中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法

专利名称：中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法
技术领域：
本发明是生物医学领域中制备中药鉴定微阵列芯片的方法。
背景技术：
中药鉴定作为中药质量标准的主要内容，不仅是在国内市场，更重要的是进入国际市场、实现中药现代化迫切需要解决的关键问题之一。我国药材资源丰富，动、植物中药约1万余种，但目前使用的商品药材来源、种类复杂，加之各地药材种使用习惯不尽相同，同名异药、同药异名，互混、互代以假充真混乱现象严重，药材伪、混品种充斥市场，且数量有增无减，长期困扰中药材市场，严重影响我国中药材的进出口和制药企业的中药产品质量，阻碍着中药的发展。为确保中药使用安全有效，控制中药质量，对各种中药材进行准确鉴定成为当务之急，同时准确鉴定中药品种是保证中医临床用药安全有效的前提。
中药传统上是用经典的形态分类学和解剖学特征，从基原、性状、显微、理化及DNA分子遗传标记技术进行药材品种及真伪的鉴别。性状鉴别是利用感官对完整药材进行鉴别；显微鉴别是利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞性状以及内含物的特性。理化鉴别是利用物理或化学的方法，对药材及其制剂所含的主要化学成分进鉴定，目前有薄层层析法、荧光法、紫外、红外光谱法等。这些方法对于动、植物药材以整体入药而保持其分类学性状特征的药材的鉴定确实是行之有效的。但是，这些方法要真正应用于中药材的鉴别还存在一些问题，一是因中药材的性状、组织结构、化学成分除了受中药材本身的遗传物质控制外，还受生长环境、气候、纬度等因素的影响而不同；二是因许多动、植物药材亲缘关系较近，外形与伪品类似或经过多道工序加工后已难辨别其原貌(如石斛加工成枫斗后)，导致上述鉴别方法结果的不稳定，不能满足中药鉴别的需要。DNA分子遗传标记技术是根据不同生物个体遗传物质DNA的差异来鉴别生物物种的方法。DNA作为遗传信息的直接载体，不受生长环境生理状态等因素的影响，因此，DNA分子遗传标记技术鉴别药材的方法虽然比上述方法都具有较高的准确性和可靠性，但都存在一定的局限性，很难推广应用，已报道的方法可归纳为三类(1)AP-PCR标记鉴别该方法在扩增反应时要求的复性温度低(通常为36℃)，特异性不高，结果容易受到多种因素的影响，在不同的实验室之间难以重复，即使在同一实验室内，每次检测样品时，都必须用已知的正品药材作为对照，同时进行DNA提取、RAPD扩增和电泳检测，比较正品药材与待检样品扩增产物电泳图谱的异同才能进行鉴定，检验成本高，因此很难推广。(2)RFLD标记鉴别该方法要求DNA无显著的降解，只适于新鲜动、植物材料的研究，它对于模板的纯度和完整性要求高，操作较烦琐，所需DNA模板的量大。中药材大多为干品，在加工、炮制、贮藏的过程中DNA的降解使得中药材RFLP结果非常不稳定，其PCR产物的片段长度有限，一般在1.5kb以下，能够找到的合适的限制性酶切位点数有限，重复性较差，目前推广应用仍有难度。(3)DNA测序法它利用某段已知的相对保守的基因片段进行PCR扩增，再进行序列测定加以鉴别。这种方法虽然准确性高，但所含信息量较少，测序成本高，目前一个约400bp的DNA片段费用为100元/反应，这尚不包括DNA提取和PCR扩增的费用，而且实验操作复杂，DNA易污染，出现鉴定错误，对大量样品的鉴别很不现实。
由于上述各种用于中药鉴定技术存在的种种缺陷与不足，迄今尚未成为任何一种中药材鉴定的常规检测手段，而生物芯片技术为中药的鉴定展现了良好的发展前景。
生物芯片是指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸及其他生物组分的准确、快捷、大信息量的检测。包括基因芯片、蛋白(多肽)芯片、多糖芯片和神经元芯片、细胞芯片、组织原位芯片等种类。其中，基因芯片是最重要的一种生物芯片，也是目前研究最多的一种生物芯片。基因芯片技术是基于碱基互补原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探针，通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行平行瞬时分析检测的技术。
目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，其应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测，具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。
本发明创立的独特的中药材gDNA序列特异性微阵列芯片制备方法获取的种质特异性探针能有效地固定在固相支持物如玻片上建立一种低成本、准确性高、重现性好、高通量的中药材种质鉴定DNA芯片技术平台。

发明内容
(1)发明目的本发明目的是提供一种便于在普通设备条件下制备中药鉴定微阵列芯片的方法。以中药材gDNA为信息载体，通过限制性内切酶酶切、差减杂交、荧光PCR标记、种质特异性探针芯片筛选等实验，制备一种低成本、准确性高、重现性好、高通量的中药材种质鉴定芯片。
(2)技术方案本发明是中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤(1)差减克隆的制备提取各样本的gDNA，用识别4个碱基的(如RsaI酶)酶切，酶切产物为平头末端，理论上每44即256个碱基就有一个酶切位点，其酶切片段大小在150-500bp之间。设计合成一对用于套组PCR的接头adaptor1(图1(1))和adaptor2(图1(2))，以试验者样本作为Tester，以另一种样本作对照为Driver。Tester分两组分别连接不同的接头后，与过量的Driver进行两次液相杂交，在进行正向杂交的同时，也进行反向杂交试验，分别以设计引物primer1(图1(3))和一对套组PCR引物nested PCR primer1(图1(4))和nested PCR primer2(图1(5))进行两次PCR扩增，对在Tester中存在而在Driver中不存在的gDNA片段进行扩增富集。PCR产物用T-vecter克隆转化大肠杆菌，挑取白色重组子克隆，挑取的克隆转入96孔培养板培养。取0.5μl培养菌液，用5′端修饰有氨基的nestedPCR primer1(-NH2基用于在修饰过的玻片上的连接固定反应)和nested PCR primer2在96微孔板中扩增差异克隆。
(2)gDNA扩增子的制备与标记gDNA酶切后，连接接头adaptor3(图1(6))，用引物primer3(图1(7))扩增时掺入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5进行标记，其PCR产物直接用于杂交筛选。
(3)种质特异性探针的芯片筛选将所有差异克隆用点样仪点样于硅烷化处理的玻片上，在一定条件下分别用荧光标记的不同样本扩增子杂交，用激光扫描仪进行扫描检测，筛选获取种质特异性探针。
(4)种质特异性探针微阵列的制备将筛选到的所有样本种质特异性探针通过机器、手工或电泳等适当方式转移到固相支持物表面制备成微阵列。
(3)技术效果本发明中药材gDNA序列特异性微阵列芯片制备方法在标准化、批量化生产及学术上有重要价值一是本发明以中药材的gDNA作为鉴别的信息载体，gDNA的信息量大，且不受外界因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含相同的遗传信息，为在基因组水平上寻找获得种质特异性探针提供技术支持。
二是本发明不同于以往传统的中药鉴定方法，而是将抑制性差减杂交(SSH)与DNA芯片筛选技术方法相结合，建立一种可在gDNA水平上的准确、稳定、重现性好、高通量DNA芯片中药鉴定技术平台。首先，采用抑制性差减杂交，对任意两样本(如石斛类)gDNA酶切产物进行两次连续差减杂交，一方面使差减得到差异克隆的几率大大提高，另一方面使得到种质特异性探针的准确性更高。再次，以差减杂交得到的差异克隆用基因芯片点样仪标准化点样于玻片上制备成微阵列，以原样本gDNA酶切标记的扩增子回复杂交，筛选出种质特异性探针。
三是本发明筛选到的大量的、多种种质特异性探针在大肠杆菌中进行克隆繁殖，点样于玻片上制备成低成本、高通量、可平行鉴别多种中药材品种及真伪的商业化中药材种质鉴定芯片，对中药的安全用药和质量控制、促进中药现代化、走向国际市场、实现中药与国际接轨具有十分重要的意义，同时，具有非常重要的商业推广应用价值。
四是本发明建立的技术平台获得的大量种质特异性探针，可对中药的基因组特征进行全面研究，为探索中药的遗传进化和生物学分类提供大量的信息资源。该研究对于建立中药材种间、真伪鉴别系统基因库标准基因图谱具有非常重要的价值。
五是本发明建立的技术平台和技术指标，对由于遗传上的差异性造成的道地药材和非道地药材质量差异的研究，以及优质中药材种质的筛选和育种栽培研究方面具有十分重要的价值。
本发明筛选到的种质特异性探针可精确、高效、经济地用基因芯片点样仪在固相支持物如玻片上制备成含大量不同种质特异性探针的微阵列芯片，不仅其制备基础与国内外基因芯片制备技术完全兼容，且在应用中与通用基因表达芯片的反应、检测设备完全兼容，提高了本项目所研制产品的使用的简便性，本发明筛选的种质特异性探针以大肠杆菌为宿主菌进行扩增，大大降低了进行商业化批量生产的成本，并不需与正品做对比实验，检测结果直观易于推广应用。
四

图1是化学合成的接头和引物。(1)是Adaptor 1；(2)是Adaptor 2；(3)是primer1；(4)是nested PCR primer1；(5)是nested PCR primer2；(6)是adaptor3；(7)是primer3。
图2是5′修饰氨基的正、反杂交获得的双链差异克隆片段。
图3是5′修饰氨基的双链差异克隆点样固定在固相支持物表面形成微阵列。
图4是差异克隆变性形成单链微阵列。
图5是用dCTP-Cy3(绿色)标记的Tester及dCTP-Cy5(红色)标记的Driver的扩增子与其杂交实验。
绿色●显示该克隆为Tester的特异性探针红色●显示该克隆为Driver的特异性探针黄色 显示该克隆为Tester和Driver均有的探针图6是种属的芯片鉴定图示。
五具体实施例方式如以石斛类铁皮石斛作为试验者(Tester)，以叠鞘石斛为对照驱赶者(Driver)，正向杂交筛选为例，反向杂交则Tester变为Driver，Driver变为Tester。
1、CTAB法提取中药材基因组(gDNA)DNA将中药材组织剪碎在液氮中研磨后，加入适量的60℃预热的2×CTAB提取液(0.1MTris-Hcl，PH8.0，20mM EDTA，PH8.0，1.4 M Nacl，2％CTAB，0.2％β-巯基乙醇)。60℃水浴2小时。经离心，酚/氯仿/异戊醇抽提后，再用RNAase A酶37℃进行处理，乙醇沉淀，溶解于适量的TE中。
2、gDNA的酶切反应提取的gDNA用识别4个碱基的平头末端内切酶(如Rsa I)在37℃酶切1.5小时，产生平头端双链gDNA片段，其大小在150-550bp之间。加入适量20×EDTA/Glycogen终止反应，酶切产物经酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，乙醇沉淀后，溶解于适量的水中。
3、Tester连接接头将适量的Tester分为两份，用T4连接酶连接，一份连接adaptor 1(图1(1))，另一份连接adaptor 2(图1(2))，连接完成后，大约1/3的gDNA片段分子连接有两个不同的接头。
4、第一次差减杂交两份连接有不同接头的Tester，分别加入过量(1∶100)的不连接头的Driver，98℃水浴变性1.5min，在68℃杂交12小时。
5、第二次差减杂交过量的Driver(1∶500)，在98℃变性1.5分钟，利用枪头气泡间隔同时将其与两份连接有不同接头的不经过变性的Tester混合在一起，在68℃杂交过夜。
6、差异片段的第一次PCR扩增富集取5中的杂交液1.5ul做摸板，用引物primer 1(图1(3))进行PCR扩增。
7、差异片段第二次PCR扩增富集取6中的杂交液1.5ul做摸板，用引物nested PCR primer 1(图1(4))和nested PCR primer2(图1(5))进行PCR扩增。
8、差异片段的T-vector克隆用7中的PCR产物建立一个标准的10ul连接反应体系即10×T4 ligation Buffer1ulT-vector 1ul纯化的PCR产物 7ulT4 DNA ligase 1ul在16℃连接过夜。
9、T-vector克隆转化大肠杆菌进行扩增繁殖取8中的2ul连接液加入新鲜制备的100ul的大肠杆菌感受态细胞中，经过一定时间的冰浴和热激后，在SOC培养基中37℃培养至菌液饱和。将细胞涂布在含有氨苄、IPTG和X-gal的平板培养皿上，37℃培养过夜。
10、挑取白色重组子克隆于96孔培养板中扩增用灭菌牙签挑取9中培养的白色重组子克隆，转入含有LB培养基的96孔培养板中，在37℃和200～250rpm条件下振荡培养过夜。
11、重组子克隆96微孔板中的扩增取10中培养的菌液0.5ul用8通道排枪对应加入96微孔扩增板中，用5′端带氨基的nestedPCRprimer 1和5′端不带氨基的nested PCR primer 2进行PCR扩增，经适量的PH5.2的3M乙酸钠和无水乙醇沉淀，真空抽干后，溶解于15ul的微阵列点样液中。
12、扩增子的PCR荧光标记在2中经酶切的gDNA混合物，连接接头Adaptor3(图1(6))，PCR混合液中掺入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5，用引物Primer3(图1(7))进行PCR荧光标记。
13、固相支持物的准备用于本发明制备种质特异性探针组成的微阵列的固相支持物可以是LB膜，(聚)四氟乙烯膜，(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯等化学膜，凝胶体、表面化学修饰的玻璃、硅、金等固相化学所用材料。固相支持物表面含有活性基团的羧基、醛基、氨基、羟基、硫醇基等类似基团。本述以玻片为例。
14、差异克隆在固相支持物表面的固定步骤11中产生的来源于正、反杂交的差异克隆通过机器、手工或电泳等适当方式转移到固相支持物表面(如玻片)，在适当条件下连接到固相支持物表面。如图2和图3。
15、种质特异性探针的筛选将14中的玻片98℃变性5分钟(图4)与12中标记的并变性的扩增子，在适宜温度和浓度条件下杂交一定时间后，依次用2×SSC，0.1％SDS；0.2×SSC，0.1％SDS各洗涤10分钟，再用水洗净，吹干。
16、种质特异性探针的扫描检测将15中吹干的玻片用芯片扫描仪获得种质特异性探针，图5。
17、种质特异性探针微阵列的制造将16中获得的种质特异性探针点样于经过修饰的玻片表面制备成微阵列并进行种质鉴定，图6。
权利要求
1.中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤(a)提取各样本的gDNA，用识别4个碱基的平头末端酶酶切，酶切产物为平头末端，理论上每44即256个碱基就有一个酶切位点，其酶切片段大小在150-500bp之间。(b)通过抑制性差减杂交(SSH)对在一个样本(设其为Tester即试验者)中存在而在另一样本(设其为Driver即躯赶者)中不存在的差异gDNA片段进行PCR扩增富集。(c)PCR产物用T-vecter克隆转化大肠杆菌，挑取白色重组子克隆，挑取的克隆转入96孔培养板培养。取0.5μl培养菌液，用5′端修饰有氨基的nested PCR primer1(图1(4))和nested PCR primer2(图1(5))在96微孔板中扩增差异克隆。(d)gDNA用识别4个碱基的平头末端酶酶切后，连接接头adaptor3，用引物primer3扩增时掺入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5进行标记的扩增子其PCR产物直接用于杂交筛选。(e)将所有差异克隆用点样仪点样于硅烷化处理的玻片上，在一定条件下分别用荧光标记的不同样本扩增子(amplicons)杂交，用激光扫描仪进行扫描检测，筛选获取种质特异性探针。(f)将获得的所有种质特异性探针制作成微阵列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于种质特异性探针的制备是以样本的基因组(gDNA)双链脱氧核糖核酸为基源，即信息载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于差异克隆通过抑制性差减杂交制备。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于差异克隆用5′端修饰有氨基的引物扩增后点样于硅烷化处理的玻片上用荧光标记的不同样本扩增子杂交，用激光扫描仪进行扫描检测，筛选获取种质特异性探针，这些种质特异性探针对于某一样本是特异性的。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用5′端修饰有氨基的引物扩增链用于固定在固相支持物包括拥有刚性和半刚性表面的材料。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用于酶切gDNA的限制性内切酶包括识别4个碱基的平头末端酶。
全文摘要
中药材gDNA种质特异性微阵列芯片制备方法是以名贵中药材(石斛)为材料，提取其不同品种gDNA，用识别4个碱基的(如RsaI酶)酶切，酶切产物为平头末端，通过抑制性差减杂交(SSH)，获取不同种间差异克隆片段并点样于玻片，采用dCTP－Cy3和dCTP－Cy5标记的gDNA扩增子与其杂交筛选到种质特异性探针，以这些大量的探针制备成可用于平行检别多个品种及真、伪的中药种质鉴定芯片。本发明以gDNA为鉴别的信息载体，在基因组(gDNA)水平上寻找获得种质特异性探针制备低成本、高通量、平行鉴别多种及真伪的中药种质鉴定芯片。获得的大量种质特异性探针，对中药的基因组特征研究及探索中药的遗传进化和生物学分类提供大量的信息，对于建立中药材种间、真伪鉴别系统基因库标准基因图谱具有非常重要的价值，同时，为道地药材和非道地药材质量差异的研究，以及优质中药材种质的筛选和育种栽培研究提供技术支撑，对中药的高通量鉴定，实现中药质量控制，促进中药现代化有广泛的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK1609231SQ0313220
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月22日 优先权日2003年10月22日
发明者李同祥, 王进科, 陆祖宏 申请人:李同祥, 王进科, 陆祖宏, 南京新益华集团有限公司