专利名称：一种细胞因子在抗结核感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于感染免疫中细胞因子的应用领域。更具体涉及一种细胞因子在抗结核感染中的应用，还涉及一种细胞因子真核表达载体的制备及这种载体能抵抗结核分枝杆菌标准株H37Rv对动物的感染。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染人体导致的结核病是一种严重危害人民身体健康的慢性传染病。结核病是历史上患病率及死亡率最高的疾病之一。上世纪50年代以来，结核病的流行在一定程度上得到了控制。80年代中期以来，由于耐药结核菌的流行和艾滋病的传播蔓延，耐多药结核病(MDR-TB)流行等因素，，使一些已经控制了结核病疫情的国家出现了疫情进一步加重或扩散流行的局面，结核病疫情又有进一步抬头的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，20亿人，即相当于全球目前总人口有近三分之一的人，已感染结核杆菌。在感染结核杆菌者中，每10个人中有1人将患活动结核病，活动性肺结核病人达2000万，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，新增患者880万人。每年全球发生425000例新的耐多种药物型结核病例，前苏联和中国的发病率最高，其新病例中有多达14％的病例使用标准药物治疗无效。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制的传染病之一。我国是结核病高负担国家，国务院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。中国结核病人数位居世界第二，仅次于印度。如2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，中国现有活动性肺结核病人451万，菌阳性肺结核病人196万，每年死亡人数约13万，在传染病中居首位，已经超过肝炎成为中国危害最严重的传染病。
发明内容
本发明的目的是在于制备一种能在真核细胞内表达的，携带有新型细胞因子白细胞介素24cDNA序列的载体，细胞因子白细胞介素24cDNA的载体作为制备治疗或预防结核杆菌感染药物中的应用。
本发明利用的目的基因人白细胞介素24基因序列已在GeneBank上公开(NM006850)，人白细胞介素24基因位于人染色体1q32-1q41，由7个外显子和6个内含子组成，有1个编码206个氨基酸的完整开放读码框，表达的分子量为23.8KD，N-糖基化位点位于第85、99、126氨基酸处。首次将细胞因子人白细胞介素24(IL-24)c D N A注射动物体内，发现了具有抵抗结核杆菌感染的作用，在国内外首次发现细胞因子cDNA对小鼠感染人结核杆菌标准株H37Rv后具有保护作用。
加强对结核病的研发力度，急待研制新型抗结核新药，以便对该病进行有效的治疗和预防，具有巨大的研究价值和社会效益。
由于人小分子细胞因子作为人体自身成分，可调节机体的生理功能，还具有抗肿瘤功能，在很低剂量即可发挥作用，疗效显著，没有免疫原性，无或副作用较小。临床应用前景广阔。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案A、PCR法构建重组表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24根据人IL-24GeneBank序列(NM006850)设计引物，上游引物含有NheI酶切位点；下游引物含有HindIII酶切位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。以插入人完整编码区基因的质粒pEGFP-C1-IL-24(已公开见参考文献中国免疫学杂志200521(10)760-763；中风与神经疾病杂志2005 22(2)104-106)为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA回收试剂盒回收纯化。将纯化的PCR产物和载体pcDNA3.1/myc-His(-)A(已公开见参考文献中国生物化学与分子生物学报200420(3)335-340)用NheI和HindIII(Fermentas MBI)双酶切后，分别回收酶切产物，在T4DNA连接酶(MBI)作用下定向连接IL-24片段至pcDNA3.1/myc-His(-)A，将连接产物转化入感受态细胞DH5α(已公开见参考文献中华神经外科杂志2004 20(1)48-50)中，在LB(含氨苄抗菌素)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，摇菌培养后小量提取质粒，采用NheI和HindIII双位点单、双酶切鉴定。挑取阳性克隆，送交北京华诺公司测序。
B、免疫印迹法(western blot)及激光扫描共聚焦显微镜来证实质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24在小鼠体内外的表达(1)在细胞培养瓶中培养鼠结肠癌细胞CT26(已公开见参考文献生物医学工程学杂志2004；21(6)897～900)，用lipofectamineTM2000(Invitrogen)把鉴定正确的质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，pcDNA3.1/myc-His(-)A转染到CT26细胞，48小时后收获细胞上清，免疫印迹法(Western blot)检测IL-24的表达；(2)抽提质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A和pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，，每只小鼠分别于胫前肌注射质粒及生理盐水(NS)，在注射后第7天取小鼠胫前肌，胫前肌分两部分，一部分置于4％多聚甲醛中固定，另一部分按每10mg组织加1ml预冷的组织裂解液，用匀浆器匀浆组织，收集上清，用Ni-NTA His-Bind Resin(Manufactured by QIAGEN)纯化上清中的IL-24，做免疫印迹法(Western blot)检测IL-24的表达；(3)在4％多聚甲醛中固定24小时的肌肉，做振荡切片，用PBS(PH7.4)洗三次，每次5分钟，然后加入正常羊血清，37℃封闭15分钟。加入经过1∶5000稀释的一抗Anti-myc Antibody(Invitrogen USA)100μl，37℃孵育一个小时，PBS(PH7.4)洗三次，每次5分钟，然后加入经过1∶2000稀释的二抗Goat F(ab’)2Anti-mouse IgG(H+L)FITC conjugate(CALTAGLABORATORIES)，37℃孵育一个小时，PBS(pH7.4)洗三次，每次5分钟，甘油封片，不加一抗的为阴性对照，用激光扫描共聚焦显微镜(Laserscanning confocal microcope，LSCM，德国Leika公司TCSsp2型)观察肌肉组织中是否有绿色荧光来证实IL-24的表达。
C、ELISA法检测小鼠脾脏分泌的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF-α)水平。BALB/C(SPF级)小鼠分四组，每组6只，肌肉注射NS，pcDNA3.1/myc-His(-)A，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，第7天重复注射一次，分别在第7天和第14天各组小鼠取3只，取脾脏研磨，制成悬液，用小鼠IFN-γ，TNF-α，ELISA试剂盒(eBioscience)检测小鼠脾脏总的细胞因子分泌水平。
D、建立结核杆菌感染动物模型的依据实验目的，做两批动物模型，每批动物都随机分为生理盐水(NS)组、pcDNA3.1/myc-His(-)A空载对照组，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组。每组8只BALB/C小鼠，第一批动物每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv(购自北京生物制品研究所)菌悬液0.4ml(2mg/ml)，观察小鼠生存时间。第二批动物每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv菌悬液0.4ml(0.75mg/ml)。观察其它实验指标。
E、用结核杆菌感染动物模型小鼠的生存时间及肺、脾器官活菌计数来检测IL-24是能保护宿主抵抗结核杆菌感染在感染后，每天观察第一批动物中各组小鼠的生存状况，观察四周，并做下记录对第二批动物，在攻毒后的第18天各组小鼠无菌条件下取左肺及部分脾组织，研磨成匀浆接种于改良罗氏培养基上，37℃保湿培养4-6周，进行菌落计数，计算每1克组织的荷菌量。
F、用抗酸染色和HE(Hematoxylin and eosin)染色法观察染动物模型小鼠器官病变情况及菌落分布细胞因子作为免疫佐剂不仅可改变免疫应答的强度，还可改变免疫应答的类型，许多细胞因子被证实能作为基因疫苗的佐剂，增强常规疫苗诱导的免疫反应，本发明的优点是细胞因子cDNA(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)能在小鼠体内外表达IL-24，能够刺激鼠脾脏分泌IFN-γ，TNF-α，治疗组的结核杆菌感染小鼠生存时间与对照组相比显著升高，治疗组组肺组织内活菌数比对照组相应地显著降低(p＜0.05)。通过HE(Hematoxylinand eosin)染色观察到治疗组相对于对照组肺泡结构较完整。抗酸染色发现治疗组肺的细菌数明显少于对照组。首次发现，动物实验结果表明人小分子细胞因子cDNA能增强小鼠对人结核杆菌感染的保护抵抗作用。细胞因子IL-24在临床可作为一种治疗结核的新型免疫制剂，因此细胞因子IL-24作为一种新型抗结核的细胞因子制剂，有很好的应用前景。
图1重组真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24的鉴定1为1Kb DNA Ladder(SM0431晶美)2为pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24NheI和HindIII双酶切鉴定结果将重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24分别用NheI和HindIII进行双酶切，pcDNA3.1/myc-His(-)A大小为5.5Kb，IL-24大小为0.62Kb，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24经NheI和HindIII双酶切后，分成5.5Kb和0.62Kb两个片段，与预期值相符，表明目的基因已插入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体中。阳性克隆测序结果与GeneBank IL-24序列完全一致。
图2A真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24在小鼠结肠癌细胞中的表达1为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A转染细胞收获上清western blot鉴定结果2为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24转染细胞收获上清western blot鉴定结果IL-24在真核细胞内表达是糖基化的，分子量约为30KD，图中所示与预期值相符图2B真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24在小鼠肌肉组织中的表达western blot鉴定结果1为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A注射肌肉后western blot鉴定结果2为NS注射肌肉后western blot鉴定结果IL-24在体内表达是糖基化的，分子量约为30KD，图中所示与预期值相符图2C真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24在小鼠肌肉组织中的表达共聚焦显微镜鉴定结果1为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24注射肌肉后激光扫描共聚焦显微镜鉴定结果。
2为NS注射肌肉后激光扫描共聚焦显微镜鉴定结果。
3为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24注射肌肉后，处理过程中未加一抗，作为阴性对照，激光扫描共聚焦显微镜鉴定结果。
上图为激光扫描共聚焦显微镜激光扫描所得图象，下图为同一视野相差扫描所得图象，因为我们所用二抗是FITC偶连的，所以如果IL-24能够表达，将会在共聚焦显微镜激光扫描下看到绿色荧光图3A小鼠脾脏分泌的细胞因子IFN-γ水平红色的方格表示生理盐水(NS)组小鼠脾脏分泌的细胞因子IFN-γ水平绿色方格表示空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组小鼠脾脏分泌的细胞因子IFN-γ水平蓝色方格表示IL-24质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)组小鼠脾脏分泌的细胞因子IFN-γ水平pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组分泌的IFN-γ水平明显高于空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组和生理盐水(NS)组图3B小鼠脾脏分泌的细胞因子TNF-α水平红色的方格表示生理盐水(NS)组小鼠脾脏分泌的细胞因子TNF-α水平绿色方格表示空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组小鼠脾脏分泌的细胞因子TNF-α水平蓝色方格表示IL-24质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)组小鼠脾脏分泌的细胞因子TNF-α水平pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组分泌的TNF-α水平明显高于空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组和生理盐水(NS)组图4小鼠生存状况黑色的曲线表示生理盐水(NS)组小鼠的生存时间红色的曲线表示空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组小鼠的生存时间绿色的曲线表示IL-24质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)组小鼠的生存时间三组小鼠在结核分支杆菌感染后26天内作生存率观察，生理盐水组从感染后第18d开始陆续死亡，至观察期结束有2只存活，pcDNA3.1/myc-His(-)A组在感染后第18d开始死亡至观察期结束有3只存活，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24组在感染后第19d开始死亡至观察期结束有5只存活，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24组和生理盐水、pcDNA3.1/myc-His(-)A两组生存率相比较存在显著性差异(P＜0.05)。pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组的小鼠生存时间明显延长，图5A肺组织病理表现
A为生理盐水(NS)组的肺部病理切片图(Hematoxylin and eosin staining，×400)B为空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组的肺部病理切片图(Hematoxylin andeosin staining，×400)C为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24组的肺部病理切片图(Hematoxylin andeosin staining，×400)生理盐水组、空载质粒组肺组织渗出为主，肺泡破坏严重，镜下见有单核细胞、淋巴细胞浸润，肺泡间隔增厚、断裂、融合IL-24组病理表现以增生为主，大量淋巴细胞浸润，有类上皮细胞、纤维母细胞等结核结节组成细胞出现，且肺泡结构较完整图5B肺组织抗酸染色观察1为生理盐水(NS)组的肺部切片抗酸染色图(油镜下观察，×1000)2为空载质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A)组的肺部切片抗酸染色图(油镜下观察，×1000)3为质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24组的肺部切片抗酸染色图(油镜下观察，×1000)小鼠肺组织切片抗酸染色的镜下改变，生理盐水，空载质粒组结核分枝杆菌成簇状分布，数目众多，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24组中的细菌数成散在分布，细菌数明显少于其他组
具体实施例方式细胞因子质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)DNA的构建及表达A、重组表达细胞因子质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)DNA的构建根据人IL-24GeneBank序列(NM006850)设计引物，上游引物5′GCGCTAGCGATGAATTTTCAACAGAGG3′，含有NheI酶切位点；下游引物5′CCAAGCTTATGATGATGATGGAGCTTGTAGAATTTCTGC3′，含有HindIII酶切位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。以插入人完整编码区基因的质粒pEGFP-C1-IL-24(已公开见参考文献中国免疫学杂志200521(10)760-763；中风与神经疾病杂志2005 22(2)104-106)为模板，采用上述引物进行PCR扩增。扩增的反应条件为95℃预变性2分钟，以95℃变性36秒，56℃退火36秒，72℃延伸1分钟24秒，扩增25个循环，再以72℃延伸5分钟。PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用DNA回收试剂盒Gel Extraction Kit(OMEGA bio-tek Made in USA)回收纯化。将纯化的PCR产物和载体pcDNA3.1/myc-His(-)A(已公开见参考文献中国生物化学与分子生物学报2004 20(3)335-340)，用NheI和HindIII(Fermentas MBI)双酶切后，分别回收酶切产物，在T4DNA连接酶(Fermentas MBI)作用下定向连接IL-24片段至pcDNA3.1/myc-His(-)A，将连接产物转化入感受态细胞DH5α(已公开见参考文献中华神经外科杂志2004 20(1)48-50)中，在LB(含氨苄抗菌素)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，摇菌培养后小量提取质粒，采用NheI和HindIII双位点单、双酶切鉴定。挑取阳性克隆，送交北京华诺公司测序。
B、质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24在小鼠体内外的表达(1)在75mm2细胞培养瓶中培养鼠结肠癌细胞CT-26(已公开见参考文献生物医学工程学杂志2004；21(6)897～900)，在细胞融合达到90％以上时，开始转染，用lipofectamineTM2000(Invitrogen)把鉴定正确的质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，pcDNA3.1/myc-His(-)A转染到CT-26细胞，每种质粒4μg，48小时后收获细胞上清，免疫印迹法(Western blot)检测IL-24的表达；(2)用B型质粒大量快速提取试剂盒(北京博大泰克公司提供)抽提质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A和pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，每只小鼠分别于胫前肌注射0.75％利多卡因和质粒混合物(1∶4，100μl)，含质粒100μg，以及PBS，在注射后第7天取小鼠胫前肌，胫前肌分两部分，一部分置于4％多聚甲醛中固定，另一部分按每10mg组织加1ml预冷的组织裂解液，用匀浆器匀浆组织，把匀浆液置冰上10分钟，12000转4℃离心20分钟，收集上清，用Ni-NTA His-BindResin(Manufactured by QIAGEN)纯化上清中的IL-24，免疫印迹法(Western blot)检测IL-24的表达；(3)在4％多聚甲醛中固定24小时的肌肉，做振荡切片，厚度为40μm，用PBS(PH7.4)洗三次，每次5分钟，然后加入1∶30正常羊血清，37℃封闭15分钟.加入经过1∶5000稀释的一抗Anti-myc Antibody(InvitrogenUSA)100μl，37℃孵育一个小时，PBS(PH7.4)洗三次，每次5分钟，然后加入经过1∶2000稀释的二抗Goat F(ab’)2 Anti-mouse IgG(H+L)FITC conjugate(CALTAG LABORATORIES)，37℃孵育一个小时，PBS(pH7.4)洗三次，每次5分钟，甘油封片，不加一抗的为阴性对照，用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microcope，LSCM，德国Leika公司TCSsp2型)观察肌肉组织中是否有绿色荧光来证实IL-24的表达细胞因子质粒(pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24)DNA在小鼠体内的作用C、ELISA法检测小鼠脾脏分泌的细胞因子BALB/C小鼠(武汉大学动物中心)分四组，每组6只，用上述同样的方法注射PBS，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24，pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒，第7天重复注射一次，分别在第7天和第14天各组取3只小鼠，取脾脏研磨，按每1g组织加1ml PBS研磨，制成悬液，用小鼠γ干扰素(IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒(eBioscience)检测小鼠脾脏总的细胞因子分泌水平。
D、动物模型的建立依据实验目的，做两批动物模型，每批动物都随机分为生理盐水组、pcDNA3.1/myc-His(-)A空载对照组，pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组。每组8只BALB/C小鼠，第一批动物每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv(购自北京生物制品研究所)菌悬液0.4ml(2mg/ml)，观察小鼠生存时间。第二批动物每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv菌悬液0.4ml(0.75mg/ml)。进行小鼠肺、脾器官活菌计数及观察器官的病变程度。
E、小鼠的生存时间的观测。及肺、脾器官活菌计数在感染后，每天观察第一批动物中各组小鼠的生存状况，观察四周，并做下记录。对第二批动物，在攻毒后的第18天各组小鼠无菌条件下取左肺及部分脾组织，然后按每1g组织加1ml生理盐水，研磨成匀浆；用等体积4％的硫酸中和，摇匀后静置20min，以此原液作10倍梯度稀释；选取3个稀释度的悬液100μl，分别涂布于3个改良罗氏培养基上，37℃保湿培养4-6周，进行菌落计数，计算每1g组织的荷菌量。以CFU/ml·mg表示。见表1表1小鼠肺组织活菌计数
如表所示在肺组织中pcDNA3.1/myc-His(-)A-IL-24质粒组的小鼠菌落计数明显少于其他各组，且具有统计学差别(*＜0.05)(六)病理标本的观测取右上肺叶及脾组织4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，分别做抗酸染色和HE(Hematoxylin and eosin)染色后观察器官病变情况及菌落分布。
本发明中所用的LB培养基的制备发法为配制1L的用量蛋白胨10g酵母抽提物5g NaCl 10g调pH值至7.0-7.2。分装后于121摄氏度灭菌15min。
本发明中所用的改良罗氏培养基的制备发法为味精(谷氨酸钠95％以上)7.2g；磷酸二氢钾2.4g；硫酸镁0.24g；柠檬酸镁0.6g；甘油12mL；蒸馏水600mL；马铃薯淀粉30g；全卵液1000mL；2％孔雀绿20mL。制备法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水锅内煮沸30～40min(其间不时摇动，防凝块)，呈糊状，待冷后，加入经消毒纱布过滤的新鲜全卵液1000mL，混匀。加2％孔雀绿20mL，混匀，分装试管(18mm×180mm)。每一试管加培养基7mL，培养基斜面高度为培养基占试管底部的三分之二处为宜，置血清凝固器内凝固。凝固器内温度至90℃时，放入分装试管，以摆放两层为宜。待凝固器内温度达85～90℃，计时，凝固1～1.5h后取出，放冷，无菌试验后放4℃冰箱备用，一个月内使用。
权利要求
1.一种细胞因子白细胞介素24cDNA的载体在制备治疗或预防抗结核感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种细胞因子在抗结核感染中的应用，利用目的基因人白细胞介素24基因序列已公开，人白细胞介素24基因位于人染色体1g32－1g41，由7个外显子和6个内含子组成，有一个编码206个氨基酸的完整开放读码柜，表达的分子量为23.8KD，N－糖基化位点位于第85、99、126氨基酸处，将细胞因子人白细胞介素24注射，具有抵抗结核杆菌感染的作用。具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/19GK1887343SQ20061001974
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月28日 优先权日2006年7月28日
发明者章晓联, 马运峰 申请人:武汉大学