一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与利用该基因检测猪眼肌面积的方法。
背景技术：
中国是养猪大国，也是猪种资源最丰富的国家，很早就开始将野猪驯化为家猪。经过长期选择，形成了许多各具特色的地方品种，仅《中国猪品种记》(张仲葛主编，中国地方猪品种志，上海科技出版社，1986)记载的就有48个。与国外的商品猪相比，中国地方品种具有许多突出的优点肉质好，产仔数高，抗逆性好和适应性强等，但却有着两个共同的缺点瘦肉率低和增重慢。因此，增加胴体瘦肉率和提高生长速度一直是我国家猪的遗传改良工作的主要目标。
产肉性状主要包括以下几个方面1)饲料转化率和日增重；2)胴体各组分的度量值，如背膘厚度、眼肌面积、胴体长、小肠长度以及各种内脏重等；3)胴体各组成的重量百分比，如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和内脂率等。
产肉性状属于数量性状，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效应。在产肉性状中，大多性状表现晚且不便活体测量，采用常规育种方法对其进行选择周期长，收效慢。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制产肉性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)，以便提高选择进展，更好地改善猪肉品质，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。
目前，通过候选基因法，已经找到了一些影响猪产肉性状的基因。位于猪12号染色体上的生长激素基因(Growth Hormon，GH)是神经分泌内生长轴中调控动物生长发育的核心基因，其产物生长激素具有调节新陈代谢、促进生长发育等作用，是与猪的生长和胴体性状相关的主要候选基因，中外学者对它的基因型与生产性状的关系进行了广泛的研究。Knorr等(Knorr C，Moser G，Muller E，Geldermann H.Associations of GH gene variants with performance traits in F2 generationsof European wild boar，Pietrain and Meishan pigs.Anim Genet，1997，28124-128.)发现梅山猪与皮特兰猪杂交的F2代群体中，不同的GH基因型与8个胴体性状显著相关。李加琪等(李加琪，陈赞谋，刘德武，刘小红，孙宝丽，凌飞，张豪，陈瑶生.IFG-1基因对长白×蓝塘猪资源群生产性能的遗传效应分析。遗传学报，2003，30(9)835-839)发现在长白×蓝塘猪构建的资源群体中类胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factor I，IGF-I)不同基因型对断奶后日增重、骨率、胴体瘦肉量和皮脂率等性状有显著影响。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.IGF2基因PCR-RFLP多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析。遗传学报，2003，30(12)1107-1112)分析了类胰岛素生长因子2(Insulin-like growth factorII，IGF-II)基因第8内含子两个NciI酶切位点的多态性在大白猪×梅山猪构成的F2代中的多态性分布情况，发现B位点B1B1基因型的个体显著比B2B2基因型的个体背膘薄18.28％(P＜0.01)，瘦肉率高8.71％(P＜0.01)。垂体转录因子(Pituitantranscription factor 1，PIT1)是生长激素、催乳素和促甲状腺素重要的调节因子，Yu等(Yu TP，Tuggle CK，Schmitz CB，Rothschild MF.Association of PIT1polymorphisms with growth and carcass traits in pigs.J Anim Sci，1995，731282-1288)曾报道PIT1与平均背膘厚存在显著相关，近年来Kuryl等(Kuryl J，Pierzchala M.Association of POU1F1/RsaI genotypes with carcass traits inpigs.J Appl Genet，2001，42309-316.)和Brunsch等(Brunsch C，SternsteinI，Reinecke P，Bieniek J.Analysis of associations of PIT1 genotypes withgrowth，meat quality and carcass composition traits in pigs.J Appl Genet，2002，4385-91)分别在不同的资源家系中检测到PIT1与数种胴体性状相关。其它与胴体性状相关的候选基因还包括生长激素释放素(GHRH)、瘦素(Leptin)、生长素(Ghrelin)、肌细胞生成素(Myogenin)、生长激素抑制素(somatostatin，SS)、黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4，MC4R)和生长素受体(growth hormonereceptor，GHR)(Xia，et al.，2003)、MSTN(Jiang YL，Li N，Plastow G，Liu ZL，Hu XX，Wu CX.Identification of three SNPs in the porcine myostatin gene(MSTN).Anim Biotechnol，2002，13173-178)等基因。位于18号染色体上的瘦素基因(Leptin)被认为是与生长、胴体性状相关的一个基因(Sasaki S，Clutter AC，PompD.Assignment of the porcine obese(leptin)gene to chromosome 18by linkageanalysis of a new PCR-based polymorphism.Mamm Genome，1996，7471-472)，但Jiang等(Jiang ZH，Gibson JP.Genetic polymorphisms in the leptin gene andtheir association with fatness in four pig breeds.Mamm Genome，1999，10191-193)的研究却没有发现明显的关联。位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成员，主要功能是调节成肌细胞分化为肌纤维。TePas等(Te Pas MF，Soumillion A，Harders FL，Verburg FJ，van den Bosch TJ，Galesloot P，Meuwissen TH.Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.JAnim Sci，1999，772352-2356.)在两个大白猪群中检测了该基因的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的MyoD基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表达水平比L-系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(Te Pas MF，Verburg FJ，Gerritsen CL，de GreefKH.Messenger ribonucleic acid expression of the MyoD gene family in muscletissue at slaughter in relation to selection for porcine growth rate.J AnimSci，2000，7869-77)。Kim等(Kim KS，Larsen N，Short T，Plastow G，RothschildMF.A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)geneis associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000，11131-135)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.猪资源家系MC4R基因扫描及其与脂肪性状的相关分析。遗传学报，2002，29(6)497-501)对大白×梅山的F2代174个体检测发现MC4R基因多态性与猪胸腰椎间膘厚(P＜0.05)、臀部膘厚(P＜0.02)、平均背膘厚(P＜0.04)、眼肌宽度(P＜0.003)、眼肌面积(P＜0.05)、皮率(P＜0.02)呈显著相关。
采用基因组扫描法，研究者们还定位了一些影响胴体性状的数量性状位点(QTL)。影响背膘厚的主基因被定位于第2和7号染色体上(de Koning DJ，JanssLL，Rattink AP，van Oers PA，de Vries BJ，Groenen MA，van der Poel JJ，etal.Detection of quantitative trait loci for backfat thickness andintramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genetics，1999，1521679-1690)。Paszek等(Paszek AA，Wilkie PJ，Flickinger GH，Miller LM，LouisCF，Rohrer GA，Alexander LJ，Beattie CW，Schook LB.Interval mapping ofcarcass and meat quality traits in a divergent swine cross.Anim Biotechnol，2001，12155-165)利用119个分子标记对116个F2个体的胴体和肉质性状进行分析后发现在猪12号染色体上存在影响胴体长、第10肋骨背膘厚、平均背膘厚、板油率、眼肌面积和肌内脂肪含量等多个性状的QTL。最近，Clop等(Clop A，Ovilo C，Perez-Enciso M，Cercos A，Tomas A，Fernandez A，Coll A，et al.Detection ofQTL affecting fatty acid composition in the pig.Mamm Genome，2003，14650-656)对伊比利亚猪与长白猪构建的F2进行基因组扫描，发现12号染色体上存在影响不饱和脂肪酸(亚麻酸)含量的QTL。Yue(Yue G，Schroffel JR，Moser G，Bartenschlager H，Reiner G，Geldermann H.Linkage and QTL mapping for Susscrofa chromosome 12.Journal of Animal Breeding and Genetics，2003，12095-102)等以野猪、梅山猪和皮特兰构成的三个F2群体为研究对象，在12号染色体上发现了数个影响13-14肋骨间的背膘厚、瘦肉切割率等性状的QTL。据统计，除了SSC16和SSC17外，猪的所有染色体上均发现了影响背膘厚的QTL(Bidanel JP，Rothschild MF.Current status of quantitative trait locus mapping in pigs.pig news and information，2002，2339N-53N)。
SDHD(Succinate Dehydrogenase Complex，Subunit D，SDHD)是线粒体复合体II(succinateubiquinone oxidoreductase)的重要组成因子，在三羧酸循环，糖代谢及氧化呼吸链的电子传递中具有重要的作用，是线粒体内膜的标志酶之一。线粒体复合体II的亚单位的突变所引发的遗传紊乱造成的影响主要包括张力减退、生长迟缓、原发性心肌症、肌肉疾病、神经疾病、器官功能障碍、新陈代谢紊乱等，在参与三羧酸循环代谢的酶类中只有线粒体复合体II的各组成因子是由核基因编码。并遵循孟德尔遗传规律。人SDHD基因位于11号染色体上。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，也采用根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
发明创造内容本发明的目的是提供一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的猪眼肌面积性状相关蛋白，名称为猪SDHD基因(SuccinateDehydrogenase Complex，Subunit D，SDHD)，来源于猪，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №3由159个氨基酸残基组成。
上述猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因，它的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由1320个碱基组成，该cDNA序列的编码序列为序列表中序列1的自5′端18位-497位碱基。
含有本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种检测猪眼肌面积的方法。
本发明所提供的检测猪眼肌面积的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一对引物对待测猪的总DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位碱基为G还是T。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位碱基，即自序列表中序列1的5′端第461位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位碱基，即自序列表中序列1的5′端第461位碱基为T时，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为GT。
其中，GG基因型个体的眼肌面积极显著地高于GT基因型和TT基因型的个体。
所述单核苷酸多态性检测可采用DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等进行检测。
实验证明，本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因可用于检测猪眼肌面积，为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，将在猪的育种中发挥重要作用。


图1a为Sfi IA和Sfi IB接头序列图1b为pBluescript II SK(-)的物理图谱图1c为猪SDHD基因的定位示意2为猪血液基因组总DNA的PCR扩增产物电泳图谱图3为PCR扩增产物的测序峰图具体实施方式
实施例1、猪SDHD的cDNA基因的获得利用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit和改造的pBluescript II SK克隆载体(pBluescript II SK的改造载体，具体为将pBluescriptII SK(-)的EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi IA和Sfi IB接头序列，利用Sfi IA和Sfi IB酶切后可定向插入cDNA片断(Sfi IA→Sfi IB)。Sfi IA和Sfi IB接头序列和pBluescript II SK(-)的物理图谱分别如图1a和图1b所示)，用猪胚胎发育第55天的骨骼肌组织的mRNA，按照常规方法构建了全长cDNA文库。通过对文库克隆子的测序获得了大量的在骨骼肌组织中表达的基因。
利用比较功能基因组学原理和方法，利用BLAST在NCBI的数据库中进行比对发现了其中测序结果中的一条序列与人SDHD基因具有88％的同源性，将其命名为猪SDHD基因，它具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，其编码序列表中序列3的氨基酸序列。
通过比较猪，小鼠和人SDHD基因cDNA序列的同源性，根据猪cDNA序列设计猪特异的引物PrimerL5′-ATTGGACAAGTCGTTACTGA-3′PrimerR5′-CAACTCTCTAGGTATTAGCT-3′。
以RH克隆板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，ImpRH)中的猪×仓鼠杂种体细胞的DNA(购自法国农业科学院，Laboratoire de GénétiqueCellulaire，INRA)为模板进行PCR扩增。扩增条件为95℃变性3min，94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环。最后在72℃延伸3min。其中的反应体系组成如表1所示。
表1.PCR的反应体系

扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型。其中，阳性结果的为1，阴性结果的为0。结果为0000100100010001000000000010000000001011100000000110000010010010000010001000010011110000110011001010000001110000010010，将该结果提交到IMpRH数据统计分析服务器(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.html/)上进行分析，得到如表2的结果表2. PCR扩增片段分型的分析结果

比较作图分析结果表明人SDHD基因位于Hsap11号染色体上，该染色体与猪Sscr9号染色体有大区段的同源片段(图1c)。
实施例2、猪SDHD的部分DNA序列的单核苷酸多态性的检测1、引物设计用猪SDHD基因的全长cDNA(序列1)为信息探针，获得猪SDHD基因的UniGene编号Ssc.2586。利用DNAStar分析工具分析在该基因的外显子区域中的突变位点。根据猪全长cDNA序列以及分析获得的突变位点信息设计扩增引物。序列如下正向引物5’-GGGGCATTGGACAAGTCG-3’(序列表中的SEQ ID №4)反向引物5’-GAGCAGAGGCAAGGAGGT-3’(序列表中的SEQ ID №5)2、PCR扩增及其产物的纯化、克隆和测序分别以纯繁通城猪62头、纯繁长白猪22头、长白♂×(大白×通城)♀24头和大白♂×(长白×通城)♀21头三元杂交组合猪的猪血液基因组的总DNA为模板进行PCR扩增。其中，反应体系ddH2O(19.25μl)，10×Buffer(含Mg2+)(2.5μl)，10mM正向引物(0.75μl)，10mM反向引物(0.75μl)，10mMdNTP(0.5μl)，Taq聚合酶5U/ul(0.25μl)，总DNA(1μl)。反应体系共为25μl。反应程序采用降落PCR程序(总循环数为34)①95℃变性3分钟；②以退火温度66℃进行三个循环的扩增(94℃变性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸10秒)；③以退火温度64℃进行三个循环的扩增(94℃变性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸10秒)；④以退火温度60℃进行28个循环的扩增(94℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸10秒)；⑤72℃下延伸3分钟。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，表明获得的PCR产物大小约为200bp左右。图2中，Marker为DNA分子量标记(100-1000bp ladder)；2-3泳道为通城猪，4-5泳道为长白猪，6泳道为杜洛克猪血液基因组的总DNA的PCR扩增产物。然后按照如下方法进行PCR产物的纯化、克隆和测序(1)PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml树脂(Resin)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过微柱(Minicolumn)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl无菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
(2)连接反应将纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×缓冲液，0.5μl的T载体，1.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4DNA连接酶，置16℃水浴过夜。
(3)感受态细胞的制备从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的摇瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将摇瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(5)质粒的小量制备挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃ 300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III(5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
(6)重组质粒的酶切鉴定取3μl质粒DNA与双蒸水混匀，使其总体积为10μl，加入5U限制性内酶EcoRI及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，得到酶切结果与预计完全相同的目的重组质粒。
(7)测序重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明该PCR产物的长度为220bp，自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位碱基，即自序列表中序列2的5′端第461位碱基处存在T、G两个等位基因(图3)。图3中，箭头所指的是多态位点。
实施例3、检测猪眼肌面积以61头纯繁通城猪、22头纯繁长白猪、24头长白♂×(大白×通城)♀和21头大白♂×(长白×通城)♀三元杂交组合猪，共128个个体为实验对象进行性状关联分析，具体方法如下1、按照实施例2中步骤2的方法，分别以上述129头猪的猪血液基因组的总DNA为模板，在引物5’-GGGGCATTGGACAAGTCG-3’(正向)(序列表中的SEQ ID №5)和5’-GAGCAGAGGCAAGGAGGT-3’(反向)(序列表中的SEQ ID №6)的引导下进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。如测序结果表明自序列表中SEQ ID NO3的5′端第131位碱基，即自序列表中序列2的5′端第461位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQ ID NO3的5′端第131位碱基，即自序列表中序列2的5′端第461位碱基为T时，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为GT。
2、用如下最小二乘模型分析胴体性状(屠宰体重，胴体重，屠宰率，瘦肉重，脂肪重，骨重，平均膘厚，眼肌面积)和肉质性状(肌间脂肪含量，pH值，失水率，大理石纹评分，肉色，滴水损失)yij＝μ+GENOTYPEi+GROUPj+GENOTYPEi×GROUPj+εij，其中，yij是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，GROUPj为不同杂交组合的效应，GENOTYPEi×GROUPj为这两者的互作效应，εij为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
结果表明在所检测的群体中，GG基因型的个体有11头，GT基因型的个体有43头，TT基因型的个体有74头。不同基因型之间的性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)如表3，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。表3表明，在眼肌面积中，具有GG基因型的个体眼肌面积比GT和TT基因型个体大，并且达到极显著水平(P＜0.01)；在具有相关趋势的大理石纹中，GT基因型个体比TT基因型个体评分显著(P＜0.05)。而且进一步发现眼肌面积与大理石纹评分呈一定的正相关关系。
表3.猪SDHD基因461位点不同基因型与眼肌面积性状的关联分析

**表示在0.01水平上差异极显著。
序列表<160>5<210>1<211>1320<212>DNA<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)<220>
<221>misc-feature<222>(461)<223>n＝t或g<400>1gagccttcag gaaagacatg gcgactctct ggaggctcag tgttctttgc ggtgcccgag 60gaggaggagc tctggtcctc cggacctcag tggtcagacc tgctcatgtc tcagcatttc120tccaggaccg acataccccg ggatggtgtg gagtacagca cattcacctg tcacccagcc180accaggctag ttccaaggct gcatctctcc actggactgg tgagagggtt gtcagtgttt240tgctcctggg cctacttcca gccgcttatt tgaatccttg ttctgcgatg gactactccc300tggccgcagc cctcactctc catggtcact ggggcattgg acaagtcgtt actgactacg360tgcgagggga tgcactgcag aaagctgcca aggcaggcct tttggcgctc tcggctttca420cctttgctgg gctttgttat ttcaactatc atgatgtggg natctgcaaa gctgttgcca480tgttgtggaa gctctgagct tttagagcta ataccttgag agttgattgt acacctcctt540gcctctgctc tgtcatgcca ttcagctcac agtaagaagg aaataataga taagtccatt600ggtgagacaa acctcttctc ctaatcagtg ggttattttt ggaatttaat ctttgaggaa660agatttgaga ggaatcgtat ccaagaaatt gtgagactga gctctcacaa gactcagtgt720ctctcagctt ttcacgagac tcggtgtaac taagcattac atatgagctt ttgccttttc780atttatcaga cttttaaagg gaattcagct ttattactct cagtatctgc tcacacttct840gtatttgtcc taggatgatg gagaaaggga aagaccatta attcctaagg aaagactttg900tggaagagta ggcagtgttt cgtttttaca gacttcccct ctctgttcag ttgataccag960ttactgatgg ttacatgtcc tggggaaatc agaaaattag aaatgctgat atttcatatt 1020actcatttct aaatcccagg aagaggagcc tggagagttt ctgaataaag agaagttcca 1080tgtagggaag aggtcccatt atagatgttt caagttgtta cagattctaa actgagactt 1140aatcttcaca tgcgtttatt ttacttgttg aaaataatct gtccccaaat ataaaattat 1200
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权利要求
1.猪眼肌面积性状相关蛋白，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
2.猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的多核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述cDNA序列的编码序列为序列表中序列1的自5′端18-497位碱基。
5.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的载体。
6.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的细胞系。
7.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的宿主菌。
8.一种检测猪眼肌面积的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一对引物对待测猪的总DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO2的5′端第131位碱基为G还是T。
全文摘要
本发明公开了一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用，目的是提供一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与利用该基因检测猪眼肌面积的方法。本发明所提供的猪眼肌面积性状相关蛋白，具有序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过1－10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因将在猪的育种中发挥重要作用。
文档编号C12N5/10GK1737138SQ20041005692
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月20日 优先权日2004年8月20日
发明者朱正茂, 赵书红, 李奎 申请人:李奎, 赵书红