专利名称：自动造血干细胞培养系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种生物细胞培养系统，尤其涉及一种人体干细胞或/和人体造血干细胞体外扩增培养装置，更具体地说，这是一种干细胞和造血干细胞自动培养和扩增的装置，在该装置内，各种不同分化程度的干细胞和造血干细胞被同步培养，自动调节和控制培养媒介中的营养成份和生长因子保持在适当的水平，自动排泄培养中代谢产物，这种在体外同步培养多种类型干细胞和造血干细胞的装置和方法，可以应用于临床生物细胞治疗和造血干细胞移植术。
背景技术：
研发在体外大量生产人体骨髓以及其他造血干细胞的系统长久以来就被生物科学家所渴望，因为这样的系统不仅能满足广泛而多种多样的临床需要，同时也能为科学研究以及应用研究提供重大帮助，其应用如下1造血干细胞分化的基础动力学研究2改善自体或异体骨髓移植3排空或去除任何不希望在骨髓移植中出现的细胞，如T细胞或其他致命的细胞4血液细胞系统的基因治疗5改善人体自体外周血干细胞移植、净化干细胞中混杂的肿瘤细胞6改善脐血干细胞移植、扩增脐血干细胞数量，以满足成人肿瘤治疗7用于诱导分化树突状细胞，开展树突状细胞为基础的肿瘤免疫治疗及肿瘤疫苗治疗8大量产生人体造血干细胞，如CD34+细胞，以供临床或研究使用9大量产生各类成熟血细胞，如红细胞、血小板。
尽管长期造血干细胞培养(“Long-term Hematopoietic culture”“LTHBMC”)在80年代后期被提出，近来的发展已经大幅的改进了原来的方法，并已产生革命性的改变。
然而，这些改进仍然是在标准实验室规模的组织培养设备下实施的亚临床数量骨髓细胞或其他造血干细胞的方法。
一系列的研究已经证明这些近来的改进是成功的，支持基质细胞层的功能已经被显示，培养媒介的灌注率或培养媒介的交换顺序受到特定影响，代谢功能，成长，也许更重要的是成长因子的分泌都已经被证明受到正常人体骨髓纤维母细胞的培养媒介交换率影响。
在体外培养环境中，基质细胞支持人体造血干细胞的能力被证明可以被快速地媒介培养交换率所提高，在快速培养媒介交换和高密度的细胞中，LTHBMC可以支持大量稳定产生造血干细胞中的未成熟细胞达20周，这些已经形成的证据证明，这些培养环境下，可以稳定大量产生造血干细胞。
正确地采用可以溶解的细胞生长因子可以进一步改善这些培养的方法。
引人注意和意味深长的需求存在于这些提出的方法之中，即只有发展出能够实施临床数量的组成方法和装置才能实现上述所需求的应用。
在过去的生物反应器设计中，尽管细胞收获程序被作为重要的方面考虑，但是提出的方法仍然是广开口式的结构，在收获细胞时必须停止培养过程，而且必须暴露培养腔室在大气中，这种结构易于构成培养腔室的污染。
更进一步，生物反应器需要保持一种内部的平衡状态，尤其在复杂的原始细胞培养过程中，人类干细胞或人类造血干细胞对他们的动力非常敏感(即气体灌注率/营养液灌注率/生长因子灌注率)，同时对上述物质的供应和去除也非常敏感，对他们的化学环境同样敏感，目前的生物反应器中，没有任何设计能满足上述要求，从而保持培养内环境平衡及稳定，尤其在原始细胞培养过程中。
目前的设计中还未能提出一种方法在不中断培养的状态下收获细胞，同样也没有一种设计能够保持培养内环境保持平衡。提供稳定的气体，液体灌注率，同时具备上述两种优势的方法更未发现。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种全封闭式、高灌注率、高媒介培养交换率，在不中断培养的状态下收获细胞的造血干细胞培养装置，为培养内环境保持平衡，提供稳定的气体和液体灌注率。
为了实现本实用新型的目的，本实用新型提出一种新型的培养装置。其系统构成由培养腔室，上、下两层气体腔室以及四周四个弃液腔室，自动监测及控制系统，出入口及其手动阀门，电磁阀，蠕动泵，气体供应系统等部份组成。
●培养腔室■为细胞生长场所，培养腔室上、下两层均为气体半透膜，半透膜表面经过电火花处理(corona treatment)因而有较强的细胞粘附特性，透气半透膜背靠筛孔板(板壁上有大量孔)即可起到支撑半透膜，因而增强压力抵抗能力的功能，但是又因为其筛孔结构，又能广泛进行气体交换，筛孔板和气体半透膜之间用无毒元素、生物相容性良好的硅橡胶垫圈隔离并固定。
■培养腔室四侧壁均为超微滤膜(NWCO为50,000)，可以溢出细胞代谢产物及部份水份，但能保留所有细胞大部份营养成份，及细胞内产品，用来进行持续灌注时，进行营养交换。
■培养腔室右侧壁留有进出口，以供输入细胞营养液，抽样监测，持续灌注及收获细胞等用途。
■根据临床用途，培养腔室大小可以设计不同尺寸，从50ml～250ml。
■培养腔室为扁平状，宽度和长度是高度的数十倍，有利于气体弥漫及节省营养液、培养液(高度不超过4mm)。
■培养腔室内有PH、葡萄糖(溶氧)(DO)等传感器，及时监测、控制培养条件及培养环境。
■培养腔室下方有称重量的电子重量计，随时测量重量(培养容器的重量为恒定数，可间接判断培养腔室内培养液多少)。
■培养腔室为全封闭系统，仅仅可以透过半透膜进行气体交换，及其通过超微滤膜进行营养交换，各类微生物无法穿透。
●气体腔室■在培养腔室上、下两层(顶层和底层)，均为气体腔室，气体腔室的底部(上层)或顶部(下层)，为筛孔板，气体腔室为一体化结构，其筛孔板通过硅橡胶(上、下两层)，与半透膜以及侧壁(培养腔侧壁)相连接(通过长螺丝相连接)。
■气体腔室有气体入口和出口，已混合的氧，二氧化碳通过入口流入气体腔室，然后其中部份通过气体半透膜弥散至培养腔，其余部份通过出口流出。
■气体腔室内有O2及CO2传感器，持续监测气体腔室O2及CO2的含量，并通过自动调节系统调节O2及CO2含量。
●弃液腔室(营养交换液腔室)■位于培养腔室四个侧壁，侧壁筛孔板紧贴超微滤膜(超微滤膜用粘合剂，无机无毒粘合剂，将超微滤膜粘贴在侧壁筛孔板上，也可以用无毒塑料制造的螺丝，用无毒硅橡胶垫圈固定超微滤膜在筛孔板上)。
■弃液腔室有侧壁(与培养腔室入口同方向)有一个出口(位于侧板底部)，营养交换液可以从出口流出。
■弃液腔室四周底层板有一定坡度(倾斜度)，向出口方向倾斜，以使营养交换液流出。
●培养腔室出入口■位于培养腔室右侧壁，中央部位。
■用于培养腔室内容物的灌注和抽出。
■出入口处装置一个两方向的手动阀门，全部封闭，系统关闭(有帽盖封闭)。
向下通行(有帽盖封闭，帽盖为一次性使用)用于用注射器输入微量细胞生长因子等成份，在培养中抽取部份培养液观察细胞生长情况，收获细胞(与TFF自动细胞收获系统相连接)。
向上通行(管道上方有电磁阀门控制)用于灌注接种培养细胞，培养中持续灌注营养液，灌注缓冲液用于细胞收获。
●弃液室出口■位于弃液室右侧壁靠近底部位置，(与培养腔室入口同方向)。
■用于排弃营养交换液。
■其出口为弃液腔室最低位置，弃液腔室底部向出口方向倾斜，营养交换液通过重力作用流出出口。
■其出口管道上接有弃液袋，出口管道有电磁阀或手动阀门，可以封闭。
■出口管道与蠕动泵相连，必要时可以抽吸。
●气体腔室出入口■气体腔室入口位于气体腔室右侧壁，气体腔室出口位于气体腔室左侧壁。
■气体腔室出入口管道处均有电磁阀门控制，可以控制其开、关及其流量和流速。
■气体腔室出入口均装有Pall公司的气体过滤装置，过滤微生物。
●多参数监测及警报系统在培养过程中随时监测多项参数。
■O2和CO2流速、压力及流量。在O2和CO2四个输入管道内装有流量表，数字化监测气体流量、流速，设定报警装置。
■O2和CO2含量。在气体腔室内装有O2及CO2传感器可以随时监测气体腔室内O2及CO2含量，并设置报警及自动调节。
■PH监测。PH电极装在培养室内，随时监测营养液的PH值。
■葡萄糖监测。采用One Touch葡萄糖监测传感器装在培养腔室内。
■细胞监测。采用(BDS)自动细菌检测装置定期检测培养液中细菌(抽液显微镜检查同时)。
■营养液的灌注量监测。在培养装置下方，装置一个数字化重量计，随时测量装置重量，间接计算营养液灌注量。
■自动灌注流量监测。在入口管道上装有流量计可以监测灌注流量，同时蠕动泵的速度数字化显示其转速。
■以上各项参数监测均为数字化监控。用计算机及时记录所有参数。
■根据培养要求，可以预设各种指标，一旦触及这些指标，会自动报警，声光报警。
■与手提无线电话相连，如有任何警报，会自动拔号，并在指定电话号码上留言。(或在Palm型手提电话装置上留信息)，可以及时通知在外面的实验室工作人员及时回实验室。
●自动控制系统■温度自动控制系统。自动恒温控制在设定的培养温度，如有变化自动报警。
■O2及CO2气体自动控制。根据O2及CO2传感器监测结果自动调节。
■营养液持续自动灌注控制。数字化显示及控制的蠕动泵自动控制，根据自动监测的灌注量反馈性调节控制。
■自动控制可以采用微电脑处理芯片(DSP)或采用台式电脑(触摸屏电脑)控制。(自动控制系统可以采购成品(bioprocess controller)，国产或进口)。
■显示。可以用大屏幕液晶显示及触摸屏监测器显示。
●蠕动泵。采用数字化控制蠕动泵。数字化显示及数字化控制，自动调节速度。
●电磁阀。采用电磁挤压阀，由自动控制系统控制。
●自动细胞收获系统。采用TFF自动细胞收获系统来收获细胞。
●根据所采用的材料不同，可分为■一次性使用装置。所用材料为无毒硬塑料，模具压制，一次性使用。预先消毒(使用后弃置)，消毒后包装在无菌包装中备用(高压蒸汽消毒)，气体半透膜与超微滤膜与塑料筛孔板连接采用粘贴剂粘贴方式。
■重复使用装置。所用材料为金属材料(如不锈钢等)。气体半透膜与超微滤膜采用硅橡胶垫片+螺丝连接。使用前需装置气体半透膜和超微滤膜，并需在使用前高压蒸汽消毒。
●适用于多种细胞培养，尤其临床生物细胞治疗应用。
■造血干细胞体外培养、扩增(骨髓、外周血、脐血)■树突状细胞体外扩增诱导(骨髓、外周血、脐血、CD34+来源或monocyte来源)■自体肿瘤疫苗制备。
■自体或异体过滤免疫细胞治疗(LAK、TIL、CIK、TCK等细胞治疗)■单克隆抗体制备；血小板、红细胞体外扩增。
●组合式多单元细胞培养系统。
多个单元细胞培养系统可以组合而成组合式多单元细胞培养系统，可以是四单元组合式细胞培养系统，八单元组合式细胞培养系统，十六单元组合式细胞培养系统，共同享用一套自动控制系统，一组O2、CO2传感器及控制系统。一组自动持续灌注式系统。培养装置的单位成本大幅减少，效率提高，有利于大规模区域性实验室使用，或大型医院使用。
本实用新型的有益效果是提供一种结构简单、实用方便、自动控制的造血干细胞培养系统，极大简化临床应用中造血干细胞体外扩增过程，减少标本的污染率，提高移植成功率。
以下结合附图对本实用新型作进一步说明
图1是本实用新型装置剖视图图2是气体腔室示意图图3是本发明装置俯视图图4是侧板示意图图5是本发明装置连接示意图。
图6是组合式多单元细胞培养系统示意图。
具体实施方式
图1中101-缓冲液，102-营养液(持续灌注)，103-接种细胞，104-蠕动泵(带帽盖，手动双向调节阀门)，105-注射收获/微量注射/抽液口，106-O2CO2入口，107-O2CO2传感器，108-气体腔室，109-O2CO2出口，110-弃液腔，111-筛孔板，112-超微滤膜，113-培养腔室，114-PH传感器，115-葡萄糖传感器，116-气体腔室，117-筛孔板，118-气体半透膜。
图2中201-气体腔室，202-螺孔(带内螺丝)，203-筛板孔。
图3中304-液体入口，305-O2CO2入口，306-C2CO2传感器，307-气体半透膜，308-气体腔室，309-O2CO2出口，310-弃液室，311-筛板，312-超微滤膜，313-PH传感器，314-葡萄糖传感器，316-培养腔室，317-气体腔室，318-弃液出口，319-筛板。
图4中401-螺孔(带内螺纹)，402-侧壁筛孔板，403-超微滤膜。
图5中501-气体腔室，502-气体腔壁，503-硅橡胶垫圈，504-气体半透膜，505-硅橡胶垫圈，506-侧壁板，507-侧壁筛孔板，508-筛孔板，509-气体腔室，510-气体腔壁，511-气体半透膜，512-垫圈，513-侧壁板。
图6中601-弃液，602-营养液，603-气体入口管道，604-气体混合及气体控制装置，605-O2和CO2气瓶，606-气体传感器，607-空气过滤器，608-气体出口管道。
权利要求1.一种自动造血干细胞培养系统，其特征在于自动造血干细胞培养系统由培养腔室，上、下两层气体腔室以及四周四个弃液腔室，自动监测及控制系统，出入口及其手动阀门，电磁阀，蠕动泵，气体供应系统组成。
2.按照权利要求1所述的自动造血干细胞培养系统，其特征是培养腔室上、下两层均为气体半透膜，半透膜表面经过电火花处理，透气半透膜背靠筛孔板，筛孔板和气体半透膜之间用生物相容性良好的硅橡胶垫圈隔离并固定。
3.按照权利要求1所述的自动造血干细胞培养系统，其特征是弃液腔室位于培养腔室四个侧壁，侧壁筛孔板紧贴超微滤膜，弃液腔室有侧壁，位于侧板底部有一个出口，营养交换液从出口流出，弃液腔室四周底层板有一定坡度，向出口方向倾斜，以使营养交换液流出。
4.按照权利要求1所述的自动造血干细胞培养系统，其特征是设置的多参数监测及警报装置在培养过程中可随时监测多项参数，在O2和CO2四个输入管道内装有流量表，在气体腔室内装有O2及CO2传感器，在培养室内装PH电极，在培养腔室内装葡萄糖监测传感器，在培养装置下方，装置一个数字化重量计，在入口管道上装有流量计。
5.按照权利要求1所述的自动造血干细胞培养系统，其特征是自动控制采用微电脑处理芯片或采用台式电脑控制，用大屏幕液晶显示及触摸屏监测器显示。
专利摘要本实用新型涉及一种生物细胞培养系统，尤其涉及一种人体干细胞或/和人体造血干细胞体外扩增培养装置，更具体地说，这是一种干细胞和造血干细胞自动培养和扩增的装置，在该装置内，各种不同分化程度的干细胞和造血干细胞被同步培养，自动调节和控制培养媒介中的营养成份和生长因子保持在适当的水平，自动排泄培养中代谢产物，这种在体外同步培养多种类型干细胞和造血干细胞的装置和方法，可以应用于临床生物细胞治疗和造血干细胞移植术。
文档编号C12M3/00GK2923715SQ2005200436
公开日2007年7月18日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者高春平 申请人:高春平