专利名称：抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系及其应用，更确切地说是利用细胞工程和抗体工程技术，获得分泌抗尿激酶原单克隆抗体鼠-鼠杂交瘤细胞系，并通过杂交瘤细胞的多孔微载体培养，及采用亲和层析方法纯化细胞培养上清，制备可用于纯化尿激酶原及其理化性质鉴定的单克隆抗体，属于生物工程技术领域。
背景技术：
血栓病已严重威胁着人体健康，尿激酶原(prourokinase，Pro-UK)也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single-chain urokinase-type plasminogen activator，scu-PA)，与t-PA一样是第二代溶栓药物，特异性强，副作用小，再栓塞率低。尿激酶原是尿激酶(UK，tcu-PA)前体，两者在肽链结构上差异甚微，只有一个抗原表位的不同，而在临床中治疗脑梗、心梗时疗效却迥然不同，尿激酶在临床上有严重的出血倾向。而尿激酶原给药时，能够选择性地在纤维蛋白表面激活纤溶酶原，可以克服尿激酶使用过程中非特异地激活全身纤溶系统所造成的出血倾向问题，故以scu-PA作为溶栓药更有前途。
目前尿激酶原的纯化方法一般是利用离子交换柱从细胞培养上清中分离尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)得到纯度为80％左右的粗品，尔后用凝胶过滤色谱提纯u-PA粗品得到纯度在98％以上的u-PA，这里的u-PA是由单链u-PA(scu-PA)即尿激酶原和双链u-PA(tcu-PA)即尿激酶组成，要得到纯度在98％以上的单链u-PA，还需用苯甲脒亲和柱分离scu-PA和tcu-PA。用这种方法纯化scu-PA，制备规模较大，但比较复杂，回收率较抗体亲和层析低，在60％～70％左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达抗单链尿激酶原单克隆抗体(anti-scu-PAmonoclonal antibody)的杂交瘤细胞系。
本发明的另一个目的是提供这种杂交瘤细胞系的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(北京市海淀区中关村北一条13号，100080，电话010-62542758)，保藏日为2003年9月8日，保藏号为CGMCC No.0999，建议的分类命名为3G7-anti-scuPA鼠-鼠杂交瘤细胞系。该细胞系具有以下特点半贴壁生长，形态为圆形，细胞倍增时间为20-24h，在方瓶中培养，培养上清的抗体滴度约为1∶30000。
该单克隆抗体杂交瘤细胞系的获得方法是用纯度为99％的尿激酶原免疫小鼠，做细胞融合，筛选得到阳性及特异性最强的杂交瘤细胞株。
所述抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系用于制备检测和纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用。
所述制备纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用是指培养杂交瘤细胞，获得抗单链尿激酶原单克隆抗体，并与用CNBr活化的Sepharose 4B胶交联，制备用于尿激酶原纯化的亲和层析柱。
所述的抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系的保存号为CGMCC No.0999。使用多孔微载体技术培养该杂交瘤细胞，获得大量的含抗单链尿激酶原单克隆抗体的培养上清。收集细胞培养上清，用亲和层析柱纯化上清中的抗单链尿激酶原单克隆抗体。该抗体可用于制备纯化尿激酶原的亲和层析柱。
本杂交瘤细胞系的发明为尿激酶原的纯化提供了一种高效、简便、快捷的抗体亲和层析手段。
本发明的优点是(1)该细胞株分泌的单克隆抗体亲和力适中、特异性强。与尿激酶原有特异性结合，而与组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)蛋白、牛血清白蛋白(BSA)无任何交叉反应。(2)有的杂交瘤细胞株在连续传代过程中抗体表达容易丢失，该细胞株连续传代半年，抗体表达非常稳定。(3)用该细胞生产抗体制备了亲和层析柱纯化尿激酶原，一步纯化，尿激酶原的比例可达95％左右，回收率在90％以上，该方法纯化步骤简便，纯化效率高。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡依照本发明所述方法进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施例方式
实施例1、表达抗单链尿激酶原单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞的建立一、小鼠的免疫用0.5mL纯度为99％的尿激酶原50μg(S-2444方法测定结果，本课题组制备，见中国专利ZL96119836.2，国际专利主分类号C12N 15/58)，与0.5mL的福氏完全佐剂(Gibco公司，Cat No.15721-012)充分混合，腹腔或皮下多点注射Balb/c小鼠，10天后，用0.5mL的尿激酶原(60μg)与福氏不完全佐剂(Gibco公司，Cat No.15720-014)充分混合再次免疫小鼠，第20天时，直接用100μg的尿激酶原0.8mL再次免疫小鼠。第28天眼球放血，测定抗体滴度，当抗体滴度至少达到1∶1000时，在融合前一天以同等剂量加强免疫待融合。
二、脾淋巴细胞B细胞的制备取已经免疫好的Balb/c小鼠，摘出眼球放血，并分离血清供检测抗体用，同时将小鼠处死，浸泡于75％酒精中5分钟，随即放入超净台。无菌开腹，取出脾脏，放入5-10mL RPM1640培养基(Gibco公司，Cat No.11875-135)轻洗一次，拨去周围的结绨组织。将脾脏移入另一盛有5mL RPM1640的培养基平皿中，置于200目铜网上，用注射器内芯积压研磨脾脏并用培养基冲洗铜网，使脾细胞全部通过网孔挤到溶液中。将脾细胞转到50mL离心管中，加RPM1640培养基30mL混匀用1000r/min离心5分钟，弃上清，再用同法洗一次上述细胞制成细胞悬液，每只小鼠可得(1-2.5)×108个脾细胞。
三、鼠骨髓瘤细胞Sp2/0的获得复苏冻存的鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(购自American Type Culture Collection，ATCC CRL-1581，Sp2/0-Ag14)，用含10-20％的优级胎牛血清(美国Hyclone公司生产)的DMEM/F12(1∶1)(美国Hyclone公司生产，Cat No.SH30004.04)培养基培养，融合前2天，将1瓶细胞传至3瓶培养，使细胞处于对数生长期，活力最好，收集此时的Sp2/0细胞，记数，取(1-2)×107个细胞，离心，弃上清，置室温待用。
四、细胞融合将准备好的鼠骨髓瘤细胞Sp2/0和小鼠脾细胞移至一50mL离心管中，加入10-20mL不含血清的RPMI1640培养基，离心，弃上清。将离心管放在掌心摇动，使细胞团成松散的糊状。将离心管置37℃水浴中，吸取约1mL50％的PEG溶液，慢慢加入细胞中，边加边搅，1min加完。静置1min，在2min内慢慢加入2mL无血清培养基，再在2min内加入8mL无血清培养基，边加边搅。离心，吸去上清，将细胞团摇散，加入5mL新鲜的RPMI1640培养基。
五、融合细胞的筛选、扩增和抗体类型鉴定1、融合细胞的选择性培养与阳性克隆检测将融合细胞加入50mL含20％胎牛血清的HAT选择性培养基(Gibco公司，Cat No.31062-011)，混匀后接种到已铺有饲养细胞的两块96孔细胞培养板培养。96孔板每孔加100μL，含细胞5×105(不包括饲养细胞)；培养7-10d换HT培养基(Gibco公司，Cat No.31067-030)。同时用ELISA检测方法检测各孔上清中的抗单链尿激酶原特异阳性孔，并做好阳性孔标记。
2、阳性杂交瘤的克隆化培养收集抗单链尿激酶原特异阳性孔的培养细胞，记数，按100,000、10,000、1000、100和10倍的密度用RPMI1640培养基做系列稀释，取96孔培养板，预先按每孔105-106加入饲养细胞和100μL RPMI1640培养基，然后加入8-10个/mL的低密度细胞悬液100μL。将培养板置于5％CO2、37℃培养7-10d。2-4d左右对确为1个细胞克隆生长的孔做好标记，若该孔再进行克隆化培养，并及时冻存获得的阳性杂交瘤细胞。我们从中筛选到阳性及特异性最强的一株杂交瘤细胞系，命名为3G7-anti-scuPA。
3、抗体类型鉴定用0.1M的PBS配置1％的琼脂溶液，趁热倒入小平皿中，凝结后打孔，中间打一个，周围打4-8个。取杂交瘤细胞培养上清1mL，加硫酸铵0.3g，沉淀抗体。1000rpm离心5min，弃上清，加入100μL PBS，溶解沉淀物。取上述溶液10μL加至中央孔中，周边孔中分别加入不同抗人Ig类的抗体10μL，4℃保湿放置24h以上，从结果可看出，我们的抗体类型为IgG1。
将细胞株3G7-anti-scuPA保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号为CGMCC0999。
实施例2、应用简便、高效的纯化scu-PA的方法一、制备尿激酶原单克隆抗体1、杂交瘤细胞的扩增用100mL方瓶培养得到的可分泌抗单链尿激酶原的单克隆抗体的杂交瘤细胞3G7-anti-Pro-UK，每瓶加入10mL培养基，培养基为DMEM/F12(1∶1)，添加胎牛血清含量为5-10％，待细胞长满后转入1000mL转瓶培养，一般3个方瓶可传一个转瓶，转瓶中加入100mL 2％血清的培养基，转速为0.3rpm。细胞在转瓶中长满后，3-5瓶转瓶中的细胞可转入一个1.5L搅拌瓶中继续培养，培养基体积为300-500mL，采用Cytopore-2多孔微载体(Pharmacia Biotech AB，瑞典，CatNo.17-1271-02)培养杂交瘤细胞，多孔微载体的使用浓度为1-2g/L培养基。培养的初始阶段，血清浓度为1-2％，待细胞密度大于5×106后，可使用低血清(0.1％-0.5％)或无血清培养基培养，收集培养上清纯化其中的单抗。
2、单克隆抗体的纯化利用蛋白-G亲和层析法，纯化培养上清中的抗单链尿激酶原的单克隆抗体。先用2-3倍柱床体积的PBS(0.1mol/L，pH7.1)平衡亲和柱(型号1×5，PharmaciaBiotech AB，瑞典，Cat No.17-0404-01)，取培养上清过柱，流速为1-2mL/min，使单抗充分结合在亲和柱上，用PBS(0.1mol/L，pH7.1)洗涤亲和柱至OD值接近于零，再用0.5mol/L NaCl-PBS溶液洗柱以去除非特异性吸附，之后用三倍柱床体积的PBS洗涤亲和柱。以50mmol/L的甘氨酸-HCl溶液(pH2.3)洗脱，流速为1-2mL/min，收集洗脱液，并用1mol/L的Tris溶液迅速将洗脱液的pH调至中性。
二、用所获得的抗单链尿激酶原的单克隆抗体制备免疫亲和层析柱纯化尿激酶原1、制备亲和层析柱将4.2g CNBr活化Sepharose 4B胶(Pharmacia Biotech AB，瑞典，CatNo.17-0430-01)与10mL上述纯化后蛋白浓度为6.3mg/mL anti-scu-PA IgG交联，交联的具体方法(1)称取4.2g CNBr活化Sepharose4B，于砂芯漏斗中(G-2号)用1mmol/L HCl浸泡，在15min内用50倍体积的上述HCl缓冲液抽洗及膨胀(1g干胶约有3-4ml体积)，抽干后立即与配基偶联。(2)将活化好的琼脂糖珠加到已用0.1mol/L pH8.4 NaHCO3缓冲液平衡的蛋白中(NaHCO316.8g溶于2000mL H2O中)，琼脂糖珠与蛋白量的比例1g干重活化的Sepharose 4B胶加到10mL含有15mg IgG蛋白，置4℃条件下，转鼓交联过夜，或室温4h以上(室温20℃左右)。交联后的4B-蛋白珠，用上述NaHCO3缓冲液以20倍左右的体积抽洗未结合蛋白，然后用5倍左右体积的0.1M pH2.8 HCl-甘氨酸缓冲液(0.2mol/L HCl，16.8mL，0.2mol/L Gly 50mL加水至100mL)洗去非特异吸附蛋白。上述两步洗液皆收集测定蛋白含量。(3)封闭残余的活性集团将交联后4B球与等体积的1mol/L乙醇胺溶液混合，转鼓摇动4h左右，用0.1mol/L pH7.4磷酸缓冲液(PBS)含有0.1mol/L的赖氨酸溶液洗球，再用10倍左右体积的0.1mol/L pH7.4 Tris-HCl(0.2mol/L Tris 50mL，0.2mol/L HCl 40mL，加水至200mL)抽洗至OD280nm＝0.04，装柱规格2×10cm，4℃于冰箱保存备用。
2、纯化尿激酶原用制备的免疫亲和柱纯化分泌尿激酶原的细胞培养上清，平衡液(1)0.01mol/L Tris-HCl pH7.5，洗杂蛋白液(2)0.1mol/L Tris-HCl 0.3mol/L NaCl pH7.5，洗目的蛋白(3)0.1mol/L Gly-HCl pH2.0以上三种液体用0.45μm膜过滤。具体方法1、用5-10倍柱床体积的(1)液平衡柱子。2、将欲分离样品用(1)液配成10-20mg/mL的蛋白液以1-2mL/min流速将样品吸附于柱上。3、用5-10倍柱床体积的(2)液洗脱杂蛋白，流速为1-2mL/min。4、用(3)液以1-2mL/min的流速洗脱柱上与配基结合的蛋白，立即用1mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。收获的尿激酶原纯度为95％左右，回收率90％。5、免疫吸附再生用5倍体积的(3)液洗脱柱子，再用2倍体积(1)液平衡柱子，4℃保存备用。
权利要求
1.抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系，其保存号为CGMCC No.0999。
2.抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系用于纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用。
3.根据权利要求2所述的抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用，其特征在于所述制备纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用是指培养杂交瘤细胞，获得抗单链尿激酶原单克隆抗体，并与用CNBr活化的Sepharose 4B胶交联，制备用于尿激酶原纯化的亲和层析柱。
4.根据权利要求2或3所述的抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系用于制备纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用，其特征在于所述的抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系的保存号为CGMCC No.0999。
全文摘要
本发明公开了一株抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系及其应用，属于生物工程技术领域。抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系，其保存号为CGMCCNo.0999。抗尿激酶原单克隆抗体杂交瘤细胞系用于制备纯化尿激酶原的单克隆抗体的应用。本发明的优点是(1)该细胞株分泌的单克隆抗体亲和力适中、特异性强。(2)该细胞株遗传特性稳定，连续传代半年，抗体表达非常稳定。(3)用该细胞生产抗体制备了亲和层析柱纯化尿激酶原，一步纯化，尿激酶原的比例可达95％左右，回收率在90％以上，该方法纯化步骤简便，纯化效率高。
文档编号C12N5/20GK1556204SQ200410000190
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月7日 优先权日2004年1月7日
发明者高丽华, 肖成福, 胡显文, 胥照平, 张正光, 王菲, 郭智霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国人民解放军军事医学科学院生物工