 40 45gga ggt gct gcg gag cag agc ggc ctt atc caa gct gga gac atc att 192Gly Gly Ala Ala Glu Gln Ser Gly Leu Ile Gln Ala Gly Asp Ile Ile50 55 60ctc gca gtc aac gat cgg ccc ttg gta gac ctc agc tat gac agt gcc 240Leu Ala Val Asn Asp Arg Pro Leu Val Asp Leu Ser Tyr Asp Ser Ala65 70 75 80ctg gag gtt ctc agg ggc att gcc tct gag acc cac gtg gtc ctc att 288Leu Glu Val Leu Arg Gly Ile Ala Ser Glu Thr His Val Val Leu Ile85 90 95ctg agg ggc cct gag ggc ttc act aca cat ctg gag acc acc ttc aca 336Leu Arg Gly Pro Glu Gly Phe Thr Thr His Leu Glu Thr Thr Phe Thr100 105 110
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<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>24Val Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Tyr1 5 10<210>25<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>25Ile Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Trp1 5 10<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>26Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Asp Trp Asp1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>27Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Asp Trp Trp1 5 10<210>28<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>28Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Cys Trp Trp1 5 10<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>29Cys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Aspl 5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>30Ile Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>31<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>31Val Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>32Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>33Cys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10
<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>34Val Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>35<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>35Cys Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>36<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>36Ile Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>37<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>37Val Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>38<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>38Lys Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>39Cys Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>40Ile Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>41Val Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>42Cys Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>43Ile Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>44Val Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>45Lys Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>46Cys Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>47Ile Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp1 5 10
<210>48<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>48Val Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp1 5 10<210>49<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>49His Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>50<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>50Ser Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>51<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>51Thr Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>52Lys Glu Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>53Lys Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>54Lys Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>55<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>55Lys Asp Gln Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>56<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>56Lys Asp Val Ala Ile Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>57Lys Asp Val Gly Val Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>58<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>58Lys Asp Val Gly Thr Gln Val Asp Trp Asp1 5 10<210>59<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>59Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Ile Asp1 5 10<210>60<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>60Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Glu1 5 10<210>61<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>61Ala Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10
<210>62<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>62Arg Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>63<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>63Asn Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>64<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>64Asp Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>65<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>65Gln Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>66<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>66Gly Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>67<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>67Pro Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>68<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>68Ser Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>69<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>69Thr Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>70<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>70Glu Phe Glu Pro Val Leu Ser IIe Leu Asn1 5 10<210>71<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>71Glu Ile Asn Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>72<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>72Glu Ile Asp Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>73<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>73Glu Ile Cys Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>74<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>74Glu Ile Gln Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>75<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>75Glu Ile Glu Ala Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10
<210>76<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>76Glu Ile Glu Arg Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>77<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>77Glu Ile Glu Asn Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>78<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>78Glu Ile Glu Asp Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>79<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>79Glu Ile Glu Gln Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>80<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>80Glu Ile Glu Glu Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>81<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>81Glu Ile Glu Gly Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>82<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>82Glu Ile Glu His Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>83<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>83Glu Ile Glu Lys Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>84<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>84Glu Ile Glu Met Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>85<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>85Glu Ile Glu Ser Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>86<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>86Glu Ile Glu Thr Val Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>87<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>87Glu Ile Glu Pro Ile Leu Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>88<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>88Glu Ile Glu Pro Val Pro Ser Ile Leu Asn1 5 10<210>89<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>89Glu Ile Glu Pro Val Leu Ala Ile Leu Asn1 5 10
<210>90<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>90Glu Ile Glu Pro Val Leu Val Ile Leu Asn1 5 10<210>91<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>91Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Leu Leu Asn1 5 10<210>92<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>92Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Phe Leu Asn1 510<210>93<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>93Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Trp Leu Asn1 5 10<210>94<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>94Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Tyr Leu Asn1 5 10<210>95<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>95Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Val Leu Asn1 5 10<210>96<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>96Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Ala1 5 10<210>97<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>97Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asp1 5 10<210>98<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>98Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Gln1 5 10<210>99<211>10<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>99Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Glu1 5 10<210>100<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>100Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Gly1 5 10<210>101<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>101Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu His1 5 10<210>102<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>102Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Met1 5 10<210>103<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>103Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Pro1 10
<210>104<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>104Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Ser1 5 10<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>105Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Thr1 5 10<210>106<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段<400>106Glu Ile Glu Asp Val Leu Ser Phe Leu Gly1 5 10
权利要求
1.检测化合物的方法，该化合物调节用序列SEQ ID NO2表示的神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，调节该复合作用可导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的改变，其中-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量的可能显著变化，例如对应于*在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量，或*没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；和-当具有如上所定义的明显变化时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样可导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于该化合物基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性。
3.检测化合物的方法，该化合物可降低用序列SEQ ID NO2表示的神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)之间的复合作用，该复合作用的降低导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的降低，其中-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的可能显著降低，例如对应于*在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量，或*没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；和-当具有如上所定义的明显降低时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样可导致降低PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用。
4.根据权利要求1-3的任一权利要求所述的检测方法，其中检测其变化，尤其与第一对照值、第二对照值和第三对照值相比，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量可能显著降低，其中一个对照值相应于在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量；这些对照值中的另一个对照值相应于没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质造成的；这些对照值中的另一个对照值相应于在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量。
5.根据权利要求1-4的任一权利要求所述的检测方法，其中含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物可如下制备得到-或者同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，-或者依次加入PIN蛋白质、经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，或依次加入nNOS蛋白质、经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，-或者加入预先与PIN蛋白质或nNOS蛋白质温育的所述化合物，和分别或者加入nNOS蛋白质或者PIN蛋白质。
6.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中nNOS蛋白质被预先固定在固体支持体上。
7.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中PIN蛋白质被预先固定在固体支持体上。
8.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中PIN蛋白质与nNOS蛋白质是在溶液中。
9.蛋白质，其特征在于它含有序列SEQ ID NO2或包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段或是由序列SEQ ID NO2或由包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段组成，其条件是所述片段含有位(269)的氨基酸。
10.具有下述序列的肽-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO3)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO4)，-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO5)，-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO6)，-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO7)，-Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO8)，-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO9)，-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO10)，-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO11)，-Lys-Asp-Lys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO12)，-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO13)，-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO14)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO15)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Cys-Arg-Asp(SEQ ID NO16)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asn-Arg-Asp(SEQ ID NO17)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Leu-Asp(SEQ ID NO18)，-Lys-Asr-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asr-Cys-Asp(SEQ ID NO19)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Phe-Asp(SEQ ID NO20)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp(SEQ ID NO21)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO22)，-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Trp(SEQ ID NO23)，-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr(SEQ ID NO24)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO25)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO26)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO27)，-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp(SEQ ID NO28)，-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO29)，-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO30)，-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO31)，-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO32)，-Cys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO33)，-Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO34)，-Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO35)，-Ile-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO36)，-Val-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO37)，-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID 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11.核酸，该核酸编码权利要求9或10所述的其中一种蛋白质、其中一种蛋白质片段或其中一种肽，所述核酸尤其具有核苷酸序列SEQID NO1。
12.药物组合物，其特征在于它含有权利要求9所述的蛋白质或蛋白质片段，或符合下式的分子和药物可接受的赋形剂。
13.权利要求9所述的蛋白质或蛋白质片段或符合下式的分子在制备用于治疗前期糖尿病、胰岛素过多状态或明显II型糖尿病状态中胰岛素反应变化的药物中的用途。
14.检测化合物的试剂盒或包，该化合物调节，尤其是降低PIN蛋白质与nNOS的复合作用，其中包括-nNOS蛋白质，它用序列SEQ ID NO2表示，-PIN蛋白质，-稀释所需的介质或缓冲液，-任选洗涤设备，-介质或缓冲液，它们可以使PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物，PIN蛋白质或nNOS蛋白质与经检测方法检测的化合物生成复合物，-检测变化的设备，尤其是检测nNOS蛋白质与PIN蛋白质生成复合物的量降低的设备。
全文摘要
本发明涉及一种检测化合物的方法，该化合物能够调节神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，其中温育含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物，检测与对照值相比PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的显著变化，由此推断当存在如上所述的显著变化时，上述化合物与PIN蛋白质之间或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间存在键合作用，这导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质和其中一种变体的复合作用。
文档编号C12Q1/26GK1543570SQ02812252
公开日2004年11月3日 申请日期2002年4月17日 优先权日2001年4月18日
发明者R·格罗斯, A·D·拉茹瓦, G·里贝斯, R 格罗斯, 拉茹瓦, 此 申请人:英诺迪亚公司