专利名称：差向异构的维生素d类似物的选择性酶促酯化和溶剂解以及所述差向异构体的分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及使维生素D类似物的C-24差向异构体及其酯选择性酶促酯化和选择性酶促溶剂解的方法。本发明进一步涉及分离维生素D类似物的混合差向异构体的方法，其包括选择性酶促酯化步骤或选择性酶促溶剂解步骤。
相关申请本申请要求于2002年1月10日提交的美国临时专利申请60/348,082和2002年1月18日提交的美国临时专利申请60/349,977的优先权。
背景技术：
自从发现为维生素D3的激素活性代谢物形式的1α，25-二羟基维生素D3(1，25-(OH)2D3)以来，已经制备了许多类似物，以得到具有低血钙(calcemic)作用的活性物质。许多努力用在维生素D侧链的修饰上。虽然1α羟基对于激素活性是必不可少的，但C-25羟基可被C-24羟基代替参见例如，MC 903，(结构I)或1，24-(OH)2D3(结构II)。
在维生素D类似物的制备中，C-24羟基的特定立体化学对于生物活性的完整表达是必需的。根据目前的方法论，通过三个方法之一引入需要的立体化学(i)通过色谱法分离C-24羟基差向异构体的非对映体混合物(参见例如，Calverley，Tetrahedron 4609-4619，1987)；(ii)立体选择性地还原相应的C-24酮，(参见例如US专利6262283)，或(iii)使对映体纯的含羟基侧链附着到维生素D骨架上(参见例如Calverley，Synlett 157-159，1990)。
由于多步骤性质和成本，立体选择性合成仍不适合于放大。差向异构体混合物的色谱分离是最广泛使用的。色谱分离中的困难在于两个C-24羟基差向异构体对于吸附剂的亲合力没有大的不同，因此他们的保留时间太接近而难以在一个色谱步骤中得到有效分离。本发明提供一种大大改善色谱分离功效的方法。
发明简述一方面，本发明涉及使在C-24立体化学(stereogenic)位置具有羟基的维生素D类似物差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24羟基选择性酶促酯化的方法，特别是其中的混合差向异构体为选自以下通式III或IX化合物的化合物C-24差向异构体的混合物 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基；该方法包括以下步骤提供具有C-24羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体和酯化试剂特别是乙酰氯、乙酸酐、乙酸乙烯酯、或丁酸乙烯酯在有机溶剂特别是正己烷或二异丙醚中的溶液，和使该溶液与脂肪酶特别是产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)或假单胞菌属(Pseudomonas sp.)脂肪酶接触。脂肪酶可以是固定的，但不必须固定。
另一方面，本发明涉及使[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环(seco)孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物选择性酶促酯化的方法，特别地，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯；该方法包括以下步骤提供混合C-24差向异构体和酯化试剂如乙酰氯或乙酸乙烯酯在有机溶剂如正己烷中的溶液，和使该溶液与脂肪酶特别是产碱杆菌属或假单胞菌属脂肪酶接触。
另一方面，本发明涉及使[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物选择性酶促酯化的方法，特别是，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5E，7Z，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯；该方法包括以下步骤提供混合C-24差向异构体和酯化试剂如乙酰氯或乙酸乙烯酯在有机溶剂如正己烷中的溶液，和使该溶液与脂肪酶特别是产碱杆菌属或假单胞菌属脂肪酶接触。
另一方面，本发明涉及使在C-24立体化学位置具有羟基的维生素D类似物的差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24羟基选择性酶促酯化的方法，该方法包括以下步骤提供具有C-24羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体和选自乙酰氯、乙酸酐、乙酸乙烯酯和乙酸丁烯酯的酯化试剂在选自正己烷和二异丙醚的有机溶剂中的溶液，和使所述溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单胞菌属脂肪酶的脂肪酶接触；其中混合C-24差向异构体为选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体的混合物 其中R1和R2为氢或叔丁基二甲基甲硅烷氧基，R3为环丙基或异丙基。
另一方面，本发明涉及使具有C-24羟基并选自以下通式III或IX化合物的维生素D类似物的C-24羟基选择性酶促酯化的方法
其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基；该方法包括以下步骤提供具有C-24羟基的维生素D类似物和选自具有2到6个碳原子的低级烷基羧酸的酰卤、酸酐和乙烯酯的酯化试剂在有机溶剂中的溶液，其中所述有机溶剂为具有至多12个碳原子的直链或支链烷烃或二烷基醚，并使所述溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单胞菌属脂肪酶的脂肪酶接触。所述脂肪酶可以为游离的或固定的。
另一方面，本发明涉及使在C-24立体化学位置具有酯化羟基的维生素D类似物的酯化C-24差向异构体混合物中一个差向异构体的酯化C-24羟基选择性酶促溶剂解的方法，特别是，其中的混合差向异构体为选自以下通式III或IX化合物的化合物的酯化C-24差向异构体的混合物， 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基；该方法包括以下步骤提供具有C-24羟基的维生素D类似物的酯化C-24差向异构体混合物和溶剂解试剂、特别是水或低级烷基醇在有机溶剂、特别是正己烷或二异丙醚中的溶液，和使所述溶液与脂肪酶、特别是产碱杆菌属脂肪酶或假单胞菌属脂肪酶接触。脂肪酶可以为固定的，但不必须固定。
在另一个实施方案中，本发明涉及使[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24酯差向异构体混合物的混合C-24差向异构体选择性酶促溶剂解，特别是使用水或低级烷基醇的方法，特别是，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体为[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的酯。
在另一个实施方案中，本发明涉及使[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24酯差向异构体混合物的混合C-24差向异构体选择性酶促溶剂解，特别是使用水或低级烷基醇的方法，特别是，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的酯。
另一方面，本发明涉及生产非对映异构体纯的维生素D类似物的方法，其包括以下步骤使具有C-24羟基的维生素D类似物在24位选择性酶促酯化。
另一方面，本发明涉及生产非对映异构体纯的维生素D类似物的方法，其包括以下步骤使在C-24立体化学中心具有酯化羟基的维生素D类似物的差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24酯选择性酶促溶剂解。
在另一方面，本发明涉及生产卡泊三烯，即(5Z，7E，22E，24S)-24-环丙基-9，10-开环胆甾-5，7，10(19)，22-四烯-1α，3β-24-三醇的生产方法，其通过包括以下步骤的方法使在C-24立体化学中心具有羟基的维生素D类似物的混合差向异构体色谱分离，其中所述步骤选自选择性酶促酯化和选择性酶促溶剂解，其中，当选择的是选择性酶促溶剂解时，两个差向异构体的C-24羟基首先酯化，当选择的是选择性酯化时，乙酸乙烯酯作为酯化试剂，并且其中选择性酯化或选择性溶剂解通过固定的或游离的产碱杆菌属脂肪酶或假单孢菌属脂肪酶实现。
另一方面，本发明涉及具有C-24位羟基的维生素D类似物的混合差向异构体的分离方法，其中C-24为差向异构中心，特别是其中混合C-24差向异构体是选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体的混合物 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基；该方法包括以下步骤正如以上所讨论的，使一个异构体的C-24羟基选择性酶促酯化，和色谱分离酯化的差向异构体和未酯化的差向异构体。当C-24差向异构体为[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物或[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物时，该方法特别适合。
另一方面，本发明涉及具有C-24位羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体的分离方法，其中C-24为差向异构中心，该方法包括以下步骤使两个差向异构体的C-24羟基酯化，使如此形成的一个差向异构体的C-24酯选择性酶促溶剂解，并色谱分离选择性溶剂解的差向异构体和未溶剂解的差向异构体。当混合C-24差向异构体为选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体混合物时，该方法特别适合。
其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
发明详述如本文中所使用的，维生素D类似物表示任何具有基本的胆钙化甾醇或麦角钙化甾醇结构及其变体的化合物，包括那些其中A环的环外双键在不同的位置和/或其中与D环在碳17处相连的侧链的结构不同，特别是那些其中侧链具有C-24环丙基或异丙基的变体(类似物)。
因为维生素D是甾族化合物，我们尽可能保持母体化合物胆固醇的环命名和编号系统。
作为本发明目的的维生素D衍生物说明如下(结构I和II)。
结构I和II 已知差向异构体是只在具有多个立体化学中心的分子如本发明所说明维生素D类似物中的多个四面体立体化学中心中的一个中心具有相反构型(R或S)的非对映异构体。可用于本发明实践的维生素D类似物的差向异构体为关于C-24构型的非对映异构体。
如C-24作为一对对映异构体的差向异构中心的命名意味着该对映异构体对的其它立体化学中心的构形是相同的。
除非上下文另外要求，与本文中使用的具有C-24羟基的维生素D类似物的差向异构体和差向异构体混合物相关的选择性酶促酯化和被选择性酶促酯化是指一个差向异构体的24位羟基在酶的帮助下被酯化试剂酯化，而基本上排除另一个差向异构体的24位羟基的酯化。基本上排除意味着在所有被酯化的分子中，至少约80摩尔％的一个差向异构体和至多约20％的另一个差向异构体被酯化(非对映异构体的比为80∶20)。优选非对映异构体的比至少为90∶10；最优选至少为95∶5。本领域技术人员知道优化下文讨论的工艺变量以实现理想的非对映异构体的比。
除非上下文另外要求，与本文中使用的具有C-24酯基(如乙酸酯)的维生素D类似物的差向异构体和差向异构体混合物相关的选择性酶促溶剂解和被选择性酶促溶剂解是指一个差向异构体的24位酯基被溶剂解，而基本上排除另一个差向异构体的24位酯基的溶剂解。基本上排除意味着在所有溶剂解的分子中，至少约80摩尔％的一个差向异构体和至多约20％的另一个差向异构体被溶剂解(非对映异构体的比为80∶20)。优选非对映异构体的比至少为90∶10；最优选至少为95∶5。本领域技术人员知道优化下文讨论的工艺变量以实现理想的非对映异构体的比。
如本文中所使用的，低级烷基是指具有一个到十个碳原子的直链或支链烷基，其可为环状的或非环状的。异丙基和环丙基是低级烷基的例子。
如本文中所使用的，芳基为具有6-12个碳原子的取代或未被取代芳基。苯基是芳基的一个例子。
在本发明中，用溶剂解试剂进行溶剂解，优选使用极性质子溶剂。优选的极性质子溶剂为水和低级脂肪醇。
酶促是指使用酶实现各工艺。优选的酶为脂肪酶。产碱杆菌属脂肪酶和假单胞菌属脂肪酶为用于本发明实践的优选的脂肪酶。所述酶可以是固定(不动)的或游离的。固定酶的方法为本领域所公知。
如本文中所使用的，羟基的酯化与酰化同义，是指本领域已知的任何用酰基(如RC(O)-)取代醇羟基中的氢的反应。
本发明的分离方法使用选择性酶促酯化步骤或选择性酶促溶剂解步骤，和在优选实施方案中使用色谱步骤。当工艺目的是具有C-24异丙基(II)或C-24环丙基(I)的化合物时，优选选择性酶促酯化步骤。
现在我们发现在酶、优选脂肪酶的存在下可使在C-24差向异构中心具有羟基的维生素D类似物的C-24差向异构体混合物在24位选择性酯化，产生一个差向异构体的C-24酯和未酯化差向异构体的原C-24醇的混合物。这在以下反应方案I中说明。对于本发明，哪个差向异构体被选择性酯化并不重要。
我们还发现，在酶、优选脂肪酶的存在下，可使维生素D类似物的C-24酯的差向异构体混合物选择性溶剂解，得到一个差向异构体的C-24酯和另一个的C-24醇差向异构体的混合物。这在以下的反应方案II中说明。反应方案II用乙酰氯说明，但可同样使用其它的酯化试剂。对于本发明的实践，哪个差向异构体被选择性溶剂解并不重要。我们发现可在维生素D类似物的C-24位形成酯，而不会同时酯化维生素D类似物A环上的羟基。因此，可不用保护如维生素D衍生物A环上的羟基而实施本方法。
反应方案I
反应方案II 虽然在本发明的实践中是不必要的，但是可方便地保护维生素D类似物A环上的羟基。如果需要，可使用本领域已知的任何用于保护羟基的方法。叔丁基二甲基甲硅烷基只是可用于本发明实践中的羟基保护基一个例子。
在一个实施方案中，本发明提供维生素D类似物的选择性酶促酯化。在选择性酶促酯化中，将由C-24羟基差向异构体混合物组成的维生素D类似物(如通式III或IX)和酯化(酰化)试剂(A)溶解在有机溶剂(S1)中形成溶液，然后使该溶液与酶(E)，优选与脂肪酶接触。适当的溶剂(S1)包括具有至多约12个碳的直链和支链烷烃如正己烷，和二烷基醚如二异丙醚。适当的酯化试剂的例子为烷基酯和烯基酯。优选的酯化试剂为乙酸乙烯酯。溶液在规定温度(T)下与酶(E)接触(如搅拌)一段时间(t)。可使用不破坏酶活性的任何温度。优选约20℃到约40℃的温度。本领域技术人员知道根据反应的进程调整反应时间。进行酯化反应后，使用高压液相色谱(HPLC)。适合使用的是Merck-HitachiModel 6200 A，其使用0.5％戊醇的正己烷溶液作为流动相。本领域技术人员知道基于以下所述的制备色谱法采用适当的分析方法。在本发明的所有实施方案中可使用相同的分析方法。当足够的不希望有的差向异构体被酯化以保证C-24醇的非对映体过量为至少约80％，优选至少约95％时，终止酯化。
此时，通过本领域技术人员已知的适当的方法分离(除去)酶，例如在这里只提到的两种方法，过滤或离心，并浓缩滤液。
在另一个实施方案中，本方法提供酯化的维生素D类似物的选择性酶促溶剂解。选择性酶促溶剂解可用选择性酶促醇解说明，在这种情况中，该步骤也可称为选择性酶促酯交换。使由C-24羟基差向异构体混合物组成的维生素D类似物(如通式III)通过本领域技术人员已知的标准方法酯化为C-24差向异构体酯的混合物，如使用酰卤、酸酐、或活性酯如链烷酸乙烯酯。然后使差向异构体酯的混合物溶解于包含溶剂解试剂的有机溶剂(S1)特别是上述低级烷烃或二烷基醚中，所述溶剂解试剂特别是低级烷基醇(R-OH)或水，以形成溶液，使所述溶液与酶(E)，优选与脂肪酶接触。在规定温度(T)下接触(如混合)一段时间(t)，进行溶剂解反应后使用HPLC。用于选择性酶促酯化的溶剂、溶剂解试剂、温度、和时间也可用于本实施方案。当以要求的非对映体过量至少约80％，优选超过95％的方式选择性地形成了足够的C-24醇差向异构体时，终止反应。在这个实施方案中，优选地，通过酯交换形成的C-24羟基差向异构体不是期望(想要)的差向异构体。
此时，通过过滤(或其它适合的方法如离心)除去酶，并浓缩滤液。
在另一个实施方案中，选择性酶促溶剂解使用水进行。在这种情况中，该步骤可称为选择性酶促水解。使由C-24羟基差向异构体混合物组成的维生素D类似物(如通式III)通过标准方法酯化(如使用酰卤、酸酐、或活性酯如链烷酸乙烯酯)。然后使差向异构体酯的混合物溶解于包含水和酶(E)如脂肪酶的有机溶剂(S1)中。混合物在规定温度(T)下搅拌一段时间(t)，进行水解反应后进行HPLC。当以要求的非对映体过量至少约80％，优选超过95％的方式选择性地形成了足够的C-24醇差向异构体时，终止反应。在这个实施方案中，优选地，形成的C-24醇为不期望的差向异构体的C-24醇，未水解的酯为期望的C-24羟基差向异构体的酯。
此时，通过本领域技术人员熟知的适当的方法除去酶，例如这里只提到的两种方法，过滤或离心。滤液浓缩。
由于现在在C-24醇和C-24酯之间极性有较大的差别，经过选择性酯化或选择性溶剂解的差向异构体现在具有可清楚辨析的洗脱时间，从而无论如何制备，可使混合物通过例如如下所述的柱色谱法一次完全分离。因此，在另一个实施方案中，本发明提供使在C-24立体化学中心具有羟基的维生素D类似物的C-24差向异构体分离的方法，其包括选自选择性酶促酯化和选择性酶促溶剂解的步骤。
然后，为得到分离的差向异构体，将得自选择性酶促酯化或选择性酶促溶剂解的浓缩物装载在色谱柱上，如下所述，并用适当的溶剂或溶剂混合物(S2)洗脱，以使C-24醇(V)与C-24酯(IV)分离，和类似地使XI与X分离，如反应方案1中所述。在反应方案1中，在C-24形成的酯为乙酸酯，但可同样使用其它的酯如丁酸酯。在另一个实施方案中，使C-24醇与C-24酯，优选与期望的差向异构体的酯分离(反应方案II)。在反应方案II中，酯化试剂为酰氯，但可同样使用其它的酯化试剂如酸酐。
可通过本领域已知的方法使分离的酯转变为期望的醇，从而从差向异构体的混合物得到基本上是立体化学纯的C-24羟基差向异构体。因此哪个差向异构体是我们想要的并不重要，本文的方法可以产生它们中的任何一个。
对于本发明的几个实施方案实践中的几个反应参数可选择的数值的例子汇总如下
反应方案III
对于色谱法步骤，可使用能够解析C-24醇和C-24酯的混合物的任何固定相(填装)和洗脱剂的组合。这种组合可由本领域的技术人员通过常规试验容易地测定。优选的固定相的例子为经过处理的二氧化硅。
对于药物化学领域技术人员，可用于分离本发明的选择性酯化或选择性溶剂解的维生素D类似物的柱色谱法是公知的。该技术使用填装有固定相如经过处理的二氧化硅的柱，在其上面装载要分离的样品。然后用适当的洗脱剂洗脱样品。洗脱可以是等度洗脱，或所谓的溶剂程序洗脱，其中洗脱剂的组成合随时间有规则地(如线性地)或不规则地(如逐步地)变化。在色谱领域公知经过预处理的硅胶是适当的固定相。用5％(v/v)乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱继之以纯乙酸乙酯洗脱只是产生期望的分离的洗脱程序的一个例子。本领域技术人员将可通过常规方法进展推导出其它适当的洗脱剂。
3.实施例通过以下非限制性实施例的方式，可使本发明得到更充分的理解。
实施例1-选择性酶促酯化向搅拌的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构III的C-24差向异构体醇混合物(20gr，31.2mmol)和乙酸乙烯酯(5.8ml，62.4mmol)的正己烷(60ml)溶液中加入0.56gr的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在25±3℃搅拌3小时，之后的HPLC分析表明差向异构体C-24(R)基本上完成向乙酸酯的转化。残余的未酯化C-24(S)醇为＞99％非对映体过量(HPLC)。溶液过滤并浓缩至干。在预处理的硅胶上色谱分离残余物，用5％乙酸乙酯的正己烷溶液然后是乙酸乙酯洗脱，给出C-24乙酸酯化合物IV(11gr)和C-24醇化合物V(7.4gr)。
产物的纯度分布如下。
实施例2-选择性酶促酯化根据供应商推荐的已知方法使0.5g的产碱杆菌属脂肪酶固定在4g Eupergit C(Rohm，Germany)上。向包含0.3g(0.47mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的C-24差向异构体醇混合物III(65∶35异构体比)、0.43ml(4.7mmol)乙酸乙烯酯和3.57ml正己烷的圆底烧瓶中加入400mg的固定化酶。混合物在35℃搅拌4小时，之后的HPLC分析表明存在30％的化合物IV、35％的化合物VIII和35％的未反应的化合物V。
实施例3-选择性酶促酯化向包含100mg(0.16mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构III的C-24醇的混合C-24差向异构体(65∶35异构体比)、0.044ml(0.47mmol)乙酸乙烯酯和1.5ml的二异丙醚的小瓶中加入10mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌2小时，之后的HPLC分析表明存在65％的化合物IV和35％的化合物V。
实施例4-选择性酶促酯化向包含100mg(0.16mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的C-24醇III的混合C-24差向异构体(65∶35异构体比)、0.044ml(0.47mmol)乙酸乙烯酯和1.5ml的四氯化碳的小瓶中加入10mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌2小时，之后的HPLC分析表明存在65％的化合物IV和35％的化合物V。
实施例5-选择性酶促酯化向包含100mg(0.16mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构III的C-24醇的混合C-24差向异构体(65∶35异构体比)、0.140ml(1.6mmol)乙酸乙烯酯和0.36ml正己烷的小瓶中加入50mg的假单孢菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌1小时，之后的HPLC分析表明存在65％的化合物IV和35％的化合物V。
实施例6-选择性酶促酯化向包含5g(7.8mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构III的C-24醇的混合C-24差向异构体(65∶35异构体比)、1.26ml(15.6mmol)丁酸乙烯酯和8.7ml正己烷的圆底烧瓶中加入250mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌2小时，之后的HPLC分析表明存在65％的C-24丁酸酯(如结构IV的丁酸酯类似物)和35％的化合物V。在预处理的硅胶上通过色谱法从丁酸酯中分离醇。
实施例7-选择性酶促酯化向包含300mg(0.468mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构III的C-24醇的C-24差向异构体混合物(65∶35异构体比)、和4ml乙酸乙酯的圆底烧瓶中加入50mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在35℃下搅拌24小时，之后的HPLC分析表明存在45％的化合物IV、20％的化合物VIII和35％的化合物V。
实施例8-选择性酶促酯化向包含10g(15.6mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的化合物VIII、2.9ml(31.3mmol)乙酸乙烯酯和17.1ml正己烷的圆底烧瓶中加入800mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌4小时，之后的HPLC分析表明存在99％的化合物IV。
实施例9-选择性酶促酯化向包含1g(1.56mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的C-24差向异构体醇混合物IX(65∶35异构体比)、0.44ml(4.68mmol)乙酸乙烯酯和2.9ml正己烷的圆底烧瓶中加入250mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌3小时，之后的HPLC分析表明存在65％的化合物X和35％的化合物XI。
实施例10-选择性酶促酯化向包含25mg(0.06mmol)的其中R1＝R2＝H和R3＝环丙基的C-24差向异构体醇混合物IX(50∶50异构体比)、0.044ml(0.48mmol)乙酸乙烯酯、0.5ml的丙酮和2ml的二异丙醚的小瓶中加入50mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌3小时，之后的HPLC分析表明存在50％的化合物X和50％的化合物XI。通过H-NMR证实只在C-24羟基位置上发生乙酰化。
实施例11-选择性溶剂解向包含2g(3.2mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的C-24差向异构体醇混合物III(65∶35异构体比)在8ml吡啶中的溶液的圆底烧瓶中滴加乙酸酐(0.4ml，4.2mmol)，同时保持5℃的温度。温度升高到45℃，并且反应放置24小时。用10ml正己烷萃取混合物，并蒸发有机相。得到1.7g的VI乙酸酯混合物。向包含100mg(0.15mmol)的混合物VI(65∶35异构体比)、0.041ml(0.45mmol)乙醇和2ml正己烷的小瓶中加入200mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌72小时，之后的HPLC分析表明存在65％的化合物VIII和35％的化合物VII。
实施例12-选择性溶剂解向包含100mg(0.15mmol)的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的C-24差向异构体乙酸酯混合物VI(65∶35异构体比)、5ml的H2O和1.5ml正己烷的小瓶中加入250mg的产碱杆菌属脂肪酶。混合物在室温下搅拌260小时，之后的HPLC分析表明存在32％的化合物VII和62％的化合物VIII。
实施例13制备卡泊三烯(MC 903)包含在光化学反应器中并冷却到5-8℃的其中R1＝R2＝叔丁基二甲基甲硅烷基和R3＝环丙基的结构V的醇(15.3g，24mmol)、9-乙酰基蒽(1.6g，7.2mmol)、和三乙胺的甲苯溶液(350μL三乙胺在1200ml甲苯中的溶液)的溶液用高压紫外线灯的光线照射到完成反应(～45min)。把反应混合物转移到蒸发器中。用2×100ml的甲苯淋洗反应器，并把洗液加到蒸发器中。真空下蒸干混合物，得到结构XI的醇粗品15.3g。
使醇XI溶解于THF(450ml)中并向溶液中加入四丁基氟化铵(45ml，45mmol)。在氮气氛围下使得到的混合物在40℃下加热2小时并蒸干。残余物溶解于乙酸乙酯(1200ml)中，溶液用2％碳酸氢钠溶液(2×150ml)洗，然后用盐水(1×250ml)洗。溶液用Na2SO4干燥并蒸干。残余物在硅胶(1200g)上色谱分离，用乙酸乙酯在正己烷中形成的混合物洗脱。收集适当的洗脱级分(通过TLC检查)并蒸发，得到7g的泡沫状物质。
3g产物从丙酮结晶然后从甲酸甲酯结晶，得到1.3g的卡泊三烯。
权利要求
1.一种使在C-24立体化学位置具有羟基的维生素D类似物的差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24羟基选择性酶促酯化的方法，该方法包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体和酯化试剂在有机溶剂中的溶液，和b)使该溶液与脂肪酶接触。
2.权利要求1的方法，其中混合C-24差向异构体为选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体混合物 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
3.权利要求2的方法，其中R1和R2都是H。
4.权利要求2的方法，其中脂肪酶为产碱杆菌属脂肪酶。
5.权利要求2的方法，其中脂肪酶为假单孢菌属脂肪酶。
6.权利要求2的方法，其中脂肪酶为固定的。
7.权利要求2的方法，其中脂肪酶为游离的。
8.权利要求2的方法，其中混合C-24差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
9.权利要求8的方法，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯。
10.权利要求2的方法，其中混合差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
11.权利要求10的方法，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体为[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯。
12.权利要求2的方法，其中酯化试剂选自具有2到6个碳原子的低级烷基羧酸的酰卤、酸酐和乙烯酯。
13.权利要求12的方法，其中酯化试剂选自乙酰氯、乙酸酐、乙酸乙烯酯、和丁酸乙烯酯。
14.权利要求2的方法，其中有机溶剂为具有至多12个碳原子的直链或支链烷烃、二烷基醚、或烷基羧酸的烷基酯。
15.权利要求14的方法，其中有机溶剂为正己烷、乙酸乙酯、或二异丙醚。
16.一种使在C-24立体化学位置具有羟基的维生素D类似物差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24羟基选择性酶促酯化的方法，该方法包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体和选自乙酰氯、乙酸酐、乙酸乙烯酯、和丁酸乙烯酯的酯化试剂在选自正己烷、乙酸乙酯、和二异丙醚的有机溶剂中的溶液，和b)使该溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单胞菌属脂肪酶的脂肪酶接触，其中混合C-24差向异构体是选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体混合物 其中R1和R2为氢或叔丁基二甲基甲硅烷基，R3为环丙基或异丙基。
17.使在C-24位具有羟基并选自以下通式III或IX化合物的维生素D类似物的C-24羟基酶促酯化的方法 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基，其包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物和选自具有2到6个碳原子的低级烷基羧酸的酰卤、酸酐和乙烯酯的酯化试剂在有机溶剂中的溶液，所述有机溶剂为具有至多12个碳原子的直链或支链烷烃、烷基羧酸烷基酯、或二烷基醚，和b)使该溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单胞菌属脂肪酶的脂肪酶接触。
18.权利要求17的方法，其中酯化试剂选自乙酰氯、乙酸酐、乙酸乙烯酯、和丁酸乙烯酯。
19.权利要求18的方法，其中溶剂为正己烷、乙酸乙酯、或二异丙醚。
20.一种使在C-24立体化学位置具有酯化羟基的维生素D类似物的酯化C-24差向异构体混合物中一个差向异构体的酯化C-24羟基选择性酶促溶剂解的方法，该方法包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合酯化C-24差向异构体和溶剂解试剂在有机溶剂中的溶液，和b)使该溶液与脂肪酶接触。
21.权利要求20的方法，其中混合酯化C-24差向异构体是以下通式III或IX化合物的混合差向异构体的酯 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
22.权利要求21的方法，其中R1和R2都是H。
23.权利要求21的方法，其中脂肪酶为产碱杆菌属脂肪酶。
24.权利要求21的方法，其中脂肪酶为假单孢菌属脂肪酶。
25.权利要求21的方法，其中脂肪酶为固定的。
26.权利要求21的方法，其中脂肪酶为游离的。
27.权利要求21的方法，其中混合酯化C-24差向异构体为[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24酯的C-24差向异构体混合物。
28.权利要求27的方法，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体为[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的酯。
29.权利要求21的方法，其中酯化混合差向异构体为[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24酯的C-24差向异构体混合物。
30.权利要求29的方法，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体为[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯。
31.权利要求21的方法，其中溶剂解试剂为水。
32.权利要求21的方法，其中溶剂解试剂为醇。
33.权利要求21的方法，其中溶剂为具有至多12个碳原子的直链或支链烷烃、烷基羧酸烷基酯、或二烷基醚。
34.权利要求32的方法，其中溶剂为正己烷、乙酸乙酯、或二异丙醚。
35.一种使在C-24立体化学位置具有酯化羟基的维生素D类似物的酯化C-24差向异构体混合物中一个差向异构体的酯化C-24羟基选择性酶促溶剂解的方法，该方法包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合酯化C-24差向异构体和溶剂解试剂在选自正己烷、二异丙醚和乙酸乙酯的有机溶剂中的溶液，所述溶剂解试剂为水或烷基醇，和b)使该溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单孢菌属脂肪酶的脂肪酶接触，其中混合酯化C-24差向异构体是以下通式III或IX化合物的混合差向异构体的酯 其中R1和R2可相同或不同，表示氢或叔丁基二甲基甲硅烷基，R3为环丙基或异丙基。
36.一种使在C-24立体化学位置具有酯化羟基的维生素D类似物差向异构体的酯化C-24羟基酶促溶剂解的方法，该方法包括以下步骤a)提供在C-24位具有羟基的维生素D类似物的酯化C-24差向异构体和溶剂解试剂的溶液；和b)使该溶液与选自产碱杆菌属脂肪酶和假单孢菌属脂肪酶的脂肪酶接触，其中酯化C-24差向异构体是以下通式III或IX化合物的C-24酯 其中R1和R2可相同或不同，表示氢或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
37权利要求36的方法，其中溶剂解试剂为水或低级烷基醇。
38.权利要求36的方法，其中溶剂为正己烷、二异丙醚、或乙酸乙酯。
39.在生产非对映异构体纯的维生素D类似物的方法中，使在C-24位具有羟基的维生素D类似物在24位上选择性酶促酯化的步骤。
40.在生产非对映异构体纯的维生素D类似物的方法中，使在24位立体化学中心具有酯化羟基的维生素D类似物差向异构体混合物中一个差向异构体的C-24酯选择性酶促溶剂解的步骤。
41.在生产卡泊三烯即(5Z，7E，22E，24S)-24-环丙基-9，10-开环胆甾-5，7，10(19)，22-四烯-1α，3β，24-三醇的工艺中，使在C-24立体化学中心具有羟基的维生素D类似物的混合差向异构体进行色谱分离，通过包括选自选择性酶促酯化和选择性酶促溶剂解的步骤的方法进行，其中当选择的是选择性酶促溶剂解时，首先使两个差向异构体的C-24羟基酯化，和当选择的是选择性酯化时，酯化试剂是乙酸乙烯酯，和其中选择性酯化或选择性溶剂解通过产碱杆菌属脂肪酶或假单孢菌属脂肪酶实现。
42.使在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合差向异构体分离的方法，其中C-24为差向异构中心，该方法包括以下步骤a)使一个差向异构体的C-24羟基选择性酶促酯化，和b)使酯化的差向异构体与未酯化的差向异构体进行色谱分离。
43.权利要求42的方法，其中混合C-24差向异构体是选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体的混合物 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
44.权利要求43的方法，其中混合C-24差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
45.权利要求44的方法，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯。
46.权利要求43的方法，其中混合差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
47.权利要求46的方法，其中被选择性酯化的C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯。
48.一种使在C-24位具有羟基的维生素D类似物的混合C-24差向异构体分离的方法，其中C-24为差向异构中心，该方法包括以下步骤a)使两个差向异构体的C-24羟基都酯化，b)使一个差向异构体由此形成的C-24酯选择性酶促溶剂解，和c)使选择性溶剂解的差向异构体与未溶剂解的差向异构体进行色谱分离。
49.权利要求48的方法，其中混合C-24差向异构体是选自以下通式III或IX化合物的化合物的C-24差向异构体混合物 其中R1和R2可相同或不同，表示氢、或羟基保护基，R3为低级烷基、环烷基、或芳基。
50.权利要求49的方法，其中混合C-24差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
51.权利要求50的方法，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5E，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的酯。
52.权利要求49的方法，其中混合差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R，S)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的C-24差向异构体混合物。
53.权利要求52的方法，其中被选择性溶剂解的酯化C-24羟基差向异构体是[1α，3β，5Z，7E，20R]-1，3-双(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-20-(3′-环丙基-3′(R)-羟基-1′-丙烯基)-9，10-开环孕甾-5，7，10(19)-三烯的酯。
全文摘要
本发明提供一种使在C－24立体化学中心具有游离或酯化羟基的维生素D类似物的差向异构体选择性酶促酯化或选择性酶促溶剂解的方法。该方法可用于如分离维生素D类似物的混合差向异构体。
文档编号C12P41/00GK1639329SQ03805626
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月9日 优先权日2002年1月10日
发明者E·夏皮罗, A·费斯曼, R·埃芬伯格, A·迈蒙, A·施瓦茨 申请人:特瓦制药工业有限公司