专利名称：神经酰胺化合物在制备细胞活化剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有α-糖基神经酰胺的NKT细胞活化剂，自身免疫疾病治疗剂和堕胎剂。
背景技术：
已发现适当表达T细胞受体的中间TCR细胞(TCRint细胞)，在显示大颗粒淋巴细胞(LGL)样的形态，经常表达IL-2R β链，和具有perforin颗粒等方面是与Natural Killer(NK)细胞类似的细胞，但就具有TCR这一点表明是与NK细胞明显不同的细胞(Watannabe，H.等，J.Immunol.，155，2972(1995))。因此，在小鼠中，在白介素12(IL-12)活化的TCRint细胞中，表达NK1.1的NK1.1+TCRint(NKT)细胞被证明是肿瘤向肝脏或肺血原性转移抑制的重要效应器细胞(Hashimoto，W.等，J.Immunol.，154，4333(1995)；Anzai，R.等.，Immunol.，88，82(1996))。由此可见，可认为这些NKT细胞对于癌细胞、寄生虫或原生动物，以及李司忒氏菌属(Listeriamonocytogenes)或结核菌等细胞内感染细菌的排除可起到重要的作用(Seki，S.等，J.Immunol.，28，1069(1996))。
另外，已知这些NKT细胞与骨髓移植引起的急性期排斥反应(Yankelevich，B.等，J.Immunol.，142，3423(1989))或辅助T细胞的Th1/Th2的分化抑制引起的IgE抗体产生的抑制(Yoshimoto，T.等，J.Exp.Med.，179，1285(1994))等密切相关。因此，这些NKT细胞，在近些年，作为新的细胞群是非常引人注目的细胞群。
Vα14+NKT细胞是上述NKT细胞的一个亚型，大多数Vα14+NKT细胞表达Vα14Jα281mRNA，并将此作为TCRα链具有。近年，这些Vα14+NKT细胞被证明与自身免疫疾病的发病密切相关。即，MRLlpr/lpr小鼠，在出生后17-20周龄时异常淋巴细胞积聚引起自身免疫疾病(人全身性红斑狼疮)的模型小鼠，用该模型小鼠证明，在自身免疫疾病发病前，Vα14+NKT细胞选择性的减少(Mieza，M.A.等，J.Immunol.，156，4035(1996))。
在其它自身免疫疾病模型鼠上也观察到了类似的现象，例如，gld小鼠或(NZBxNZW)F1小鼠，证明Vα14+NKT细胞与自身免疫疾病的发病密切相关(Makino，Y.等，Clin.Immunol.，28，1487(1996))。
更有意思的是，在人身上也观察到了类似的现象。即，与小鼠Vα14Jα281链相同的人相应的Vα24JαQα链，在健康人末梢血的CD4-/CD8-T细胞中的存在量为20-50％，但在硬皮症患者中几乎消失了(Sumida，T.等.，J.Exp.Med，.182，1163(1995))。
因此，可知鼠Vα14+NKT细胞或人Vα24JαQαT细胞与不同的遗传因子或遗传背景引起的各种自身免疫疾病相关。由此可见，具有上述的NKT细胞活化作用的IL-12，可被期待用作象人全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosusSEL)或全身性强皮症(systemicsclerosisSSc)这样的自身免疫疾病的治疗剂。但是，当使用IL-12对MRL lpr/lpr小鼠给药时，与未给药的小鼠相比，脾和淋巴结中异常淋巴球(CD3+B220+双阴性T细胞)有明显增加(TakenoriTsutsui等.，日本免疫学会总会·学术集会记录，347(1996))。
但是，在生物体内存在各种糖与神经酰胺以β-构型键合而成的β-半乳糖基神经酰胺或β-葡萄糖基神经酰胺(Svennerholm，L.等.，Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)；Karlsson，K.-A.等.，Biochim.Biophys.Acta，316，317(1973))。一方面，已知α-半乳糖基神经酰胺有显著的免疫赋活作用以及抗肿瘤作用(Morita，M.等.，J.Med.Chem，38，2176(1995))，且α-半乳糖基神经酰胺或α-葡萄糖基神经酰胺的该作用比β-半乳糖基神经酰胺或β-葡萄糖基神经酰胺的作用强的多(Motoki，K.等.，Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995))。另外，已知使用具有α-葡萄糖基神经酰胺结构的化合物对生物体给药时，具有射线防护作用(Motoki，K.等.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，5，2413(1995))，具有小鼠黑素瘤B16的肺转移抑制作用(Kobayashi，E.等.，Oncology Res.，7，529(1995))，和小鼠大肠癌Colon26或小鼠T淋巴瘤EL-4的肝转移抑制作用(元木一宏等日本癌学会总会记事、523(1996))和增加血小板数或白血球数的作用(Motoki，K.等.，biol.Pharm.Bull.，19，952(1996))。
但是，至今没有报道指出具有α-葡萄糖基神经酰胺结构的化合物对自身免疫疾病有效或具有堕胎作用，以及具有α-葡萄糖基神经酰胺结构的化合物会影响NKT细胞。
发明概述本发明的发明者发现，α-葡萄糖基神经酰胺在RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠(不存在按淋巴球划分的B细胞、T细胞和NK细胞，但存在大量NKT细胞的小鼠)中可增强NKT细胞的对于肿瘤细胞的抗肿瘤细胞毒素活性，由于α-葡萄糖基神经酰胺使得NKT细胞(特别是小鼠Vα14+NKT细胞和人Vα24+NKT细胞)的数目显著增加，α-葡萄糖基神经酰胺可抑制人全身性红斑狼疮的模型小鼠MRLlpr/lpr小鼠腋下和鼠腹股沟的淋巴结的异常肿胀(异常淋巴球的积聚)，并因此α-葡萄糖基神经酰胺可抑制4％DSS诱发的小鼠结肠炎的进行。
本发明的发明者还发现，α-葡萄糖基神经酰胺可抑制实验的自身免疫性脑脊髓炎的发病。小鼠的实验的自身免疫性脑脊髓炎是人多发性硬化症的模型。本发明的发明者还发现，在NOD小鼠中，α-葡萄糖基神经酰胺可抑制糖尿病的自然发病。NOD小鼠是人I型糖尿病的模型。
本发明的发明者还发现，α-葡萄糖基神经酰胺对妊娠小鼠具有堕胎效果。
本发明的目的是提供NKT细胞活化剂以及活化的NKT细胞。
本发明的另一目的是提供自身免疫疾病(例如，全身性红斑狼疮，全身性强皮症，溃疡性结肠炎，脑脊髓炎，多发性硬化症，和I型糖尿病等)的治疗剂。
本发明的另一目的是提供堕胎剂。
本发明的NKT细胞活化剂，自身免疫疾病治疗剂和堕胎剂含有下式(I)的化合物或其盐或其溶剂化物作为有效成分
其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整数，R2选自下列(a)～(e)的取代基(其中，Y是5～17中的任一整数)，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、- -且R3～R9是下列i)～ii)中任一定义的取代基i)R3、R6和R8是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)中的取代基
R5是OH，或选自下面(E)或(F)的取代基 R7是OH或选自下面(A)-(D)的取代基 R9是H、CH3、CH2OH、或选自下面(A’)～(D’)的取代基 ii)R3、R6和R7是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)的取代基
R5是OH、或选自下面(E)或(F)的取代基 R8是OH、或选自下面(A)～(D)的取代基 R9是H、CH3、CH2OH或选自下面(A’)～(D’)的取代基。
附图简要说明
图1是KRN7000对NKT细胞抵抗肿瘤细胞的细胞毒素活性增强活性的示意图。E/T比表示效应细胞数(脾脏细胞数)/靶细胞数(YAC-1细胞数)的比。
图2显示的是在脾脏中KRN7000对NKT细胞的增加作用。
A表示脾脏淋巴细胞部分的FACS解析结果。横轴表示FITC标识抗TCRαβ单克隆抗体的荧光强度，纵轴表示Cychrome标识的抗NK1.1单克隆抗体的荧光强度。
B表示脾脏淋巴细胞部分的FACS解析结果。纵轴表示细胞数(相对细胞数)，横轴表示PE标识的Vα14单克隆抗体的荧光强度。白色部分表示用无标识的Vα14单克隆抗体预处理后，用PE标识Vα14单克隆抗体进行染色时(非标记阻断)的荧光强度。阴影部分表示对于使用载体或KRN7000给药后的Vα14+细胞，PE标识Vα14单克隆抗体的荧光强度分布。
C表示脾脏淋巴细胞部分的细胞数，和脾脏淋巴细胞部分中的T细胞数、NK细胞数和Vα14+NKT细胞数随KRN7000给药的变化。●Vα14+NKT细胞、○全细胞、◇T细胞、□NK细胞。
图3表示使用KRN7000给药后，经时观察MRL lpr/lpr小鼠的淋巴肿胀的进展的结果。各淋巴结按照其大小记为4个级别，-(0)、+(1)、++(2)、+++(3)，各小鼠的左右腋下(A)或小鼠腹股沟部的淋巴结(B)的级别合计作为淋巴结肿胀的指数。
图4表示用KRN7000给药后，MRL lpr/lpr小鼠的生存率。
图5显示KRN7000对4％DSS诱发小鼠结肠炎的抑制作用。在试验期间，将4％DSS作为饮用水对鼠连续给药。
A显示各群小鼠体重的变化。B表示各群小鼠的生存率。
图6显示的是KRN7000对在C57BL/6小鼠中，由髓磷脂少突神经胶质细胞蛋白质(MOG)肽等诱导的实验自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的效果。A载体给药群，BKRN7000(20μg/kg)给药群。EAE的症状按照下列标准分级临床级别0正常、1尾部麻痹、2；静位反射不全、3；后肢麻痹、4前肢麻痹、5死亡。
图7显示的是KRN7000在NOD小鼠中对于自然发病的糖尿病的效果。
图8显示的是KRN7000对Vα24+NKT细胞增殖的促进作用。使用末梢血单核细胞作为应答细胞进行自身混合淋巴细胞反应后，回收CD4-CD8-细胞，用已标识的抗体确定表现型。点线表示用对照抗体(鼠IgG或大鼠IgM)染色时的荧光强度分布，实线表示用抗CD3、CD4、CD8、Vα24、VB11抗体(以上、Immunotech社)、抗NKRP1A抗体(BectonDickinson社)染色时的荧光强度分布。
图9显示的是KRN7000对Vα24+NKT细胞增殖的促进作用。当抗原呈递细胞用KRN7000处理时，根据抗原呈递细胞的数目可看到Vα24+NKT细胞的增殖。
图10所示的是本发明使用的α-糖基神经酰胺化合物的代表例(KRN7000)的合成反应路线示意图。在反应过程中，pyr代表吡啶，BrPPh3(CH2)12CH3代表十三烷基三苯基溴化鏻，n-BuLi代表正丁基锂，MsCl代表甲磺酰氯，BnBr代表苄基溴，1-PrOH代表丙醇。
图11是接续图10的合成反应路线。反应过程中，WSC-HCl代表1-乙基-3-(3’-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐，MS4A代表分子筛4A，且Hex4NBr代表四己基溴化铵。
图12显示的是实施例1～3的化合物的结构式。
发明详述式(I)化合物上述式(I)化合物中，神经酰胺部分的X优选是11～25的整数。
R2中的Y优选是9～17的整数，更优选是11～15的整数。
对于式(I)的神经酰胺部分，X和R2优选的组合是，X是21～25的整数，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15)所代表的化合物和X是9～13的整数，R2是取代基(a)(式中，Y是11～15)所代表的化合物。
对于式(I)的糖部分，R3～R9优选的组合是，R3和R6代表氢，R4表示OH或选自(A)～(D)任一个的取代基，R5表示OH或(E)或(F)的取代基，R7和R8分别表示H或OH(但R7和R8不表示相同的取代基)，R9表示CH2OH，CH3，H或选自(A’)～(D’)任一个的取代基所表示的化合物。
更优选的组合可列举的有R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分别是H或OH(但R7和R8不表示相同的取代基)，且R9是CH2OH或选自(A’)～(D’)的任一个取代基所表示的化合物，和R3、R6和R8是H，R4、R5和R7是OH，且R9是CH2OH所表示的化合物。
作为式(I)化合物优选的例子可列举的有X是21～25的整数，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整数)，R3和R6是H，R4是OH或选自(A)～(D)的取代基，R5是OH或选自(E)和(F)的取代基，R7和R8分别是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是CH2OH或选自(A’)～(D’)的取代基的化合物；X是9～13的整数，R2是取代基(a)(式中，Y是11～15的整数)，R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分别是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是H、CH3或CH2OH的化合物；X是21～25的整数，R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整数)，R3和R6是H，R4和R5是OH，R7和R8分别是H或OH(但二者不表示相同的取代基)，R9是CH2OH或选自(A’)～(D’)的取代基的化合物；X是21～25的整数，
R2是取代基(b)(式中，Y是11～15的整数)，R3、R6和R8是H，R4、R5和R7是OH，R9是CH2OH的化合物。
作为本发明治疗剂的有效成分，优选的化合物可列举的有(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰基氨基-3，4-十八烷二醇(KRN 7000)，(2S，3R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-十四烷酰基氨基-3-十八烷醇(AGL-517)，(2S，3R)-1-(α-D-吡喃葡萄糖基氧)-2-十四烷酰基氨基-3-十八烷醇(AGL-563)，(2S，3R)-1-(6’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-十四烷酰基氨基-3-十八烷醇(AGL-571)，(2S，3R)-1-(β-L-吡喃阿拉伯糖基氧)-2-十四烷酰基氨基-3-十八烷醇(AGL-577)，O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八烷三醇(AGL-586)O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-二十六烷酰基-1，3，4-十八烷三醇(AGL-584)O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(S1140B-9)O-β-D-呋喃半乳糖基-(1→3)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(719-7)，和O-(N-乙酰基-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-O-[α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(STL-8)。
作为本发明治疗剂的有效成分特别优选的化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰基氨基-3，4-十八烷二醇(KRN 7000)。
式(I)化合物可以是药学上允许的非毒性盐形式。作为式(I)化合物的盐，可列举的有，酸加成盐，例如，无机酸(例如盐酸，硫酸，硝酸，磷酸)的盐，或有机酸(例如，乙酸，丙酸，马来酸，油酸，棕榈酸，柠檬酸，琥珀酸，酒石酸，富马酸，谷氨酸，泛酸，十二烷基磺酸，甲磺酸和邻苯二甲酸)。
式(I)化合物可以是溶剂化物(例如，水合物)。
式(I)化合物可使用任何合成α-糖基神经酰胺的方法制备。
首先，使用D-来苏糖作为起始物合成神经酰胺部分，然后向该神经酰胺中引入糖，制备式(I)化合物。关于这样的α-糖基神经酰胺的合成方法，可参照例如，WO93/5055，WO94/2168，WO94/9020和WO94/24142。
另外，式(I)化合物可从天然物(生物等)用柱色谱等分离纯化。
式(I)化合物的用途当使用本发明化合物的代表化合物KRN7000对RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠给药时，可看到NKT细胞对于肿瘤细胞的抗肿瘤细胞毒素活性的增加(药理试验例1)。
另外，本发明的发明者发现α-糖基神经酰胺可使NKT细胞，特别是Vα14+NKT细胞或Vα24+NKT细胞的数目显著增加(药理试验例2、6和9)。已知象在自身免疫疾病模型小鼠中Vα14+NKT细胞的减少、在强皮症患者中Vα24+JαQαT细胞的消失，在I型糖尿病发展的患者中Vα24+NKT细胞极端地减少所示的那样，在遗传因子或遗传背景不同的各种自身免疫疾病中，可显示出与小鼠Vα14+NKT细胞或人Vα24+NKT细胞相关的现象(Mieza，M.A.等.，J.Immunol.，156，4035(1996)；Makino，Y.等，Clin.Immunol.，28，1487(1996)；Sumida，T.等.，J.Exp.Med.，182，1163(1995)；Wilson等.，Nature，391，177(1998))。另外，本发明的发明者发现，在对认为是人全身性红斑狼疮的模型小鼠MRL lpr/lpr小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))用KRN7000给药时，抑制了鼠腋下和鼠腹股沟部的淋巴结异常肿胀(异常淋巴细胞的积聚)(药理试验例3)。淋巴结的异常肿胀在MRL lpr/lpr鼠中是伴随年龄增长观察到的特征症状。
因此，作为本发明的第一方面，式(I)化合物或其盐或其溶剂化物可用作NKT细胞活化剂。在此“NKT细胞”，包括人Vα24+NKT细胞和小鼠Vα14+NKT细胞。人Vα24+NKT细胞是人Vα24JαQαT细胞的亚型，与Vα24+双负(CD4-CD8-)T细胞(Dellabona，P.等，J.Exp.Med.180，117(1994))同义。另外，“NKT细胞的活化”包括细胞毒素活性的增强和促进NKT细胞的增殖。
作为本发明的第二方面，式(I)化合物或其盐或其溶剂化物可用作自身免疫疾病治疗剂。在本发明中，作为“自身免疫疾病”，包括全身性红斑狼疮、全身性强皮症、溃疡性结肠炎、多发性硬化症、脑脊髓炎、I型糖尿病、慢性关节风湿病、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性肝硬变、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力、交感神经性眼炎、古德帕斯彻氏综合征(例如，肾小球性肾炎)、恶性贫血和桥本氏病。另外，在本发明的说明书中，“治疗”包括“预防”之意。
式(I)化合物和IL-12可促进妊娠小鼠的流产(药理试验例10)。因此，本发明的第三方面是式(I)化合物或其盐或其溶剂化物和IL-12用作堕胎剂。式(I)化合物和IL-12不仅可对妊娠动物给药，还可以对有妊娠可能性的动物给药。对有妊娠可能性的动物预先用式(I)化合物和IL-12给药可阻止妊娠。因此，“堕胎剂”含有“避孕剂”的意义。
式(I)化合物或其盐或其溶剂化物和IL-12，可根据治疗方法，给药方法，和给药目的制成适当的剂型，具体的有，注射剂，悬浮剂，乳化剂，软膏剂，乳剂，片剂，胶囊剂，颗粒剂，散剂，丸剂，细粒剂，糖锭，直肠给药剂，油脂性栓剂和水溶性栓剂等。
以上各种制剂，可使用下述药学上可接受的载体等按照常规方法制备。赋形剂例如，溶剂(例如，水，生理盐水)，增量剂和填充剂(例如，乳糖，淀粉，结晶纤维素，甘露糖醇，麦芽糖，磷酸氢钙，软质硅酸酐，碳酸钙)；辅助剂，例如，增溶剂(例如，乙醇，聚山梨酸酯)，粘合剂(例如，淀粉，聚乙烯基吡咯烷酮，羟丙基纤维素，乙基纤维素羧甲基纤维素和阿拉伯胶)，崩解剂(例如，淀粉和羧甲基纤维素钙)，润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石，硬化油)，稳定剂(例如，乳糖，甘露糖醇，麦芽糖，聚山梨酸酯类，聚乙二醇类，聚氧乙烯氢化蓖麻油)，等张剂，润湿剂，润滑剂，分散剂，缓冲剂，溶解辅助剂；添加剂，例如，抗氧化剂，防腐剂，矫味矫臭剂，止痛剂，稳定剂，着色剂，和甜味剂。
另外，可根据需要，向各种制剂中添加甘油，二甲基乙酰胺，70％乳酸钠，表面活性剂，碱性物质(例如，亚乙基二胺，乙醇胺，碳酸钠，精氨酸，葡甲胺，三氨基甲烷)。
本发明的式(I)化合物和IL-12，可经过任何符合目的的途径给药。具体地说，对于动物的场合，可使用腹腔内给药，皮下给药，向静脉或动脉的血管内给药，用注射局部给药等。另外，对于人的场合，可使用静脉内给药，动脉内给药，使用注射局部给药，向腹腔或胸腔给药，皮下给药，肌肉内给药，舌下给药，透皮吸收或直肠内给药。优选静脉内给药。
本发明治疗剂中的各有效成分，可根据具体的状况连续或间隔给药。具体的给药量根据给药方法，患者的各种条件，例如，年龄，体重，性别，感受性，给药时间，并用药剂等变化。一般地，式(I)化合物和IL-12的给药量为，例如，静脉内给药，对于成人1日0.01～10mg左右，优选0.01～1mg。优选将式(I)化合物制成冷冻干燥制剂，在给药前用注射用蒸馏水等溶解，对患者给药。
本发明提供了自身免疫疾病的治疗方法，包括使用式(I)化合物或其盐或其溶剂化物对包括人在内的哺乳动物给药。
本发明还提供了自身免疫疾病的治疗方法，包括使用式(I)化合物或其盐或其溶剂化物活化NKT细胞(活化的NKT细胞)对包括人在内的哺乳动物给药。
活化的NKT细胞，可通过在式(I)化合物或其盐或其溶剂化物存在下体外培养获得。另外，也可通过分离使用式(I)化合物给药的哺乳动物体内的活化NKT细胞得到。
与式(I)化合物一起在体外培养的NKT细胞，可以是从健康人分离得到的，或从患者或被怀疑为患者中分离得到的。在对人治疗的场合，NKT细胞优选是人Vα24+NKT细胞。
使用活化NKT细胞对哺乳动物给药，可通过将活化NKT细胞移植到哺乳动物体内，例如，移植到静脉内。
本发明还提供了NKT细胞活化的方法，包括在式(I)化合物或其盐或其溶剂化物存在下体外培养NKT细胞。
本发明还提供了堕胎的方法，包括使用式(I)化合物或其盐或其溶剂化物或IL-12对包括人在内的哺乳动物给药。
实施例以下的实施例用以详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
化合物的合成和分离纯化实施例1(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰基氨基-3，4-十八烷二醇(KRN 7000)的合成合成步骤按照图10和图11所示。
(1)化合物G1的合成向用氯化钙干燥过的D-来苏糖(200g，1.33mol)的丙酮溶液(3.0L)中加入硫酸(0.5mL)，将混合物在室温搅拌18小时。加入分子筛4A的粉末(100g)，将反应液中和后，用硅藻土过滤，残渣用丙酮洗净。将滤液和洗液合并并减压浓缩，得到G1的粗产物。产量240g(95％)。此产物可不经纯化直接用于下一步。分析用样品用硅胶色谱纯化，用己烷∶丙酮(9∶1)作为洗脱液。
mp76-78℃；FDMS m/z 191(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.45(1H，d，J＝1.8Hz)，4.83(1H，dd，J＝3.7，5.5Hz)，4.64(1H，d，J＝6.1Hz)，4.27-4.30(1H，m)，3.90-3.99(2H，m)，1.48(3H，s)，1.32(3H，s)。
(2)化合物G2的合成向化合物G1(239g，约1.26mmol)的二氯甲烷溶液中(168ml)，加入吡啶(10ml)和三苯甲基氯(39.0g)，将混合物在32℃搅拌4小时。滴加入乙醇(8ml)，在室温搅拌2小时。用饱和氯化铵水溶液，饱和碳酸氢钠水溶液，食盐水洗净后，减压浓缩。残渣用乙酸乙酯溶解，冷却至0℃结晶。产量501g(与D-来苏糖相比为87％)。
mp174-176℃；FDMS m/z 432M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.49(15H，m)，5.38(1H，d，J＝2.4Hz)，4.75(1H，dd，J＝3.7，6.1Hz)，4.59(1H，d，J＝6.1Hz)，4.31-4.35(1H，m)，3.43(1H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.39(1H，dd，J＝6.7，9.8Hz)，1.29(3H，s)，1.28(3H，s)。
(3)化合物G3的合成在氩气氛围下，0℃，向十三烷三苯基溴化鏻(962g，1.16mol；是用1-溴代十三烷，三苯基膦在140℃加热4.5小时制备的)的THF溶液(1500ml)中，滴加入正丁基锂的2.5M己烷溶液(462mL；366mmol)。滴加完成后，搅拌15分钟，滴加入化合物G2(250g，579mmol)的THF溶液(450ml)。将化合物连续搅拌18小时同时缓慢升温至室温。将反应液减压浓缩，向残渣中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3、1000ml)的混和液，用饱和氯化铵水溶液洗净。水层用己烷(500ml)萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得到G3的粗产物。不需纯化可直接用于下一步。产量339g(98％)。分析用样品用硅胶色谱纯化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液。
FDMS m/z 598M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.45(15H，m)，5.48-5.59(2H，m)，4.91(0.7H，t，J＝7.3Hz)，4.44(0.3H，t，J＝7.3Hz)，4.26(0.3H，dd，J＝4.3，7.3Hz)，4.21(0.7H，dd，J＝4.3，6.7Hz)，3.75(0.7H，m)，3.69(0.3H，m)，3.24(0.3H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.17(0.7H，dd，J＝4.9，9.8Hz)，3.09-3.14[1H，(3.11，dd，J＝4.9，9.2Hz)，H1b Eoverlapped]，1.75-2.03(2H，m)，1.49(3H，s)，1.39 and 1.38(3H，each s)，1.21-1.34(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(4)化合物G4的合成向化合物G3(338g，约565mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入吡啶(500ml)，并滴加入甲磺酰氯(49ml，633mmol)，将混合物在31℃搅拌24小时。滴加入乙醇40ml，将混合物在室温搅拌1小时。减压浓缩后，向残渣中加入己烷∶甲醇∶水(10∶7∶3，1000ml)的混和液，进行分液。水层用己烷(200ml)萃取3次，合并有机层用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得到G4的粗产物。此产物不需纯化可直接用于下一步。产量363g(95％)。分析用样品用硅胶色谱纯化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液。
FDMS m/z 676M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.47(15H，m)，5.41(0.7H，ddd，J＝5.5，9.2，11.0Hz)，5.32(0.7H，bt，J＝11.0Hz)，5.22(0.3H，bdd，J＝9.2，15.0Hz)，5.02(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝15.0Hz)，4.8(0.7H，ddd，J＝3.1，5.5，7.9Hz)，4.73(0.7H，dd，J＝5.5，9.8Hz)，4.64-4.67(0.3H，m)，4.61(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，4.48(0.7H，dd，J＝5.5，7.9Hz)，4.22(0.3H，dd，J＝5.5，9.2Hz)，3.55(0.3H，dd，J＝2.4，11.6Hz)，3.45(0.7H，dd，J＝3.2，11.0Hz)，3.06-3.12[4H，(3.12，s)，(3.11，s)，(3.09，dd，J＝3.1，11.0Hz)]，1.66-1.82(2H，m)，1.47 and 1.46(3H，each s)，1.39(3H，s)，1.13-1.35(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.8Hz)。
(5)化合物G5的合成向化合物G4(362g，约536mmol)的二氯甲烷溶液(1500ml)中加入甲醇(350ml)，向其中滴加入浓盐酸(200ml)，将混合物在室温搅拌5小时。向反应液中加入碳酸氢钠中和后，过滤。将滤液减压浓缩，向残渣中加入乙酸乙酯，用食盐水洗净。水层用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩。用己烷结晶。产量161g(与G2相比为70％)。
mp66-67℃；FDMS m/z 377(M-H2O)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ5.86(0.3H，dt，Jt＝7.3Hz，Jd＝14.7Hz)，5.77(0.7H，dt，Jt＝7.3，Jd＝10.4Hz)，5.55(0.3H，br，dd，J＝7.3，14.7Hz)，5.49(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.91-4.97(1H，m)，4.51(0.7H，bt，J＝9.8Hz)，4.11(0.3H，bt，J＝7.3Hz)，3.94-4.03(2H，m)，3.67-3.73[1H，(3.70，dd，J＝3.1，6.7Hz)，(3.69，dd，J＝3.1，7.3Hz)]，3.20 and 3.19(3H，eachs)，2.05-2.22(2H，m)，1.22-1.43(20H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(6)化合物G6的合成向化合物G5(160g，405mmol)的THF溶液(780ml)中加入5％钯-硫酸钡(16g)，将反应器用氢气置换后，在室温搅拌20小时。反应液用硅藻土过滤后，用氯仿∶甲醇的混和液(1∶1)洗净。合并滤液和洗液，真空浓缩。残渣用乙酸乙酯结晶。产量146g(91％)。
23D+12°(c1，CHCl3/MeOH＝1∶1)；mp124-126℃；FDMS m/z 397(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD＝1∶1)δ4.93-4.96(1H，m，H2)，3.91(1H，dd，J＝6.7，12.2Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，12.2Hz)，3.54-3.60(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝1.8，8.5Hz)，3.19(3H，s)，1.75-1.83(1H，m)，1.53-1.62(1H，m)，1.21-1.45(24H，m)，0.89(3H，t，J＝6.7Hz)。
(7)化合物G7的合成向化合物G6(145g，365mmol)的DMF溶液(1000ml)中加入叠氮化钠(47g，730mmol)，将混合物在95℃搅拌4小时。将反应液浓缩，向残渣中加入乙酸乙酯(450ml)，用水洗。水层用乙酸乙酯再次萃取。合并有机层，用食盐水洗净后，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到G7的粗产物。产量122g(97％)。该产物不需纯化可直接用于下一步。分析用样品用硅胶色谱纯化，使用己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱剂。
23D+16.5°(c0.5，CHCl3-MeOH，1∶1)；mp92-93℃；FDMS m/z 344(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ3.91(1H，dd，J＝3.7，11.6Hz)，3.75(1H，dd，J＝7.9，11.6Hz)，3.49-3.61(3H，m)，1.50-1.71(2H，m)，1.22-1.46(24H，m)，0.90(3H，t，J＝6.7Hz)。
(8)化合物G8的合成向化合物G7(121g，约352mmol)的二氯甲烷溶液(750ml)中加入吡啶(250ml)，三苯甲基氯(124g，445mmol)，将混合物在室温搅拌16小时。滴加入乙醇(30ml)，在室温搅拌30分钟后，用饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化铵水溶液，食盐水洗净后，用无水硫酸镁干燥，真空浓缩。残渣用硅胶色谱纯化，使用己烷∶乙酸乙酯(10∶1)作为洗脱剂。产量34.4g(与G6相比为52％)。
24D+11.9°(c0.9，CHCl3)，FDMS m/z 585M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3+D2O)δ7.24-7.61(15H，m)，3.62-3.66(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.0，10.4Hz)，1.23-1.56(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(9)化合物G9的合成向化合物G8(33.5g，57.3mmol)的DMF溶液(300ml)中加入60％氢化钠(5.5g，约138mmol的NaH)，将混合物在室温搅拌40分钟。将反应液冷却至0℃，滴加入苄基溴(15ml，120mmol)。将混合物搅拌18小时并缓缓升温至升温。向反应液中加入冰水(100ml)，反应停止后，用乙酸乙酯萃取。萃取液用食盐水洗涤3次，合并有机层用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得到G9的粗产物。该产物不需纯化可直接用于下一步。产量42.2g(96％)。分析用样品用硅胶色谱纯化，用己烷∶乙酸乙酯(100∶1)作为洗脱液。
24D+9.8°(c1.0，CHCl3)，FDMS m/z 738(M-N2)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.07-7.48(25H，m)，4.57(1H，d，J＝11.6Hz)，4.44(1H，d，J＝11.6Hz)，4.41(2H，s)，3.73-3.79(1H，m)，3.46-3.56(2H，m)，3.37(1H，dd，J＝8.6，10.4Hz)，1.20-1.64(26H，m)，0.88(3H，t，J＝6.7Hz)。
(10)化合物G10和G11的合成向化合物G9(41.2g，约54mmol)的1-丙醇溶液(250ml)中加入甲醇(30ml)，并进一步加入5％钯炭(4.1g)，甲酸铵(27.1g，4.3mol)。将混合物在室温搅拌16小时后，用乙酸乙酯稀释，硅藻土过滤。将滤液减压浓缩，剩余物用乙酸乙酯溶解后，用饱和碳酸氢钠水溶液，食盐水洗涤3次，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后，真空浓缩，得到G10的粗产物。产量38.9g(98％)。所得G10，不需纯化可直接用于下一步。
向化合物G10的二氯甲烷溶液(300ml)中，加入二十六酸(22.4g，56.5mmol)，WSC盐酸盐(12.6g，64.6mmol)，将混合物加热回流2小时。将混合物冷却至室温，减压浓缩。向残渣中加入乙酸乙酯(500ml)，用0.5M盐酸水溶液，食盐水，饱和碳酸氢钠水溶液，并进一步用食盐水洗净。合并有机层，用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得到G11的粗产物。产量53.2g(88％)。所得G11不需纯化，可直接用于下一步。分析用样品用硅胶色谱纯化，使用己烷∶乙酸乙酯(100；1)作为洗脱液。
24D+5.3°(c0.4，CHCl3)；FDMS m/z 1118M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.20-7.38(25H，m)，5.57(1H，d，J＝9.1Hz)，4.80(1H，d，J＝11.6Hz)，4.48-4.50(3H，m)，4.24-4.32(1H，m)，3.83(1H，dd，J＝3.0，6.7Hz)，3.43-3.51(2H，m，H1a)，3.29(1H，dd，J＝4.3，9.8Hz)，1.92(2H，t，J＝7.3Hz)，1.28-1.60(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)。
(11)化合物G12的合成向化合物G11(52.2g，约47mmol)的二氯甲烷溶液(180ml)中加入甲醇(36ml)，接着滴加入10％盐酸甲醇溶液(3.0ml)，将混合物在室温搅拌2小时。将反应液用粉末状的碳酸氢钠(18g)中和，硅藻土过滤。残渣用二氯甲烷洗涤。合并滤液和洗液，用食盐水洗净，有机层用无水硫酸镁干燥后，减压浓缩。将残渣在丙酮中加热溶解，冷却至0℃沉淀纯化。产量38.6g(与G9相比为77％)。
24D-29.7°(c0.7，CHCl3)；mp75-76.5℃；FDMS m/z 876M+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.30-7.47(10H，m)，6.03(1H，d，J＝7.9Hz)，4.72(1H，d，J＝11.6Hz)，4.66(1H，d，J＝11.6Hz)，4.61(1H，d，J＝11.6Hz)，4.45(1H，d，J＝11.6Hz)，4.12-4.17(1H，m)，4.00(1H，dt，Jt＝4.3，Jd＝7.3Hz)，3.67-3.72(2H，m)，3.61(1H，ddd，J＝4.3，8.6，11.6Hz)，1.94-2.05(2H，m)，1.15-1.69(72H，m)，0.88(6H，t，J＝6.1Hz)。
(12)化合物G13的合成1)将2，3，4，6-四-O-苄基-D-吡喃半乳糖基乙酸酯(79.8g)溶于甲苯(160ml)和异丙醚(520ml)的混和液中，冷却至-10～0℃。向其中加入含2.0当量的HBr的异丙醚溶液(2.8mmol/ml，约100ml)。在-10～0℃搅拌约90分钟后，向反应液中倒入5％碳酸氢钠水溶液，搅拌，中和过剩的HBr。将全量移入分液漏斗分液后，丢弃水层，用10％氯化钠水溶液洗涤2次洗净。真空浓缩，得到2，3，4，6-四-O-苄基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(GalBr)的浆液。
2)向化合物G12(60.0g，68.6mmol)，四己基溴化铵(89.4g，206mmol)，分子筛4A(60g)的甲苯溶液(420ml)中，加入DMF(140ml)，接着加入GalBr(约137mmol)的甲苯溶液(250ml)，将混合物在室温搅拌72小时。向反应液中加入甲醇(12ml)，搅拌2小时。用硅藻土过滤后，用饱和碳酸氢钠水溶液，食盐水洗净后，用无水硫酸镁干燥，减压浓缩。向残渣中加入乙腈，搅拌2小时，得到沉淀。将所得沉淀真空干燥，得到干燥的粉末。将该产物用硅胶色谱纯化，用己烷∶乙酸乙酯(8∶1)作为洗脱液。产量70.9g(74％)。
24D+18.8°(c0.9，CHCl3)；mp74-75℃；FDMS m/z 1399(M+1)+；1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21-7.37(30H，m)，6.12(1H，d，J＝9.0Hz)，4.91(1H，d，J＝11.6Hz)，4.84(1H，d，J＝3.7Hz)，4.72-4.80(4H，m)，4.35-4.65(7H，m)，4.12-4.18(1H，m)，3.99-4.05(2H，m)，3.84-3.93(4H，m)，3.73(1H，dd，J＝3.7，11.0Hz)，3.47-3.51(2H，m)，3.42(1H，dd，J＝6.1，9.1Hz)，1.87-1.99(2H，m)，1.18-1.70(72H，m)，0.88(6H，t，J＝7.4Hz)。
(13)化合物KRN7000的合成将化合物G13(60.0g，42.9mmol)加入乙醇(960ml)中悬浮，向其中加入20％氢氧化钯(6.0g)的乙醇悬浮液。然后加入作为氢源的4-甲基环己烯(120ml，93.5mmol)，将混合物加热回流4小时后，过滤，除去催化剂。残渣用热乙醇洗净。将滤液在室温放置，过滤所得白色沉淀，减压干燥。将所得粉末悬浮于乙醇∶水(92∶8、3.5L)，边搅拌边加热溶解后，室温放置，再次沉淀。将沉淀液过滤，将滤饼真空干燥，得到白色粉末。产量35.0g(95％)。
23D+43.6°(c1.0，吡啶)；mp189.5-190.5℃；负FABMS m/z 857(M-H)-；IR(cm-1，KBr)3300，2930，2850，1640，1540，1470，1070；1H-NMR(500MHz，C5D5N)δ8.47(1H，d，J＝8.5Hz)，5.58(1H，d，J＝3.7Hz)，5.27(1H，m)，4.63-4.70(2H，m)，4.56(1H，m)，4.52(1H，t，J＝6.1Hz)，4.37-4.47(4H，m)，4.33(2H，m)，2.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25-2.34(1H，m)，1.87-1.97(2H，m)，1.78-1.85(2H，m)，1.62-1.72(1H，m)，1.26-1.45(66H，m)，0.88(6H，t，J＝6.7Hz)，13C-NMR(125MHz，C5D5N)δ173.2(s)，101.5(d)，76.7(d)，73.0(d)，72.5(d)，71.6(d)，71.0(d)，70.3(d)，68.7(t)，62.7(t)，51.4(d)，36.8(t)，34.4(t)，32.1(t)，30.4(t)，30.2(t)，30.03(t)，30.00(t)，29.93(t)，29.87(t)，29.81(t)，29.76(t)，29.6(t)，26.5(t)，26.4(t)，22.9(t)，14.3(q)。
实施例2O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-(2S，3S，4R)-2-氨基-N-[(R)-2-羟基二十四烷酰基]-1，3，4-十八烷三醇(S1140B-9)的分离及精制将冲绳县久米岛近海的海底水深15～25m处采摘的海绵的冷冻干燥粉末447.1g用氯仿和甲醇的混和液萃取，将萃取液减压浓缩得到51.28g的萃取物。将萃取物在乙酸乙酯和水之间分配后，上层和中间层用无水硫酸钠后，减压浓缩，分别得到18.37g和9.44g。将上层得到的部分在10％含水甲醇和正己烷之间分配所得到的醇层，与中间层得到的部分合并并浓缩后，反复用硅胶色谱纯化，在正相TLC上得到单一活性成分169.9mg。进一步用ODS-AM柱(YMC制造，250mm×20mm直径，甲醇，9.0ml/min)反相HPLC纯化(保留时间30.3分钟)，得到10.2mg纯化的标题化合物(S1140B-9)。另外，标题化合物也可以参照F.Cafieri等，Liebigs Ann.Chem.1995，1477-1481分离纯化。
负FABMS m/z 1007[(M-H)-]；IR；1HNMR(500MHz，C5D5N，24℃)δ(ppm)8.55(1H，d，J＝9.2Hz，NH)，5.60(1H，d，J＝3.7Hz，H1″)，5.57(1H，d，J＝3.7Hz，H1)，5.13(1H，m，H2)，4.75(1H，dd，J＝3.7，10.4Hz，H2″)，4.62(2H，m)，4.54(4H，m)，4.25-4.47(10H，m)，2.17(2H，m)，1.99(1H，m)，1.87(2H，m)，1.75(1H，m)，1.65(2H，m)，1.12-1.49(60H，m)，0.85(6H，m，terminal methyl)；13C NMR(125MHz，C5D5N，45℃)δ(ppm)175.5(s，C1′)，99.5(d，C1)，98.6(d，C1″)，76.7(d，C2″)，76.0(d，C3)，72.8(d，C4)，72.6(d，C5″)，72.6(d，C4″)，72.5(d，C2)，71.3(d，C3)，71.0(d)，70.8(d)，70.5(d，C2)，69.7(d，C3″)，68.6(t，C1)，62.7(t)，62.5(t)，51.2(t，C2)，39.4(t)，35.6(t)，33.7(t)，32.2(t)，30.5(t)，30.3(t)，30.1(t)，30.0(t)，29.7(t)，29.6(t)，26.7(t)，26.0(t)，23.0(t)，22.9(t)，14.3(q，terminal methyl)
实施例3下面的化合物是根据右侧的文献记载的方法制备的。
式(I)化合物与上述实施例中记载的化合物的对应，列于下列表1中。
表1
生物学试验药理试验例1KRN7000对NKT细胞抵抗肿瘤细胞的细胞毒素活性的增强作用作为本发明配糖体化合物的代表，使用实施例1的化合物(KRN7000)进行下列试验。
使用载体(含有0.025％ Polysolvate 20的生理盐水)或KRN7000100μg/kg对RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠(该小鼠的淋巴细胞部分不存在B细胞、T细胞和NK细胞，但存在很多NKT细胞)静脉内给药，24小时后分别摘取脾脏，按照常规方法制备脾脏细胞。RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠是删除RAG-1基因，强制表达Vα14和Vβ8.2基因制作的鼠(Kawano T.等.，Science，278，1626-1629(1997))。该鼠可从千叶大学医学部谷口克等处获得。这些脾脏细胞对于小鼠淋巴细胞瘤YAC-1细胞的细胞毒素活性用4小时-51Cr-释放法测定(Kobayashi，E.等.，Oncology Res.，7，529(1995))。结果列于图1。
如图1所示，用KRN7000给药鼠制备的脾脏细胞显示出对YAC-1细胞的细胞毒素活性明显高于用载体给药鼠制备的脾脏细胞的活性。
考虑到RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾脏淋巴细胞部分中，不存在下B细胞、T细胞和NK细胞，但存在大量NKT细胞，该结果显示KRN7000可增加脾脏NKT细胞对于肿瘤细胞的细胞毒素活性。
上述结果表明，KRN7000具有增强NKT细胞对肿瘤细胞的细胞毒素活性的作用。
药理试验例2KRN7000的脾脏NKT细胞增加作用使用载体(含有0.5％ Polysolvate 20的生理盐水)或1、10和100ng/kg KRN7000对C57BL/6小鼠(日本SLC(株))静脉内给药，24小时后分别摘取脾脏，按照常规方法制备脾脏细胞。将该脾脏细胞在塑料盘中培养30分钟，制备浮游的细胞。除去该浮游细胞中的B细胞制备淋巴细胞部分。该淋巴细胞中的T细胞、NK细胞、NKT细胞和Vα14+NKT细胞使用FITC标识抗TCRαβ单克隆抗体(Pharmingen社)、Cychrome标识的抗NK1.1单克隆抗体(Pharmingen社)、和PE标识的抗Vα14单克隆抗体用3-color FACS分析法进行分析(图2)。抗Vα14单克隆抗体是通过将抗Vα14单克隆抗体产生杂交瘤(CMS-1，可从千叶大学医学部，谷口克等获得)移植到裸鼠中，回收腹水纯化得到的。图2A和B中，淋巴细胞部分中的NK1.1细胞、TCRαβ细胞和Vα14细胞的量是用标识的抗体对这些细胞的荧光强度表示的。
如图2A所示，使用100ng/kg KRN7000给药时，与用载体给药相比，可观察到脾脏淋巴细胞部分中的NK1.1+TCRαβ+细胞的比例显著增加。
另外，如图2B所示，检测NK1.1+TCRαβ+细胞中的Vα14+细胞的比例时，可看到用上述剂量的KRN7000给药时与用载体给药相比，NK1.1+TCRαβ+细胞中的Vα14+细胞的比例明显增加。
另外，如图2C所示，使用10和100ng/kg的KRN7000给药的脾脏淋巴细胞部分中的NK细胞数虽然与用载体给药的小鼠相同，但脾脏淋巴细胞部分中的细胞数和脾脏淋巴细胞部分中的T细胞数与用载体给药的小鼠相比增加了约2倍。另外，脾脏淋巴细胞部分中的Vα14-NKT细胞和Vα14+NKT细胞数与用载体给药的小鼠相比增加了3倍以上(省略数据)和4倍以上。
另外，再进行肝脏中T细胞、NK细胞、Vα14-NKT细胞和Vα14+NKT细胞的分析，与脾脏细胞的情况相同，可看到Vα14-NKT细胞和Vα14+NKT细胞数显著增加(省略数据)。
以上结果表明，KRN7000具有增加生物体中NKT细胞数，特别是Vα14+NKT细胞数的作用。
药理试验例3KRN7000对MRL lpr/lpr小鼠的淋巴肿胀抑制作用将雌性MRL lpr/lpr小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))10只分为1组进行下列试验。对6周龄时买入的21只MRL小鼠进行观察，达到10周龄时，发现1只小鼠的腋下淋巴结肿胀。因此，将其余20只鼠随机分为2组。在鼠达到11周龄时，开始使用载体(含有0.025％ Polysolvate 20的生理盐水)或KRN7000(100μg/kg)对上述两组鼠一周两次(星期二和星期五)腹腔内给药。1周两次，对腋下和鼠腹股沟部的淋巴结进行诊断，观察淋巴肿胀随时间的进展。各淋巴结按照其大小分为-(0)、+(1)、++(2)、+++(3)四个级别，各小鼠的左右腋下和鼠腹股沟部的淋巴结的级别合计作为淋巴肿胀的指数，列于图3。
如图3A所示，KRN7000给药的MRL小鼠，随年龄增长，腋下淋巴肿胀明显被抑制了。另外，如图3B所示，MRL小鼠随年龄增长，鼠腹股沟部的淋巴肿胀也明显被抑制了。即，可知KRN7000具有对MRL小鼠淋巴肿胀抑制作用。
MRL小鼠是人全身性红斑狼疮的模型小鼠(Sakamoto，A.Clin.Immunol.，28，1558(1996))。因此，以上结果显示，KRN7000对治疗全身性红斑狼疮有效。
药理试验例4KRN7000对MRL lpr/lpr小鼠生存率的影响将雌性MRL lpr/lpr小鼠10只分为1组进行下面的试验。将4周龄时购买的MLR鼠随机分为2组(10只/组)，达到5周龄时开始，使用载体(含有0.025％ Polysolvate 20的生理盐水)或KRN7000(100μg/kg)对上述两组鼠一周两次腹腔内给药。每天观察各鼠的生死。
如图4所示，载体给药组，在给药开始后250天以内全部死亡，而KRN7000给药组，在给药350天后，仍有3只存活。
药理试验例5KRN7000对4％DSS诱发的小鼠结肠炎的抑制作用将CDF1小鼠(6周龄，雌性)(日本SLC(株))10只分为1组进行下面的试验。将葡聚糖硫酸钠以4％(w/v)的比例溶于饮用水制得4％DSS溶液作为饮用水开始喂鼠之日定为第0日。将鼠分为使用KRN7000 100μg/鼠第1、5、9日腹腔内给药组，使用IL-12 1μg/鼠第1、3、5、7、9日腹腔内给药组，和无处理组(对照组)3组，每天对各鼠进行体重的测定并观察生死。各组的体重变化如图5A所示，生存时间如图5B所示。
如图5A所示，IL-12给药组与对照组相比，很早开始就观察到了体重的减少。但是，KRN7000给药组与对照组相比，体重减少的开始时间明显延迟了。
另外，如图5B所示，IL-12给药组与对照组相比，鼠的生存期明显缩短了。但是KRN7000给药组与对照组相比，可看到生存期明显延长了。
4％DSS诱发鼠结肠炎是人溃疡性结肠炎的模型(Elson，C.等。，Gastroenterology，109，1344(1995))。因此，以上结果显示，KRN7000对于溃疡性结肠炎的治疗是有效的。
药理试验例6具有α-糖基神经酰胺结构的化合物对NKT细胞增殖的促进作用使用药理试验例1中所示RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾脏细胞，检测具有α-糖基神经酰胺结构的化合物对NKT细胞增殖的促进作用。
将RAG-1KO/Vα14tg/Vβ8.2tg小鼠的脾脏细胞按照常规方法制备脾脏细胞。将该脾脏细胞以2×106个/ml悬浮于添加有10％FCS的1640培养基中，向96穴圆底板中每孔加入100μl。如图12所示，将10种具有α-糖基神经酰胺结构的化合物以最终浓度1、10、100ng/ml加入上述板中，培养2天。加入[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/孔)，16小时后收集细胞，用液体闪烁计数器测定细胞内摄取的[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷的量。结果列于表2。
表2
如表2所示，上述全部化合物，在100ng/ml的浓度时与添加载体组相比显示出具有明显的NKT细胞增殖促进作用。
以上结果表明，具有α-糖基神经酰胺结构的配糖体和糖部分与其它糖结合的具有α-糖基神经酰胺结构的配糖体对于自身免疫疾病的治疗是有效的。
药理试验例7KRN7000对实验的自身免疫性脑脊髓炎发病的抑制将C57BL/6小鼠(6周龄、雌性)10只分为1组进行以下的试验。将200μg的髓磷脂少突神经胶质糖蛋白(Myelin OligodendrocyteGlycoprotein)的部分肽(MOG33-55)和500μg的结核菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra加入不完全的弗氏佐剂制备乳液，在第0日和7日对各鼠皮下注射进行免疫。接着，在第0日和第2日，使用百日咳毒(Pertussis roxin)对小鼠腹腔内给药，诱发小鼠的实验的自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。将鼠分为使用KRN 700020μg/kg第1、5、8、12、15日腹腔给药组和载体(含有0.5％Polysolvate 20)给药组2组，每天观察各小鼠的EAE发病程度。各组各小鼠的EAE发病程度如图6所示。
如图6所示，载体给药组(图6A)，从最初的MOG肽免疫开始15天内全部鼠都出现了EAE发病，其中80％的小鼠死亡。但是，KRN7000给药组(图6B)，10只小鼠中有4只出现EAE发病，其中只有2只死亡。
由以上结果可知，KRN7000可抑制小鼠中EAE的发病。该EAE是人多发性硬化症(MS)的模型(Autoimmune Disease Models，editedby Cohen I.R.& Miller A.Acadenic Press，Inc.(1994)，Chapter1，ppl)。因此，以上结果显示，KRN7000对于多发性硬化症的治疗是有效的。
药理试验例8KRN7000对小鼠糖尿病发病的抑制作用将NOD/ShiJic(NOD)小鼠(6周龄，雌性)(日本Clea(株))10只1组进行下面的试验。NOD小鼠随着年龄的增长会出现糖尿病。将鼠分为KRN7000 100μg/kg对7周龄的小鼠每周2次腹腔内给药组和无处理对照组2组，每周检查各小鼠有无糖尿病的发病。血糖值用Glucometer(Miles三共)测定，连续两次显示200mg/dL以上则认为有糖尿病。各组中糖尿病发病鼠的比例在图7中显示。
如图7所示，无处理对照组，达到35周龄时，有80％的小鼠出现糖尿病的发病，但KRN7000给药组，在达到35周龄时，1只糖尿病发病鼠也没有。
从以上结果可知，KRN7000可抑制NOD小鼠糖尿病的自然发病。该NOD小鼠是人I型糖尿病的模型(Autoimmune Disease Models，edited by Cohen I.R.& Miller A.Acadenic Press，Inc.(1994)，Chapter 9，pp149)。因此，以上结果显示KRN7000对I型糖尿病的治疗是有效的。
药理试验例9KRN7000对Vα24+NKT细胞增殖的促进作用将健康人末梢血单核细胞用添加10％FCS的AIM培养基，加入GM-CSF(400U/ml)、IL-4(200U/ml)和KRN7000(100ng/ml)培养4天，制备抗原呈递细胞。
将该抗原提示细胞作为刺激细胞，同样的人末梢血单核细胞作为应答细胞，进行自身混合淋巴细胞反应(autologous mixed leukocytereactionMLR)。培养10天后，添加IL-2(5U/ml)，接着，回收细胞。再进一步回收细胞中的CD4、CD8双负细胞、分析其表现型。表现型的分析，对于显示各种表现型的细胞使用标识的抗体荧光强度表示。其结果，如图8所示。
如图8所示，表明该细胞群中，存在大量具有CD4-CD8-CD3+Vα24+Vβ11+NKRP1A+表现型的细胞(Vα24+NKT细胞的亚型)。
上述细胞群使用IL-2(5U/ml)培养，增殖Vα24+NKT细胞，用作下面自身混合淋巴细胞反应中的应答细胞。向同样末梢血单核细胞添加GM-CSF+IL4和KRN7000 100ng/ml、AGL-583(β-半乳糖基神经酰胺、β-GalCer)或0.1％DMSO(载体)，培养4天，制备抗原提示细胞。将该抗原提示细胞作为刺激细胞进行自身混合淋巴细胞反应。培养2天后，添加[3H]脱氧胸腺嘧啶核苷(0.5μCi/ml)，8小时后收集细胞，用液体闪烁计数器测定细胞内摄取的[3H]脱氧胸腺嘧啶苷的量。结果如图9所示。
如图9所示，用载体和β-半乳糖基神经酰胺处理的抗原呈递细胞对Vα24+NKT细胞的增殖没有任何影响，而用KRN7000处理的抗原提示细胞，可观察到显著的依存于抗原呈递细胞的数目的Vα24+NKT细胞的增殖促进作用。而且，使用抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d抗体，对上述用KRN7000处理的抗原呈递细胞的Vα24+NKT细胞的增殖促进作用进行阻碍试验时，只有抗CD1d抗体可阻碍Vα24+NKT细胞的增殖促进作用(数据省略)。
从以上结果可知，KRN7000对相当于鼠Vα14+NKT细胞的人Vα24+NKT细胞的增殖具有促进效果。最近有报道说在I型糖尿病发展的患者中Vα24+NKT细胞的数目极少(Wilson等.，Nature，391，177(1998))，再考虑到药理试验例3、7和8的结果，上述结果强有力地显示出，KRN7000对于与人Vα24+NKT细胞相关的全身性红斑狼疮、全身性强皮症、多发性硬化症或I型糖尿病等自身免疫疾病的预防和治疗中是有效的。
药理试验例10KRN7000对流产的促进作用使用C57BL/6小鼠(日本SLC(株))进行试验。将观察到阴道塞的日子定为第0日。将妊娠小鼠6只1组，分为用KRN7000 150μg/kg，第7，8，9天静脉给药组和PBS(磷酸盐缓冲的盐水)7，8，9天静脉给药组。在第12天剖出子宫，观察胎儿的状态。
PBS给药组，在总共53只胎儿(embryo)中，有3只死亡吸收胎儿，是5.6％的流产率，与C57BL/6小鼠的自然流产率(约5％)很一致。
KRN7000给药组，在总共36只胎儿中，有12只死亡吸收的胎儿，流产率是33％，与无处理的对照组相比具有明显高的值。另一方面，当使用等量的KRN7000以同样方式对欠缺Vα14+NKT(Jα281KO)小鼠(Kawano T.等.，Science，278，1626-1629(1997))给药时，流产率是5.3％，与PBS给药组的流产率(5.0％)相同。欠缺Vα14+NKT鼠可从千叶大学医学部、谷口克等获得。
考虑到KRN7000具有NKT细胞活化作用，表明NKT细胞的活化与流产促进作用有良好的相关关系。
另外，已知IL-12也具有NKT细胞活化作用，但使用IL-12以同样的量，同样方式对小鼠((CBA×DBA/2)F1)给药时，可看到34％的比例的流产。该结果强有力地支持了上述相关关系。
从以上结果可知，KRN7000和I L-12具有流产促进作用。
药理试验例11单次给药的急性毒性试验对小鼠使用实施例1的化合物静脉内给药。其结果，LD50值是10mg/kg以上。另外，在10mg/kg不显示特别的症状且是低毒性的。
权利要求
1.式(I)化合物或其盐或其溶剂化物在制备NKT细胞活化剂中的应用 其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整数，R2是选自下列(a)～(e)的取代基，其中，Y是5～17中的任一整数，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、且R3～R9是下列i)～ii)中任一定义的取代基i)R3、R6和R8是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)中的取代基R5是OH，或选自下面(E)和(F)的取代基 R7是OH或选自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH、或选自下面(A’)～(D’)的取代基ii)R3、R6和R7是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)的取代基R5是OH、或选自下面(E)和(F)的取代基 R8是OH、或选自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH或选自下面(A’)～(D’)的取代基
2.权利要求1中记载的应用，其中式(I)化合物中，R3和R6表示H，R4表示OH或(A)～(D)中的任一取代基，R5表示OH或(E)或(F)表示的取代基，R7和R8分别表示H或OH，但R7和R8不表示同一取代基，R9表示CH2OH、CH3、H、或(A’)～(D’)中任一取代基。
3.权利要求1中记载的应用，其中式(I)化合物中，X是21～25的整数，R2表示取代基(b)，式中Y是11～15的整数。
4.权利要求1中记载的应用，其中式(I)化合物中，X是9～13的整数，R2表示取代基(a)，式中Y是11～15的整数。
5.权利要求1中记载的应用，其中式(I)化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰氨基-3，4-十八烷二醇。
6.活化NKT细胞的方法，包括在式(I)化合物或其盐或其溶剂化物存在下，体外培养包含NKT细胞的单核细胞部分 其中R1是H或OH，X是7～27中的任一整数，R2是选自下列(a)～(e)的取代基，其中，Y是5～17中的任一整数，(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3、且R3～R9是下列i)～ii)中任一定义的取代基i)R3、R6和R8是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)中的取代基R5是OH，或选自下面(E)和(F)的取代基 R7是OH或选自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH、或选自下面(A’)～(D’)的取代基ii)R3、R6和R7是H时R4是H、OH、NH2、NHCOCH3、或选自下面(A)～(D)的取代基R5是OH、或选自下面(E)和(F)的取代基 R8是OH、或选自下面(A)～(D)的取代基R9是H、CH3、CH2OH或选自下面(A’)～(D’)的取代基
7.权利要求6中记载的方法，其中单核细胞部分是在抗原呈递细胞存在下培养的，所述抗原呈递细胞呈递式(I)化合物或其盐或其溶剂化物。
8.权利要求7中记载的方法，其中单核细胞部分是在除抗原呈递细胞外还存在IL-2的条件下培养的，所述抗原呈递细胞呈递式(I)化合物或其盐或其溶剂化物。
9.权利要求7或8中记载的方法，其进一步包括，在培养单核细胞部分之前，在式(I)化合物或其盐或其溶剂化物、GM-CSF和IL-4存在下，通过体外培养单核细胞部分，制备呈递式(I)化合物或其盐或其溶剂化物的抗原呈递细胞。
10.权利要求6～9中任一项中记载的方法，其中单核细胞部分是从人外周血得到的。
11.权利要求6～10中任一项中记载的方法，其中式(I)化合物中，R3和R6表示H，R4表示OH或(A)～(D)中的任一取代基，R5表示OH或(E)或(F)表示的取代基，R7和R8分别表示H或OH，但R7和R8不表示同一取代基，R9表示CH2OH、CH3、H、或(A’)～(D’)中任一取代基。
12.权利要求6～10中任一项中记载的方法，其中式(I)化合物中，X是21～25的整数，R2表示取代基(b)，式中Y是11～15的整数。
13.权利要求6～10中任一项中记载的方法，其中式(I)化合物中，X是9～13的整数，R2表示取代基(a)，式中Y是11～15的整数。
14.权利要求6～10中任一项中记载的方法，其中式(I)化合物是(2S，3S，4R)-1-(α-D-吡喃半乳糖基氧)-2-二十六烷酰氨基-3，4-十八烷二醇。
全文摘要
本发明提供了NKT细胞活化剂，自身免疫疾病(例如，全身性红斑狼疮、全身性强皮症、溃疡性结肠炎、脑脊髓炎、多发性硬化病、和I型糖尿病等)的治疗剂，和堕胎剂。按照本发明的药剂含有下式(I)的α－糖基神经酰胺或其盐或其溶剂化物作为有效成分。
文档编号C12N5/08GK1768759SQ20051009270
公开日2006年5月10日 申请日期1998年4月10日 优先权日1997年4月10日
发明者谷口克, 河野铁, 肥塚靖彦 申请人:麒麟麦酒株式会社