非聚合型儿茶素类组合物的制造方法

专利名称：非聚合型儿茶素类组合物的制造方法
技术领域：
本发明涉及在不损害用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物所含的非聚合型儿茶素类组分的情况下，降低了咖啡因量并经过高度精制处理的非聚合型儿茶素类组合物的制造方法。
背景技术：
已知儿茶素具有阻碍α-淀粉酶活性等的作用(专利文献1日本特开平3-133928号公报)。为了达到该生理效果，成人每天需饮用4～5杯茶，所以为了更方便地摄取大量儿茶素，期待一种在饮料中高浓度配合儿茶素类的技术。
作为该方法之一，是利用绿茶提取物的浓缩物等水溶性组合物，将儿茶素在溶解状态下添加到饮料中的方法。但是己知，根据作为高浓度配合儿茶素对象的饮料种类，在例如向红茶提取液、碳酸饮料添加儿茶素时，咖啡因及来自绿茶的风味的残存极大损害了饮料的商品价值。
至此，为解决该课题，采用添加精制成高纯度非聚合型儿茶素类组合物的方法，但现有精制法均未对水溶性组合物精制前后非聚合型儿茶素类组分的维持进行考虑，存在着用精制前的水溶性组合物所验证的生理效果因精制而组分变化后不能被保证的重大问题。另外在使用三氯甲烷降低咖啡因的处理方法中，由于很难从所得非聚合型儿茶素类组合物中完全除去溶剂，所以不能用于配制饮料。
特别是有关维持组分的课题在日本厚生劳动省许可食品之一的保健功能食品方面很迫切，但由于因精制导致的有效成分的组分变化需要验证新的生理效果，所以只是分离精制有效成分之类的现有技术，不能适用于重视速度的保健功能食品的商品开发。
在这样的背景下，在现有的精制法中，人们对先用吸附剂吸附用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物，然后用溶剂等洗提回收的技术方案进行了多次尝试(专利文献2～7)。专利文献2(特开平1-175978号公报)是用羟丙基葡聚糖凝胶或亲水性乙烯基聚合物凝胶精制的方法，由于用于洗提的有机溶剂的浓度通常高达20％以上，所以有精制后的咖啡因量增多的问题。而专利文献3(特开平2-311474号公报)是用苯乙烯-二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯精制的方法，为使用于洗提的有机溶剂的最终浓度达到60％左右，需要在柱处理后另用三氯甲烷处理，以实施去咖啡因处理。同样，由于专利文献4(特开平10-67771号公报)、5(特开平4-182479号公报)、6(特开平6-9607号公报)中也使用30％以上、40％以上或50％以上浓度的有机溶剂，故达成同样的精制状态。
另一方面，人们很早就知道对红茶等发酵茶提取液进行鞣酸酶处理，可抑制低温冷却时的悬浊，即抑制形成茶乳状。另外，通过对没食子酸酯体儿茶素进行鞣酸酶处理，使部分或全部形成没食子酸，得到儿茶素类与没食子酸的混合物的方法(专利文献7特开2003-33157号公报)能减低成为苦味原因的没食子酸酯体儿茶素类。但由于副产物没食子酸会产生酸味、涩味，所以也未必是有效的方法。
另外，用锅炒茶叶制造的非聚合型儿茶素类组合物要在比用蒸茶叶制造的非聚合型儿茶素类组合物更高的高温下加热，难以除去产生的烟臭。在洗提非聚合型儿茶素类组合物时，要完全除去加热茶氨酸等而产生的吡嗪类、吡咯类等(非专利文献1蔬菜、茶叶试验场研究报告B(茶叶)425～91(1991))所发出的烟香很困难。特别是在锅炒茶叶等杀青(去生味)时温度高(350℃)的制造方法中，有时会产生很多点火时生成的氨基酸类与糖类的美拉德反应物质、氨基酸类与聚合体儿茶素类组合物的变褐物质等，有时会使所得非聚合型儿茶素类组合物着色，产生风味上不惹人喜爱的变褐臭的情况(非专利文献2蔬菜、茶叶试验场研究报告B(金谷)145～53(1987))。

发明内容
本发明提供一种非聚合型儿茶素类组合物的制造方法及所得非聚合型儿茶素类组合物，该方法是将用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物，以相对于合成吸附剂0.5～20[v/v]倍的溶液量，添加到填充有合成吸附剂的柱内，使水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类吸附，以相对合成吸附剂1～10[v/v]倍的水进行洗净，再以相对于合成吸附剂的填充体积量0.5～20[v/v]倍量的10～95vol％乙醇水溶液进行洗提的方法。
具体实施例方式
本发明人在研究了无损于非聚合型儿茶素类精制处理前的组分、并应能减少咖啡因量的用水从绿茶叶提取的水溶性组合物后，结果发现在用特定的合成吸附剂吸附、解吸非聚合型儿茶素类的工序中，通过控制所用乙醇水溶液的乙醇浓度，能以高收率得到与现有技术相比咖啡因含量低、处理前后的组分变化小、减弱了绿茶风味的非聚合型儿茶素类组合物。还发现对用水从绿茶叶提取的水溶性组合物进行鞣酸酶处理后，能以高收率得到非聚合型儿茶素没食子酸酯率降低、非聚合型没食子儿茶素率的浓度增加、咖啡因含量降低、副产物没食子酸降低的非聚合型儿茶素类组合物。还发现对用水从锅炒绿茶叶提取的水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类进行精制处理的结果是，通过追加添加水溶性酸性物质调整液体酸性的工序，能以高收率得到色泽和风味进一步改善、且组分无变化的非聚合型儿茶素类组合物。还发现，通过在合成吸附剂上吸附、解吸非聚合型儿茶素类的工序中，用两级控制所用乙醇水溶液的乙醇浓度进行解吸，也能以高收率得到与现有技术相比咖啡因含量低、处理前后的组分变化小、减弱了绿茶风味的非聚合型儿茶素类组合物。
根据本发明，能以高收率得到与现有技术相比咖啡因含量低、处理前后的组分变化小、减弱了绿茶风味的非聚合型儿茶素类组合物。且在对水溶性组合物预先实施了鞣酸酶处理时，能以高纯度得到副产物没食子酸得到大幅降低的非聚合型儿茶素类组合物。另外，在使用锅炒绿茶叶时，因锅炒香减弱，从而改善了风味与色泽，得到高纯度非聚合型儿茶素类组合物。并且，以两级梯度方式用乙醇水溶液解吸，可更高效地洗提和精制非聚合型儿茶素类。
在本发明的非聚合型儿茶素类是儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯等非表体儿茶素，与表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等表体儿茶素的总称。
本发明中的非聚合型儿茶素没食子酸酯体是儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等的总称。而非聚合型儿茶素没食子体是没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等的总称。
本发明所用的绿茶叶可举出由C.sinensis、C.assamica等山茶属(Camellia)及薮北种，或其杂交种等得到的茶叶经制茶工艺而得的茶叶。经该经制茶工艺而得的茶叶只要是非发酵茶就可利用。例如可举出普通煎茶、深蒸煎茶、玉露、冠茶、玉绿茶、番茶等。且优选使用原料易筹办的蒸制茶叶，还优选使用实施了鞣酸酶处理的绿茶叶、锅炒绿茶叶。
本发明所用的水溶性组合物，按照通常的绿茶提取条件制造。为提高非聚合型儿茶素类的提取效率，从绿茶叶提取时的温度采用70℃～沸腾水，更优选为80℃～沸腾水。从绿茶叶提取时的水量优选为相对于绿茶叶为5～60重量倍，特别优选为5～40重量倍。由绿茶叶进行提取的时间优选为1～60分、更优选为1～40分、进一步优选为1～30分。提取时间太短，非聚合型儿茶素类的洗提会不充分，若提取时间太长，会发生非聚合型儿茶素类的热变性异构化反应。
也可将特开昭59-219384号公报、特开平4-20589号公报、特开平5-260907号公报、特开平5-306279号公报、发明2002-114355、发明2002-020415等详细举例的方法调制的绿茶提取物的浓缩品代替用于本发明的用水从绿茶叶提取的水溶性组合物，作为水溶性组合物使用。市售品可举出三井农林(株)制POLYPHENONTM、伊藤园(株)制TEAFURANTM、太阳化学(株)制SUNPHENONTM等。另外，还可使用柱精制品及化学合成品。本发明的茶提取物的浓缩物的形态可举出固体、水溶液、浆状等各种形态，在本发明处理中，事先调整为水溶液的状态。
本发明所用的水溶性组合物Brix糖度为2～25、尤其是2～10，特别是2～5的范围时，因为能提高非聚合型儿茶素类的回收率，还能改善去咖啡因的效率，故为优选。本发明中，在使用上述绿茶提取物的浓缩物时，其Brix糖度优选为10～25，更优选为15～25。
由于将用水从绿茶叶提取的水溶性组合物经鞣酸酶处理后使用可使非聚合型儿茶素没食子酸酯率降低，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子率浓度增加，副产物没食子酸大幅度降低而为优选。鞣酸酶处理，即酶促反应优选用特开2003-33157所述的单宁酰基水化酶EC3.1.1.20等实施。市售品可举出商品名鞣酸酶Kikkoman(株)制及鞣酸酶[三共]三共(株)制等。
本发明所用的鞣酸酶优选使用一般市售的具有500～5000U/g酶活性的鞣酸酶，这是因为小于500U/g时，得不到充分的活性，而高于5000U/g时，酶促反应速度过快，反应系统难以控制。
鞣酸酶处理的具体方法优选为添加鞣酸酶使其相对于水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类在0.5～10重量％的范围。为使包括酶失活工序在内的鞣酸酶处理在最佳酶促反应时间的2小时以内结束，鞣酸酶的浓度优选为0.5～5重量％，更优选为2～4重量％。浓度小于0.5重量％时，酶活性弱，降低非聚合型儿茶素没食子酸酯率的效果也弱，而当浓度超过10重量％时，酶活性过强，所以难以在最优非聚合型儿茶素没食子酸酯率下停止酶促反应。
鞣酸酶处理的温度优选为可得到最佳酶活性的15～40℃，更优选为20～30℃。
在结束鞣酸酶反应时，需要使酶失活。失活的条件是，在水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类不发生非差向立体异构化的温度80～90℃左右下进行数十秒以上。酶失活的温度优选为70～90℃，在70℃以下时，由于酶难于充分失活而导致反应进行，就不能在预定的非聚合型儿茶素没食子酸酯率范围内停止酶促反应。而在达到预定失活温度后保持10秒左右以下的时间时，因酶难于充分失活，导致酶促反应进行，而进行20分钟以上时，又会发生非聚合型儿茶素类的非差向立体异构化，也不选用。
酶促反应的失活方法，可通过用间歇式或板式热交换机等连续式进行加热来停止。另外，在鞣酸酶处理的失活结束后，通过离心分离等操作可净化水溶性组合物。
另外，使用将绿茶叶锅炒处理后再用水提取的水溶性组合物时，由于与现有的通过锅炒绿茶叶制造的非聚合型儿茶素类组合物相比锅炒香减弱，风味和色泽均得到改善而为优选。所用的锅炒绿茶叶可使用在300℃以上炒制的茶叶。主要可举出中国制造的绿茶，但在本发明中不限定产地，也可使用日本产锅炒茶。
在使用了锅炒绿茶叶的水溶性组合物中，添加0.001～1.0重量％的水溶性酸性物质将pH值降至2.0～5.5时，添加水溶性酸性物质的时期只要在提取后，可在任一工序期间，在向本发明的合成吸附剂通入提取液的前后的任一时期添加均能改善色泽。
所用水溶性酸性物质的添加量优选为相对于由茶提取液得到的水溶性组合物添加0.001～1.0重量％。在0.001重量％以下时，由于酸性不能上升，色泽改善不充分，在1.0重量％以上时，所得非聚合型儿茶素类组合物中残留有酸味，风味不佳。此时的pH值在从5.5附近至添加1.0重量％时的pH值2.0的范围。
所用水溶性酸性物质优选为可用作食品添加剂的物质。更优选为水溶性的具有使由茶提取液得到的水溶性组合物酸性增加、降低pH的效果的物质。具体可举出柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、苹果酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡糖酸、琥珀酸、磷酸或从天然成分提取的果汁等，也可将其中的2种以上并用。考虑到饮料风味，特别优选柠檬酸和抗坏血酸。
由于能使聚合儿茶素类的色泽由红色变成黄色，所以所用水溶性酸性物质具有可减轻本发明所得非聚合型儿茶素类中所含聚合儿茶素类着色的效果。且由于发明人推定氨基酸类与糖类的美拉德反应物质、氨基酸类与聚合体儿茶素类组合物的变褐物质等的电点在弱酸性～中性附近，故发现能通过添加酸性物质降低pH，削弱着色物质对合成吸附剂的保持力，从而在吸附和水洗时既保持非聚合儿茶素类又能除去着色物质。
本发明的非聚合型儿茶素类组合物可通过将该水溶性组合物，以相对于合成吸附剂0.5～20[v/v]倍的溶液量，添加到填充有合成吸附剂的柱内，使水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类吸附，以相对合成吸附剂1～10[v/v]倍的水进行洗净，然后以相对于合成吸附剂的填充体积量0.5～20[v/v]倍量的10～95vol％乙醇水溶液进行洗提而制造。
本发明所用的合成吸附剂可以举出苯乙烯-二乙烯基苯，改性苯乙烯-二乙烯基苯或以甲基丙烯酸甲酯为基体的合成吸附剂。苯乙烯-二乙烯基苯系合成吸附剂例可以举出三菱化学社制商品名DIAION HP-20、HP-21，Sepabeads SP70、SP700、SP825、SP-825和Organo社(供应商美国Rohm and Haas公司)的Amberlite树脂XAD4、XAD16HP、XAD1180、XAD2000，住友化学(供应商美国Rohm and Haas公司)的Duolight树脂S874、S876等。亲核取代溴原子增强吸附力的改性苯乙烯-二乙烯基苯系合成吸附剂例可举出三菱化学社制商品名Sepabeads SP205、SP206、SP207等。甲基丙烯酸甲酯系合成吸附剂例可举出三菱化学社制Sepabeads HP1MG、HP2MG，Organo社XAD7HP、住友化学的Duolight树脂S877等。
在合成吸附剂中，特别优选改性聚苯乙烯系合成吸附剂和甲基丙烯酸甲酯系合成吸附剂。前者比聚苯乙烯系合成吸附剂的吸附容量高，而由于比重高，在精制工艺中能向上通液，故为优选。而后者虽然吸附量少，但具备有利于高极性有机物吸附的优点。
本发明所用的合成吸附剂具体可举出SP207等改性聚苯乙烯系合成吸附剂(三菱化学社制)、HP2MG等甲基丙烯酸酯系合成吸附剂(三菱化学社制)，因上述理由优选为SP207、HP2MG，更优选为SP207。
在本发明中，向填充了合成吸附剂的柱中通入水溶性组合物，优选预先以SV(空间速度)＝1～10[h-1]、优选1～5[h-1]的速度，相对合成吸附剂以2～10[v/v]、优选2～5[v/v]通液倍数的通液条件用95vol％乙醇水溶液洗净，除去合成吸附剂的原料单体和原料单体中的杂质等。然后利用以SV＝1～10[h-1]、优选1～5[h-1]的速度，相对合成吸附剂以1～10[v/v]、优选[1～5v/v]、特别优选1～4[v/v]通液倍数的通液条件进行水洗，除去乙醇，将含合成吸附剂的液体置换为水系的方法提高非聚合型儿茶素类的吸附能力。
将水溶性组合物通入填充了合成吸附剂的柱的条件，更优选为相对合成吸附剂以0.5～20[v/v]的通液倍数，SV(空间速度)＝0.5～10[h-1]的通液速度通液。优选为空间速度为SV(空间速度)＝0.5～10[h-1]、更优选为0.5～10[h-1]、进一步优选为0.5～5的通液倍数，相对合成吸附剂为0.5～10[v/v]的通液倍数通液。特别优选为以SV＝1～5[h-1]的通液速度，相对合成吸附剂1～8[v/v]的通液倍数通液。
在使用经过鞣酸酶处理的水溶性组合物时，向填充了合成吸附剂的柱中通液的条件是，优选以SV(空间速度)＝0.5～10[h-1]的通液速度，相对合成吸附剂为0.5～20[v/v]的通液倍数通液。用10[h-1]以上的通液速度和20[v/v]以上的通液量有时非聚合型儿茶素类的吸附会不充分。
此时，以SV＝0.5～10[h-1]的通液速度，相对合成吸附剂为1～10[v/v]的通液倍数，除去附着在合成吸附剂上的没食子酸和杂质等。用10[h-1]以上的通液速度、10[v/v]以上的水洗量用水洗净时，会有非聚合型儿茶素类溶出，用1[v/v]以下的水洗量时，没食子酸除去不充分。
在使用经过锅炒处理的绿茶叶的水溶性组合物时，在以相对合成吸附剂通液倍数为1～10[v/v]的水洗净。通过该洗净提高色泽改善效果，非聚合型儿茶素类几乎不溶出。
考虑到可高效洗提及精制非聚合型儿茶素类，优选将水溶性组合物在柱上吸附、水洗后，以每合成吸附剂的填充体积量为0.5～20倍的量通入10～95vol％的乙醇水溶液的条件用乙醇水溶液洗提。因为能降低咖啡因与非聚合型儿茶素类的比率，优选以10～50vol％的乙醇水溶液浓度进行洗提，特别优选为10～30vol％。
在本发明中，在用低于10vol％的乙醇水溶液洗提时，尽管咖啡因与非聚合型儿茶素类的比率降低，但相对合成吸附剂的通液倍数超过20倍，需要大量洗提液，且非聚合型儿茶素类的回收率降低。而在用95vol％以上的乙醇水溶液洗提时，咖啡因与非聚合型儿茶素类的分离恶化，回收乙醇时的蒸馏操作变得复杂。
另外，由于能更高效地洗提和精制非聚合型儿茶素类，用乙醇水溶液对通柱吸附后的水溶性组合物解吸的条件优选采用首先以每合成吸附剂的填充体积为0.5～10倍的量通入10～14(v/v)％乙醇水溶液，再以每合成吸附剂的填充体积为0.5～10倍的量通入15～19(v/v)％乙醇水溶液液的两级梯度法。另外，在用该浓度范围的乙醇水溶液洗提时，无需大量洗提液，且非聚合型儿茶素类的回收率提高，咖啡因与非聚合型儿茶素类的分离不会恶化。
本发明所用的合成吸附剂可在精制处理后通过预定方法再利用。具体是通入氢氧化钠等碱水溶液，进行洗净，使合成吸附剂上残存的水溶液成分全部解吸。另外，还可通入90～99.5vol％的乙醇水溶液，使吸附剂上残存的以咖啡因为主成分的水溶液组合物成分全部解吸。
这样就能以高收率得到咖啡因含量比以往低、处理前后的组分变化小、绿茶风味减轻的非聚合型儿茶素类组合物。
在使用经过鞣酸酶处理的水溶性组合物时，用本发明的制造方法得到的非聚合型儿茶素类组合物，(A)从水溶性组合物回收的非聚合型儿茶素类的回收率为70重量％以上；(B)非聚合型儿茶素类中的没食子酸酯率的浓度降低达10重量％以上；(A)非聚合型儿茶素类中的没食子率的浓度增加1重量％以上。咖啡因与非聚合型儿茶素类的重量比小于1/10。而由本发明得到的从合成吸附剂洗提的非聚合型儿茶素类组合物中的没食子酸与由鞣酸酶处理产生的没食子酸之比低于1/10，能大幅度降低带来酸味、鸡蛋味等不佳风味的没食子酸。
在使用经过锅炒处理的绿茶叶的水溶性组合物时，用本发明的制造方法得到的非聚合型儿茶素类组合物，(D)咖啡因/非聚合型儿茶素类(重量比)之比低于1/10，(E)用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子酸酯体类比率为1时，儿茶素没食子酸酯体类比率为0.85～1.20，(F)用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子体类比率为1时，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子体类比率为0.85～1.15，咖啡因降低，非聚合型儿茶素类的组分变化小。另外，所得非聚合型儿茶素类组合物，将非聚合型儿茶素类浓度调整至0.175％[w/v]而成的水溶液的色泽L值(亮度)为90～小于100，b值(黄色)为0～20，450nm的吸光度为0～0.2，色泽良好。
按两级梯度方式用乙醇水溶液从填充了合成吸附剂的柱解吸，所得非聚合型儿茶素类组合物的(G)咖啡因/非聚合型儿茶素类(重量比)之比小于0.04，咖啡因含量低。而根据本发明的方法，从水溶性组合物回收(H)非聚合型儿茶素类的回收率为75重量％以上，(I)非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯体类比率的浓度变化小于20％，(J)非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子体类比率的浓度变化小于15％，处理前后的组分变化极小。
由本发明得到的非聚合型儿茶素类组合物可直接使用。也可用减压浓缩、薄膜浓缩等方法除去乙醇。配合到通常饮料时，优选完全除去乙醇。当希望非聚合型儿茶素类组合物的产品形态为粉体时，可通过喷雾干燥、冻结干燥等方法制成粉体。
由本发明得到的非聚合型儿茶素类组合物可配合到容器装饮料中。所用容器与一般饮料相同，可使用以聚对苯二甲酸乙二醇酯为主要成分的成型容器(即PET瓶)、金属罐、与金属箔或塑料薄膜复合的纸容器、瓶等通常形态。本发明的容器装饮料是指不经稀释可饮用的饮料。
而上述容器装饮料是在例如填充到金属罐之类的容器中后，在能加热杀菌的情况下按食品卫生法规定的杀菌条件制造。而对PET瓶、纸容器等不能蒸馏杀菌的容器，采用的是首先在与上述条件同等的杀菌条件下，例如用板式热交换器等高温短时间杀菌后，冷却到一定温度，再填充到容器中的方法等。另外，也可在无菌条件下配合其它成分，填充到填充容器中。
实施例儿茶素类、咖啡因及没食子酸的测定用过滤器(0.45或0.8μm)过滤试料溶液，接着将被蒸馏水稀释了的容器装饮料使用岛津制作所社制高速液相色谱仪(型号SCL-10AVP)，安装十八烷基导入液相色谱用充填柱L-Column TM ODS(4.6mmΦ×250mm财团法人化学物质评价研究机构制)，在柱温35℃下，使用梯度法测定儿茶素。在移动相A液采用含0.1mol/L乙酸的蒸馏水溶液、B液采用含0.1mol/L乙酸的乙腈溶液、试样注入量为20μL、UV检测器波长为280nm的条件下进行测定。
鞣酸酶活性的测定法试剂ApH5.5柠檬酸缓冲溶液50mmol在800mL蒸馏水中溶解10.5g柠檬酸，用1N的NaOH溶液调整到pH5.5，稀释至1000mL。
试剂B0.35重量％基质水溶液(单宁酸)在50mL柠檬酸缓冲溶液(试剂A)中溶解175mg单宁酸。
试剂C90vol％乙醇溶液测定方法
1.在试验管中采取基质溶液(试剂B)1.0mL，30℃保持5分钟。
2.添加试料溶液0.25mL，在30℃下培养15分钟。空白溶液代替试料溶液，添加柠檬酸缓冲溶液(试剂A)。
3.为了停止酶促反应，向试料溶液与空白溶液中添加5.0mL乙醇溶液(试剂C)。
4.测定310nm的吸光度[试料As、空白A0]。
根据下述算式计算活性。
每体积的活性(U/mL)＝(As-A0)×20.3×1.0(mL)×1.04×df/(0.71×0.25(mL)×15(min))＝ΔA×7.93×df每重量的活性(U/g)＝(U/mL)×1/C20.3基质溶液(试剂B)的1.0mL中含单宁酸的mmol。
0.71分析条件下的20.3μmol的单宁酸完全水解后的吸光量的变化量，1.04换算系数，df稀释系数，C试样(g/mL)中的鞣酸酶浓度。
色泽的测定法将各实施例所得非聚合型儿茶素类组合物用无离子水稀释，使其儿茶素含有率为0.175％[w/v]，用色差计(color Meter ZE2000、NIPPONDENSHOKU社制)测定了L值(亮度)和b值(黄色)。另外，使用UV-VIS分光计(UV MINI1240)测定了450nm的吸光度(OD450)。
Brix的测定法使用由离子交换水调节0点的Brix糖度计(RX-5000α(ATAGO社制))对测定试料进行了测定。
杀菌后的风味评价将各实施例所得非聚合型儿茶素类组合物用无离子水稀释，使其儿茶素含有率为0.175％[w/v]，将其中的40mL加入50mL耐压制玻璃容器。向其中添加0.1重量％的L-抗坏血酸钠，用5％碳酸氢钠水溶液调节pH值为6.4，进行氮置换，用高压釜在121℃下加热10分钟杀菌。然后，由5名评判专家确认是否感觉到来自绿茶的异味、异臭。
沉淀的评价方法将加入耐压制玻璃容器中的评价试料置入55℃的恒温槽，确认了发生混浊的状况。在照明装置下观察内容物状态，以观察到沉淀的时间为沉淀生成日。
实施例1本发明1将由蒸制法制造的绿茶1200g用95℃的24000g无离子水进行10分钟的提取、冷却、榨汁后，用金属丝网过滤，得到pH5.57的提取液18810g。提取液中的非聚合型儿茶素类的浓度是711.9mg/100mL，含133.9g非聚合型儿茶素类，没食子酸酯率为70.2％，没食子率为70.0％。另外，咖啡因浓度是88.3mg/100mL，含16.6g的咖啡因，咖啡因/非聚合型儿茶素类之比是0.124(—)。没食子酸浓度是0.47mg/100mL，含0.89g没食子酸。
将所有得到的水溶性组合物投入不锈钢容器，在21℃、150rpm的搅拌条件下添加在离子交换水16g中溶有4.0g(相对非聚合型儿茶素类3.0％)Kikkoman鞣酸酶KTFH(工业级，500U/g以上)的溶液，40分钟后在pH下降到4.98时结束酶促反应。再以1.2L/min的速度向浸渍在95℃的热水浴中的SUS制Holding tube通入液体，将回收液保持在90℃下10分钟，使酶完全失活后，冷却至25℃，离心分离后挤水，得到22160g鞣酸酶处理液。
经鞣酸酶处理后所得的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类为127.1g，没食子酸酯率为60.6％，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子率为71.2％，酶促反应导致的非聚合型儿茶素类的降低非常少，却使没食子酸酯率大幅降低。5小时后再测定时，上述数值几乎未变，可确认酶已完全失活。而咖啡因量还是16.0g，几乎未变，没食子酸增加到8.1g。
再将填充在不锈钢柱(内径72.3mm×高度1600mm，容积5745mL)的合成吸附剂Sepabeads SP-207(三菱化学(株)制)5192mL，预先用SV＝6.9[h-1]的95％(v/v)乙醇25960mL洗净，接着用SV＝6.9[h-1]的25960mL的水洗净。然后，以SV＝4.6[h-1]通入所有所得鞣酸酶处理液(相对合成吸附剂4.3倍的容积)，废弃通过液。在通过液中，含非聚合型儿茶素类0.7g，没食子酸4.8g，几乎所有的非聚合型儿茶素类都被合成吸附剂吸附。
接着以SV＝6.9[h-1]用20760mL(相对合成吸附剂4倍的容积)的水洗净。洗净液中，含非聚合型儿茶素类0.7g，没食子酸3.1g，几乎没有非聚合型儿茶素类的溶出。
水洗后，以SV＝4.6[h-1]通入20％(v/v)乙醇水25960mL(相对合成吸附剂5倍容积)。将柱内的残留水3000mL彻底去除后，回收洗提液22158g，减压浓缩除去乙醇后，进行喷雾干燥，得到非聚合型儿茶素类组合物粉体140.9g。该粉体中含非聚合型儿茶素类98.6g，从提取液中回收非聚合型儿茶素类的回收率为73.6％，非聚合型儿茶素类组合物的没食子酸酯率为51.2％，非聚合型儿茶素类中的没食子率为76.9％。另外，咖啡因量是3.79g，咖啡因/非聚合型儿茶素类之比为0.038(—)。没食子酸量是0.14g。
本发明2除了鞣酸酶处理进行30分钟后结束，用40％(v/v)乙醇水6490mL(相对合成吸附剂1.25倍的容积)洗提之外，其它操作与本发明1完全一样。
本发明3除了用95％(v/v)乙醇水15576mL(相对合成吸附剂3倍的容积)洗提以外，其它操作与本发明1完全一样。
本发明4除了合成吸附剂使用Sepabeads SP-70(三菱化学(株)制)以外，其它操作与本发明1完全一样。
比较例1与本发明1同样进行鞣酸酶处理，不进行向合成吸附剂通入液体和洗提。
比较例2除用通入5％(v/v)乙醇水103840mL(对合成吸附剂20倍的容积)代替本发明1的通入20％(v/v)乙醇水之外，其它操作完全相同。
表1所示为分析及评价结果。
表1


*1(鞣酸酶处理后的含量/从合成吸附剂溶出后的含量)×100*2鞣酸酶处理后的含有率—从合成吸附剂溶出后的含有率*3从合成吸附剂溶出后的含有率—提取液的含有率提取液的分析值非聚合型儿茶素类含量133.9g，咖啡因含量16.6g，咖啡因/非聚合型儿茶素类的比率0.124，没食子酸含量0.89g，非聚合型儿茶素没食子酸酯率70.2％，非聚合型没食子儿茶素率70.0％。
本发明1～4均可得到处理前后非聚合型儿茶素类的回收率高、非聚合型儿茶素没食子酸酯率降低、非聚合型没食子儿茶素率增加、几乎不含没食子酸、咖啡因浓度降低的非聚合型儿茶素类组合物。另外对以容器装饮料为样品的杀菌后的风味评价是感觉不到来自绿茶的异味、异臭，55℃保存后也未观察到生成沉淀。
实施例2本发明5用24000g的95℃无离子水对中国云南省锅炒绿茶1200g进行10分钟的提取、冷却、榨汁后，用金属丝网过滤，得到pH5.43的提取液19630g。提取液中的非聚合型儿茶素类的浓度是709.1mg/100mL，含139.2g非聚合型儿茶素类，没食子酸酯率为63.5％，没食子率为66.0％。另外，咖啡因浓度是136.2mg/100mL，含26.6g的咖啡因，咖啡因/非聚合型儿茶素类之比是0.191(—)。
然后，保持20℃的温度，用Laval型离心分离机除去微粒组分。接着，将填充在不锈钢柱(内径72.3mm×高度1600mm，容积5745mL)的合成吸附剂Sepabeads SP-207(三菱化学(株)制)5192mL，预先用SV＝6.9[h-1]的95％(v/v)乙醇25960mL洗净，接着用SV＝6.9[h-1]的25960mL的水洗净。
以SV＝4.6[h-1]通入所有所得提取液(相对合成吸附剂3.8倍的容积)，在通过液中，含非聚合型儿茶素类0.7g，几乎所有的非聚合型儿茶素类都被合成吸附剂吸附。
接着以SV＝6.9[h-1]用20760mL(相对合成吸附剂4.0倍的容积)的水洗净。洗净液中，含非聚合型儿茶素类0.8g，几乎没有因水洗导致非聚合型儿茶素类溶出。
水洗后，以SV＝4.6[h-1]通入20％(v/v)乙醇水21000mL(相对合成吸附剂4.0倍的容积)。将柱内的残留水3000mL彻底去除后，回收洗提液18000mL，减压浓缩除去乙醇，进行喷雾干燥，得到本发明的非聚合型儿茶素类组合物147.7g。该粉体中含非聚合型儿茶素类103.4g，从提取液中回收非聚合型儿茶素类的回收率为74.3％，非聚合型儿茶素类组合物的没食子酸酯率为54.2％，非聚合型儿茶素类中的没食子率为73.5％。另外，含咖啡因6.6g，咖啡因/非聚合型儿茶素类之比为0.064(—)。
本发明6在与本发明5同样操作得到的提取液中添加19.6g(0.1重量％)柠檬酸，使pH达到4.12后，除了向合成吸附剂通液外，进行与本发明5同样的操作，得到本发明的非聚合型儿茶素类组合物。
本发明7在与本发明5同样操作得到的提取液中添加196.0g(1.0重量％)柠檬酸，使pH达到2.80后，除了向合成吸附剂通液外，进行与本发明5同样的操作，得到本发明的非聚合型儿茶素类组合物。
本发明8在与本发明5同样操作得到的20％乙醇洗提液中添加4.9g(0.025重量％)L-抗坏血酸，使pH达到5.23后，除了进行减压浓缩、喷雾干燥外，进行与本发明5同样的操作，得到本发明的非聚合型儿茶素类组合物。
本发明9除使用中国云南省产蒸绿茶之外，其它与本发明5完全相同进行。
比较例3进行与本发明5同样的提取操作，不进行向合成吸附剂通液及洗提。
表2所示为分析及评价结果。
表2


*4非聚合型儿茶素类中的儿茶素没食于酸酯率的处理前后的变化(合成吸附剂处理后/提取液)×100*5非聚合型儿茶素类中的没食子儿茶素率的处理前后的变化(合成吸附剂处理后/提取液)×100采用本发明的方法，可得到处理前后非聚合型儿茶素类的回收率高、非聚合型儿茶素没食子酸酯率及非聚合型没食子儿茶素率的变化小、咖啡因浓度低的非聚合型儿茶素类组合物。而本发明5～9相对于比较例3减轻了锅炒香，风味得到改善，特别是添加了酸性化合物柠檬酸时，色泽得到大幅改善。另外对以容器装饮料为样品的杀菌后的风味评价是感觉不到来自绿茶的异味、异臭，55℃保存后也未观察到生成沉淀。
实施例3本发明10用1500g的85℃无离子水对宫崎产绿茶2号茶100g进行30分钟的提取、冷却、榨汁后，用2号滤纸过滤，得到Brix3.4的提取液1200g。接着，将填充在玻璃柱(内径40mm×高度400mm)的合成吸附剂Sepabeads SP-207(三菱化学(株)制)300mL，预先用SV＝3[h-1]的95％(v/v)乙醇900mL洗净，用SV＝3[h-1]的600mL水洗净。然后，以SV＝3[h-1]通入得到的提取液1200g，废弃通过液。吸附茶提取液之后，以SV＝3[h-1]向柱内的SP-207通入12％(v/v)乙醇水1800mL后，再以SV＝3[h-1]通入17％(v/v)乙醇水1200mL。将所得洗提液用旋转蒸发器减压浓缩至Brix20，得到非聚合型儿茶素类组合物100.1g。
本发明11除了合成吸附剂使用Sepabeads SP-70(三菱化学(株)制)以外，其它按与本发明10完全相同的操作得到非聚合型儿茶素类组合物108.6g。
本发明12除了合成吸附剂使用Sepabeads HP2MG(三菱化学(株)制)以外，其它按与本发明10完全相同的操作得到非聚合型儿茶素类组合物106.8g。
本发明13用旋转蒸发器将与本发明10同样地提取的提取液减压浓缩至Brix20，得到浓缩液103.5g。然后，向与本发明10同样地填充在玻璃柱(内径40mm×高度400mm)的合成吸附剂Sepabeads SP-207(三菱化学(株)制)通入液体300mL，得到非聚合型儿茶素类组合物105g。
参考例1用85℃的无离子水1500g对宫崎产绿茶2号茶100g进行30分钟的提取、冷却、榨汁后，用2号滤纸过滤，得到Brix3.4的提取液1200g。
比较例4除了不是通入本发明10的12％(v/v)乙醇水及17％(v/v)乙醇水，而是以SV＝3[h-1]通入5％(v/v)乙醇水3000mL之外，其它完全一样。得到非聚合型儿茶素类组合物110.2g。
比较例5除了不是通入本发明10的12％(v/v)乙醇水及17％(v/v)乙醇水，而是以SV＝3[h-1]通入30％(v/v)乙醇水900mL之外，其它完全一样。得到非聚合型儿茶素类组合物105.3g。
表3及表4表示分析结果和评价结果。
表3


表4

*1非聚合型儿茶素类中的儿茶素没食子酸酯率的处理前后变化(处理后/原料)×100*2非聚合型儿茶素类中的没食子儿茶素率的处理前后变化(处理后/原料)×100注本发明10～13使用的提取液非聚合型儿茶素类含有率0.98(％w/v)，咖啡因含有率0.17(％w/v)，咖啡因/非聚合型儿茶素类比率＝0.173本发明10～13中任一例都能得到极力抑制了处理前后儿茶素类组分的变化、且回收率高、咖啡因浓度低的非聚合型儿茶素类组合物。另外对以容器装饮料为样品的杀菌后的风味评价是感觉不到来自绿茶的异味、异臭，55℃保存后也未观察到生成沉淀。
权利要求
1.一种非聚合型儿茶素类组合物的制造方法，其特征在于，将用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物，以相对于合成吸附剂0.5～20[v/v]倍的溶液量，添加到填充有合成吸附剂的柱内，使水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类吸附，以相对合成吸附剂1～10[v/v]倍的水进行洗净，然后以相对于合成吸附剂的填充体积量0.5～20[v/v]倍量的10～95vol％乙醇水溶液进行洗提。
2.如权利要求1所述制造方法，其特征在于，对水溶性组合物进行鞣酸酶处理，再添加到合成吸附剂上。
3.如权利要求2所述制造方法，其特征在于，(A)所得组合物的非聚合型儿茶素类的回收率为70重量％以上；(B)非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯比率的浓度降低在10重量％以上；(C)非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子比率的浓度增加在1重量％以上。
4.如权利要求2或3所述制造方法，其特征在于，所得组合物中的咖啡因与非聚合型儿茶素类的重量比低于1/10。
5.如权利要求2～4中任一项所述制造方法，其特征在于，所得组合物中的没食子酸与经鞣酸酶处理后的水溶性组合物中的没食子酸的重量比低于1/10。
6.如权利要求2～5中任一项所述制造方法，其特征在于，使用具有500～5000U/g酶活性的鞣酸酶，相对非聚合型儿茶素类添加0.5～10重量％。
7.如权利要求2～6中任一项所述制造方法，其特征在于，所述绿茶叶是用蒸制法制造的绿茶叶。
8.如权利要求1所述制造方法，其特征在于，水溶性组合物是由锅炒制法制得的绿茶叶中提取的提取物。
9.如权利要求8所述制造方法，其特征在于，在水溶性组合物中，添加0.001～1.0重量％的水溶性酸性物质，将pH调节至2.0～5.5。
10.如权利要求8所述制造方法，其特征在于，所述水溶性酸性物质选自柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、苹果酸、富马酸、酒石酸、乙酸、葡糖酸、琥珀酸、磷酸以及从天然成分提取的果汁类中的1种或2种以上。
11.如权利要求8～10任一项所述制造方法，其特征在于，以在300℃以上的锅炒温度下制得的锅炒茶为原料。
12.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，采用以下两级解吸工序以SV(空间速度)＝0.5～5[h-1]的流动速度和相对于合成吸附剂为0.5～10[v/v]倍的溶液量，将水溶性组合物添加到填充有合成吸附剂的柱中，使水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类吸附，接着用相对于合成吸附剂的填充体积0.5～10倍量的10～14(v/v)％的乙醇水溶液进行洗脱，再以相对于合成吸附剂的填充体积0.5～10倍量的15～19(v/v)％的乙醇水溶液进行洗脱。
13.如权利要求12所述非聚合型儿茶素类组合物的制造方法，其特征在于，(G)咖啡因/非聚合型儿茶素类之比(重量比)小于0.04；(I)在用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯类的比率为1时，儿茶素没食子酸酯类的比率为80～120％；(J)在用水从绿茶叶提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为1时，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为85～115％。
14.如权利要求12或13所述非聚合型儿茶素类组合物的制造方法，其特征在于，水溶性组合物的Brix为2～25。
15.一种非聚合型儿茶素类组合物，用权利要求2～7所述制造方法制造，其特征在于，(A)所得组合物的非聚合型儿茶素类的回收率为70重量％以上；(B)非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯比率的浓度降低在10重量％以上；(C)非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子比率的浓度增加在1重量％以上。
16.一种非聚合型儿茶素类组合物，用权利要求8～11所述制造方法制造，其特征在于，(D)咖啡因/非聚合型儿茶素类(重量比)之比低于1/10；(E)在用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯类的比率为1时，儿茶素没食子酸酯类的比率为0.80～1.20；(F)用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为1时，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为0.85～1.15。
17.如权利要求16所述非聚合型儿茶素类组合物，其特征在于，将非聚合型儿茶素类浓度调整至0.175％[w/v]而成的水溶液的色泽L值(亮度)为90～小于100，b值(黄色)为0～20，450nm的吸光度为0～0.2。
18.一种非聚合型儿茶素类组合物，用权利要求12～14所述制造方法制造，其特征在于，(G)咖啡因/非聚合型儿茶素类之比(重量比)小于0.04；(I)在用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型儿茶素没食子酸酯类的比率为1时，儿茶素没食子酸酯类的比率为80～120％，(J)在用水从绿茶叶提取的水溶性组合物的非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为1时，非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子类的比率为85～115％。
全文摘要
本发明涉及非聚合型儿茶素没食子酸酯率降低、非聚合型儿茶素类中的非聚合型没食子儿茶素率的浓度增加、咖啡因量降低、高度精制的非聚合型儿茶素类组合物的制造方法。该方法将用水从绿茶叶中提取的水溶性组合物，以相对于合成吸附剂0.5～20[v/v]倍的溶液量，添加到填充有合成吸附剂的柱内，使水溶性组合物中的非聚合型儿茶素类吸附，以相对合成吸附剂1～10[v/v]倍的水进行洗净，然后以相对于合成吸附剂的填充体积量0.5～20[v/v]倍量的10～95vol％乙醇水溶液进行洗提。
文档编号A23F3/18GK1711866SQ200510076739
公开日2005年12月28日 申请日期2005年6月10日 优先权日2004年6月25日
发明者福田昌弘, 高桥宏和, 小西敦 申请人:花王株式会社