专利名称：用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用基因工程手段制备N-乙酰化蛋白质的方法，具体地说是用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法。
背景技术：
胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫调节多肽，包括胸腺素α原、胸腺素α1、胸腺素α11等。不同物种的胸腺素α具有很高的保守性，为方便起见，本发明只提到人胸腺素α，但其他脊椎动物的胸腺素α均包括在内。
人胸腺素α原(proT)是由109个氨基酸组成的酸性蛋白，其谷氨酸和天门冬氨酸的含量大于30％，等电点3.55，可与组蛋白结合，组织分布广泛，除胸腺外，脾、淋巴、肝、肾、睾丸、卵巢、脑等组织也可检测到其mRNA。胸腺素α原具有免疫刺激活性，可增强机体抗病毒、肿瘤和真菌等的能力。它是胸腺素α1和胸腺素α11的前体，其N-末端28个和35个氨基酸分别与胸腺素α1和胸腺素α11相同。但胸腺素α原的免疫刺激活性明显高于胸腺素α1，提示其除N-末端的28肽外的其余部分也有重要作用。
N-末端乙酰化的胸腺素α1已上市，商品名“日达仙”，用于治疗病毒性肝炎等，它是采用人工化学合成的方法得到的，人工化学合成的方法具有成本高，得率低等弱点。
人胸腺素α原的cDNA编码110个氨基酸，起始甲硫氨酸后即为成熟肽，不含信号肽。天然来源的胸腺素α原和胸腺素α1、α11不仅切去了起始的甲硫氨酸，而且均为N-末端乙酰化修饰的，N-末端乙酰化修饰对提高其体内稳定性具有重要作用。
N-末端乙酰化修饰是指蛋白或多肽的肽链的氨基端氨基的乙酰化修饰，是真核细胞普遍存在的一种修饰功能。而作为原核生物的大肠杆菌，对重组蛋白或多肽的N-乙酰化修饰则非常罕见。胸腺素α1和胸腺素α原均已在大肠杆菌获得表达，并获得了纯化，但均未见有N-末端乙酰化修饰产物的报道(Wetzel et a1.Production of biologically active Na-Desacetylthymosin α1 inEscherichia coli through espression of a chemical synthesized gene.Biochemistry1980，19，6096-6104；Evstafieva AG et al.Overproduction in Escherichia coli，purification and properties of human prothymosin alpha.Euro J Biochem231639-643，1995.)，也未见有用重组大肠杆菌制备N-乙酰化修饰的胸腺素α的报道。
发明内容
为了降低制备N-末端乙酰化修饰胸腺素α的成本，提高其得率，本发明公开了一种用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰胸腺素α的方法。
本发明方法包括以下步骤首先是胸腺素α基因的制备。编码胸腺素α的基因可以用PCR方法(Saiki等Science.239487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法或构建筛选cDNA文库等方法获得，用作PCR模板或用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，可以从人胚胎胸腺获得，也可以用人工合成的方法获得。人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。若需要，可用本领域周知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。
然后进行胸腺素α基因与原核表达载体连接，构建重组表达质粒。构建方法采用本领域周知的分子生物学方法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)。原核表达载体可以选用各种大肠杆菌表达载体，可以带有复制位点，筛选标记等，这些载体的构建方法已在许多文献公开(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，也可以从各种公司购得(如Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)。优选的载体有pBV220、pET系列等(郭葆玉.基因工程药学.第二军医大学出版社2000.)。表达载体可以带有各种诱导型或组成型启动子，优选诱导型启动子，这样有利于提高重组大肠杆菌的稳定性。诱导型启动子优选温敏启动子，如PLPR启动子等，及化学诱导启动子，如Lac、Tac、Trp等。
进一步将含胸腺素α基因的重组质粒转化大肠杆菌，进行培养表达。转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如制备感受态细胞、电穿孔等。成功转化的细胞，即含有胸腺素α原基因的重组质粒的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。本发明所说的大肠杆菌为一般的大肠杆菌，可以为DHα。
转化后的大肠杆菌可以用摇瓶或生物反应器等进行培养，生产时培养优选生物反应器。培养基应能提供菌体生长和产物表达所需成分，可包含氮源、碳源、pH缓冲成份等，优选的培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。实施例一提供了一种优选的培养方法。
进而进行表达后N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的分离纯化。方法可以包括(1)分离菌体，(2)菌体破碎，(3)液相层析等步骤。从上述培养物中分离含N-端乙酰化修饰的胸腺素α的方法可以用各种蛋白分离的方法，如萃取、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中萃取可以用酚、氯仿等，沉淀可以用乙醇、异丙醇等有机溶剂及硫酸铵等盐类。液相层析可以用离子交换、凝胶排阻、亲和、疏水、反相层析等技术，优选阴离子交换或反相层析。实施例一提供了一种优选的N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原的制备方法。N-末端乙酰化修饰的胸腺素α1、α11也可用相同或相似的方法制备。
本发明所制备的N-末端乙酰化修饰的胸腺素α含量优选为大于总胸腺素α的50％，更优选为大于90％。
本发明还提供了切割N-端乙酰化修饰的，与序列表中序列1或2为同源序列的多肽或蛋白，其同源性大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，最优选为100％，经分离纯化获得N-端乙酰化修饰的胸腺素α1、α11或其类似物、修饰产物等的方法。切割可以用化学方法或酶法，优选的为羟胺。切割产物可以采用各种分离方法以获得N-端乙酰化修饰的胸腺素α1、α11或其类似物、修饰产物等，优选的方法为反相层析。
胸腺素α是一族多肽激素，本发明所说的胸腺素α是指N-端含有与序列表中序列1或序列2N-端1-28位氨基酸序列同源序列的多肽或蛋白质或其修饰产物，其同源性大于80％，同源性优选大于90％，更优选大于95％，最优选为100％。它可以是含有序列表中序列1或序列2N-端1-28位氨基酸的胸腺素α1，或含有序列表中序列1或序列2中1-35位氨基酸的胸腺素α11，或与序列表中序列1或序列2氨基酸序列同源性大于90％，优选为大于95％，最优选为100％的胸腺素α原的同源序列。
胸腺素α的氨基酸序列上某些位点存在多态性，如其N-端第13位氨基酸残基，有的是苏氨酸(Goodall，G.J.，Dominguez，F.，and Horecker，B.L.Molecular cloning of cDNA for human prothymosin.Proc Natl Acad SciUSA.(1986)，838926-8928.)，有的是异亮氨酸(Rubtsov IuP，Vartapetian AB.New intronless members of human prothymosin alpha genes.(1995)Mol Biol(Mosk)29(6)1320-5)，它们具有相同或相似的功能，本发明所述的胸腺素α均包括这些多态性类似物。
本发明中，以胸腺素α原(Ile13)和胸腺素α原(Thr13)为例，其中胸腺素α原(Ile13)或proTα(Ile13)基因，克隆自中国人胎儿胸腺cDNA，与Goodall等报道的胸腺素α原氨基酸序列基本一致，但其N-端第13位氨基酸为异亮氨酸(Ile)而不是苏氨酸(Thr)(氨基酸序列见序列表中序列1)。而胸腺素α原(Thr13)或proTα(Thr13)是与Goodall等报道的氨基酸序列完全一致的胸腺素α原(氨基酸序列见序列表中序列2)。
本发明制备的N-端乙酰化修饰胸腺素α还可以再有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基再进行修饰。所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等，及其衍生物。
本发明制备的N-端乙酰化修饰胸腺素α或其衍生物可单独使用，而优选的则为与一个或多个可接受的载体一起组成药物制剂的形式使用。该载体一般应与胸腺素α相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水或盐水，或糖类，或醇类，或氨基酸。通常它们需是无菌的，且无致热原。该制剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将N-端乙酰化修饰胸腺素α或其衍生物与具有一种或多种辅助成份混合的步骤。优选的该制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。该制剂可存在于单元剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。
本发明制备的N-端乙酰化修饰胸腺素α或其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
本发明中的N-末端乙酰化修饰胸腺素α，或其衍生物或其药物组合物，可用于各种疾病的免疫治疗，这些疾病可以是病毒性疾病、肿瘤、真菌病、免疫低下等。如病毒性肝炎、HIV感染、实体瘤、白血病等。
图1.纯化的大肠杆菌表达的人胸腺素α原的SDS-PAGEa分子量标准 b胸腺素α原图2.人胸腺素α原中proT-A(16.18分钟)和proT-B(16.41分钟)的RP-HPLC分离，横轴为洗脱时间(分钟)，纵轴为吸光度(mAU)图3.proT-A和proT-B的质谱分子量分析AproT-ABproT-B图4.proT-A和proT-B羟胺切割后的质量肽谱分析AproT-ABproT-B图5.proT-B羟胺、胰酶切割后的质谱分析图6.1478.78肽段的质谱序列分析图7.胸腺素α原(Thr13)A、B组份的质谱分子量分析AA组份BB组份具体实施方式
实施例一N-末端乙酰化的胸腺素α原(Ile13)的制备1.表达胸腺素α原(Ile13)的重组大肠杆菌的构建实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、试剂盒、DH5α等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司。
取四月龄流产人胎儿胸腺，用总RNA制备试剂盒，按试剂盒提供的方法制备总RNA，用RT-PCR试剂盒，按试剂盒提供的方法将mRNA逆转录成cDNA，以该cDNA为模板，从中扩增胸腺素α原(Ile13)的cDNA。所用的引物Prot1和Prot2用寡聚核苷酸合成仪合成。
Prot1cggaattcatgtctgatgcagctgtagataccagctccgaaatcaccatcaaggacttaProt2cgggatccctagtcatccacgtcggtcttctgPCR方法为100μl反应体系中加入1μl cDNA，20μmol/L的Prot1、Prot2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环35次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(0.3kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamHI和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pBV220质粒(张智清、侯云德、李玉英等，应用PRPL串联启动子和Cits857调控基因高效表达人γ-干扰素，病毒学报，1988，4(2)97)上，构建pBV220-proT(Ile13)，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确，DNA测序结果见序列表中序列1。
2.表达胸腺素α原(Ile13)的重组大肠杆菌的培养挑取DH5α(pBV-proT)单菌落接种LB培养基中，摇床30℃150r/min培养10-12h，按5％(v/v)接种量将上述活化菌种接10只装有100mlLB的500ml摇瓶，摇床30℃150r/min培养5小时，升温诱导培养8小时，离心收菌。
3.N-末端乙酰化的胸腺素α原(Ile13)的纯化4g菌体用40ml缓冲液A(10mmol/LTris-HCl，pH8.0)悬浮，用超声破菌仪(cole pamer公司)破菌10min(9s/次，间隔9s)，10000r/min，4℃离心20min(Backman JA-2型离心机)，取上清，加10ml饱和酚，充分混合，4℃离心10min，取水相，加40ml缓冲液A稀释后，以4ml/min的流速加载到预先用缓冲液A平衡的DEAE-Sepharose FF(Φ1.6×15cm)柱。缓冲液A平衡后，用缓冲液B(1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，pH8.0)梯度洗脱，收集流出液，SDS-PAGE分析。工程菌超声破菌上清，经酚抽可以去除大部分杂蛋白(Evstafieva A.G.，Chichkova N.V.，Makarova T，N，.etal.Overproduction in Escherichia coli，purification and properties of humanprothymosin alpha.Euro J Biochem 231639-643，1995)，然后经阴离子交换层析纯化，获得电泳纯的样品(见附图1)，该样品用RP-HPLC分离(采用HP1050高压液相色谱仪，C18柱(4.6×250mm，中科院大连化学物理所))，A液为含0.1％TFA的纯水；B液为含0.1％TFA的色谱纯乙腈(天津四友公司)，梯度细脱0→30min，A100％→10％，B 0％→90％，发现存在两种组份(见图2)，分别命名为proT-A(保留时间为16.2min)，和proT-B(保留时间为16.4min)。proT-A和proT-B冻干。质谱分子量分析和进一步的肽谱分析表明，其中proT-B的样品即为N-乙酰化修饰的胸腺素α原。
4.胸腺素α原的肽谱分析和结构确证proT-A和proT-B分别用飞行质谱分析(仪器为英国Micromass公司生产的电喷雾四极杆串连质谱，Q-TOF2)，其分子量分别为11953.75(proT-A)(图3A)和11995.75(proT-B)(图3B)，按氨基酸序列计算，去除末端甲硫氨酸，且未修饰的胸腺素α原分子量为11954，与proT-A一致，说明proT-A为去除末端甲硫氨酸但未修饰的胸腺素α原，而proT-B分子量比proT-A大42，与乙酰化修饰产生的分子量的增加一致。但胸腺素α原的许多位点可以被乙酰化修饰，需要进一步确定其修饰位点。胸腺素α原氨基酸序列上有多个胰酶切割位点，但实验却发现，用胰酶难以将其切成各个肽段。推测可能与其空间构象有关。因而改用羟胺切。胸腺素α原A、B组份，分别溶于2mol/L的盐酸羟胺，再用4.5mol/L LiOH调pH至9.0，45℃水浴保温4h，反相HPLC脱盐后冻干，用于Q-TOF2质量肽谱分析(图4)。结果见表1，除分子量大于5000的肽段未测定外，B组份与A组份均有分子量为716.3和1445.6的肽段，对应于胸腺素α原的T29-35(T29-35表示N端第29至35个氨基酸残基构成的肽段，以下同)和T29-42，A组份质量肽谱中有分子量为3093.5和3775.9的肽段，对应于胸腺素α原的T1-28和T1-35，而B组份质量肽谱中只有分子量为3135.6和3817.9的肽段，分别比组份A的T1-28和T1-35分子量大42，因而B组份为乙酰化修饰的胸腺素α原，其乙酰化修饰位点在其N端的28肽中。为了进一步确定B组份中乙酰化修饰的位点，将该组份羟胺切割产物，再用胰酶切，酶切产物脱盐后，作串连质谱分析。在第一级质谱中发现一个分子量为1478.78的肽段(图5)，比T1-14肽段分子量大42，表明这可能是乙酰化修饰的T1-14，为了精确确定修饰位点，用第二级质谱对该肽段进行测序(图6)，测序结果与胸腺素α原的T1-14序列一致，且修饰位点为N-末端的丝氨酸。说明从重组大肠杆菌制备的proT-B为N-末端乙酰化修饰的人胸腺素α原。
表1胸腺素α原两种组份羟胺切割肽段分析肽 理论值 ProT-AProT-B测定值 差值测定值差值T1-28 3093.3 3093.5 0.2 3135.642.3T1-35 3775.0 3775.9 0.9 3817.942.0T29-35 714.7716.31.6 716.3 1.6T29-42 1443.4 1445.6 2.2 1445.62.2实施例二 N-末端乙酰化的胸腺素α1(Ile13)类似物的制备将实施例二制备的N-末端乙酰化的胸腺素α原(Ile13)，溶于2mol/L的盐酸羟胺，再用4.5mol/L LiOH调pH至9.0，45℃水浴保温4h，产物用RP-HPLC分离(采用HP1050高压液相色谱仪，C18柱(4.6×250mm，中科院大连化学物理所)，A液为含0.1％TFA的纯水；B液为含0.1％TFA的色谱纯乙腈(天津四友公司)，梯度细脱0→50min，A100％→10％，B 0％→90％.)，收集各洗脱峰，分别冻干后，用Q-TOF2质谱分析，取分子量为3136左右的肽段，即为N-末端乙酰化的胸腺素α1(Ile13)类似物。它具有序列表中序列1的N-端28位氨基酸残基相同的序列，且N-末端已被乙酰化修饰，其C-末端天门冬氨酸的两个羧基也被羟胺化了。
实施例三 N-末端乙酰化的胸腺素α11(Ile13)类似物的制备将实施例二制备的N-末端乙酰化的胸腺素α原(Thr13)，溶于2mol/L的盐酸羟胺，再用4.5mol/L LiOH调pH至9.0，45℃水浴保温4h，产物用RP-HPLC分离(采用HP1050高压液相色谱仪，C18柱(4.6×250mm，中科院大连化学物理所)，A液为含0.1％TFA的纯水；B液为含0.1％TFA的色谱纯乙腈(天津四友公司)，梯度细脱0→50min，A100％→10％，B 0％→90％.)，收集各洗脱峰，分别冻干后，用Q-TOF2质谱分析，取分子量为3818左右的肽段，即为N-末端乙酰化的胸腺素α11(Ile13)类似物。它具有序列表中序列1的N-端35位氨基酸残基相同的序列，且N-末端已被乙酰化修饰，其C-末端天门冬氨酸的两个羧基也被羟胺化了。
实施例四 N-末端乙酰化的胸腺素α原(Thr13)的纯化由于人胸腺素α原的13位氨基酸残基，存在多态性，有的为苏氨酸，有的为异亮氨酸，前面实施例公开了N-末端乙酰化的胸腺素α原(Ile13)的制备方法，本实施例提供了N-末端乙酰化的胸腺素α原(Thr13)的制备方法。我们通过定位突变的方法将13位氨基酸由苏氨酸改为异亮氨酸。所用的突变引物Prot 3和Prot 4用寡聚核苷酸合成仪合成。
Prot3atgaattcatgtctgatgcagctgtagataccagctccgaaatcaccaccaaggacttaProt4cgggatccctagtcatccacgtcggtcttctgPCR方法为100μl反应体系中加入1μl 50ng/μl的pBV220-proT(Ile13)，20μmol/L的Prot3、Prot4引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环35次。通过凝胶电泳分析反应物显出一预期大小(0.3kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pBV220质粒上(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、pUC19质粒、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，形成pBV-proT。BamHI-EcoR I区DNA测序结果表明此PCR产物序列和hproT序列相同，只是在其5’-端和3’-端分别加入了BamH I位点和EcoR I位点。并在3’-端EcoR I位点前加入了终止密码子。
测序结果表明突变正确。表达的胸腺素α原(Thr13)用实施例一相同的方法分离A、B组份，质谱分析(图7)，结果表明其中B组份为N-乙酰化修饰的胸腺素α原(Thr13)组份。采用与实施例二、实施例三相同的方法制备N-末端乙酰化的胸腺素α1(Thr13)和胸腺素α11(Thr13)。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>109<212>PRT<213>
<400>1Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Ile Lys Asp Leu1 5 10 15Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala20 25 30Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala Asp35 40 45Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu50 55 60Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Glu65 70 75 80Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp85 90 95Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp100 105<210>2<211>109<212>PRT<213>
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Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala20 25 30Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala Asp35 40 45Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu50 55 60Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Asp Glu Asp Glu Glu65 70 75 80Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp85 90 95Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp100 10权利要求
1.一种用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法，包括以下步骤(1)胸腺素α基因的制备；(2)胸腺素α基因与表达载体连接，构建重组表达质粒；(3)含胸腺素α基因的重组质粒转化大肠杆菌，进行培养表达；(4)从培养物中分离含N-末端乙酰化修饰的胸腺素α的组分。
2.一种用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α1或其类似物、衍生物的方法，包括以下步骤(1)胸腺素α原基因的制备；(2)胸腺素α原基因与表达载体连接，构建重组表达质粒；(3)含胸腺素α原基因的重组质粒转化大肠杆菌，进行培养表达；(4)从培养物中分离含N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原的组分；(5)N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原切割，分离制备N末端乙酰化修饰的胸腺素α1或其类似物、衍生物。
3.一种用重组大肠杆菌制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素α11或其类似物、衍生物的方法，包括以下步骤(1)胸腺素α原基因的制备；(2)胸腺素α原基因与表达载体连接，构建重组表达质粒；(3)含胸腺素α原基因的重组质粒转化大肠杆菌，进行培养表达；(4)从培养物中分离含N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原的组分；(5)N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原切割，分离制备N末端乙酰化修饰的胸腺素α11或其类似物、衍生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中胸腺素α是一种多肽或蛋白质，其N末端28个氨基酸残基与序列表中序列1或序列2的N末端28个氨基酸残基同源性大于90％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中胸腺素α是一种多肽或蛋白质，其N末端28个氨基酸残基与序列表中序列1或序列2的N末端28个氨基酸残基相同。
6.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原与序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列同源性大于90％。
7.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原与序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列同源性大于95％。
8.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原与序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列相同。
9.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原为任选地在序列表中序列1或序列2所示的氨基酸残基序列的氨基或羧基上再进行修饰的产物。
10.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原基因采用PCR、RT-PCR、人工合成或构建筛选cDNA文库等方法之一获得。
11.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中胸腺素α或胸腺素α原基因由温敏启动子控制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中温敏启动子为PLPR启动子。
13.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中原核表达载体为pBV220。
14.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，其中大肠杆菌为DH5α。
15.根据权利要求1-3中任意一种所述的方法，其中N-末端乙酰化修饰的胸腺素α或胸腺素α原的分离纯化方法包括(1)分离菌体、(2)菌体破碎、(3)酚抽提、(4)离子交换、(5)反相层析。
16.根据权利要求1-3中的任意一种所述的方法，制备的N-末端乙酰化修饰的胸腺素α含量至少为总胸腺素α的50％。
17.根据权利要求1-3的任意一种所述的方法，制备的N-末端乙酰化修饰的胸腺素α含量至少为总胸腺素α的90％。
18.根据权利要求2或3的方法，其中切割N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原的方法是化学法或酶法。
19.根据权利要求18所述的方法，其中切割N-末端乙酰化修饰的胸腺素α原的方法是羟胺切割法。
全文摘要
本发明公开了一种用重组大肠杆菌制备N－末端乙酰化修饰的胸腺素α的方法。该方法包括胸腺素α基因的获得，含胸腺素α基因的重组表达载体的构建，转化原核细胞，原核细胞的培养及胸腺素α的表达，从培养物中分离纯化N－末端乙酰化修饰的胸腺素α。本发明还公开了一种用重组大肠杆菌制备N－末端乙酰化修饰的的胸腺素α原，然后切割分离制备N－末端乙酰化的胸腺素α1、α11或其类似物的方法。N－末端乙酰化修饰的胸腺素α具有调节机体免疫力、细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌等作用，在抗病毒、抗肿瘤方面也有较广阔的应用前景。
文档编号C12N15/70GK1532289SQ0311968
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者吴军, 马清钧, 唱韶红, 巩新, 吴 军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国人民解放军军事医学科学院生物工