专利名称：：用于使哺乳动物细胞具备适应性的方法用于使哺乳动物细胞具备适应性的方法相关申请的交叉引用图2a显示单克隆抗体细胞系的生长速率。图3显示适应胰岛素缺乏的细胞培养物和对照细胞培养物的细胞密度。图7显示适应胰岛素缺乏的细胞培养物和对照细胞培养物的生存力。图8显示适应胰岛素缺乏的细胞培养物和对照细胞培养物的累积的IVCD。词组"生长培养基"或"标准生长培养基，，指含有容许细胞或者细胞系分裂和生长的养分和补充物的培养基。在某些实施方案中，词组"生产培养基，，指允许目的蛋白质高水平表达的加富生长培养基。在某些实施方案中，当与标准生长培养基比较时，生产培养基通常含有较高水平的养分、维生素、痕量元素和/或其它培养基组分。词组"适应培养基"指一种培养基，其使细胞顺应于存在于生物反应器(例如后期生产用生物反应器)中的蛋白质生产条件、使细胞对蛋白质生产条件作好准备、和/或使细胞从生长条件过渡至蛋白质生产条件的可能有害影响最小化。在某些实施方案中，适应培养基包括存在一种或者多种次生代谢物，例如从代谢过程中产生的那些，包括(但不限于)乳酸和/或氨。在某些实施方案中，适应培养基包括一种或者多种抑制剂，该抑制剂包括(但不限于)乳酸、氨、丙氨酸、谷氨酰胺和/或乙酰乳酸。在某些实施方案中，适应培养基包括生产培养基。在某些实施方案中，适应培养基模拟生产培养基的一个或者多个特征。在某些实施方案中，在适应培养基中对细胞进行适应化将导致适应化的细胞，该细胞当从生长或者适应培养基过渡至生产培养基中时表现出减少的或者较低严重程度的有害影响。例如通过用这样的代谢物和/或抑制剂补充生产培养基，和/或通过在延长的细胞培养持续时间中累积这样的代谢物和/或抑制剂，这样的适应培养基可以与生产匹配。本申请使用的术语"复杂培养基"指含有至少一种其身份或其数量是未知的或者不可控制的组分的培养基。词组"分批再补料(batch-refeed)，，指操作生物反应器的模式或者传代细胞的方法。在某些实施方案中，相比较于生物反应器中细胞不传代或者较低频率传代的其它模式，分批再补料方法包括每7天或者8天传代细胞一次。相比较于分批再补料，在使用标准的分传方法的较小规模中，通常细胞更快地传代(例如每3天或者4天)。在某些实施方案中，使用分批再补料方法使细胞培养物适应，以便培养物能获得改善的细胞培养物特征，包括(但不限于)改善的生长速率、提高的生存力、提高的活细胞密度积分、增加的滴度和/或提高的细胞比生产力。在某些实施方案中，为了使细胞适应蛋白质生产条件，分批再补料方法使用更富集的培养物和/或含有次生代谢物和/或其它抑制剂的培养基。词组"次生代谢物"指细胞机能的代谢过程中的副产品。在某些实施方案中，根据本发明的一个或者多个方法，可以使未转染的哺乳动物细胞适应蛋白质生产条件，在分批、补料分批和/或灌流生物反应器过程中具有改善的性能。在某些实施方案中，这样适应化的细胞能够在这样的开发中维持改善的表型，例如表现出增强的生长、提高的生存力、增加的活细胞密度积分、增加的滴度、提高的细胞比生产力和/或更高的细胞密度。在此描述的本发明方法的某些实施方案可以用于使未转染的哺乳动物细胞适应分批、补料分批和/或灌流蛋白质生产过程，从而具有优良的性能。[0061多种商售的培养基中的任何一种均可以用作基础培养基，这些商售培养基例如极限必需培养基(MEM，Sigma)、Ham'sF10(Sigma)或者Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)。然后可以用氨基酸、维生素、无机盐、痕量元素和/或其它组分补充这些基础培养基以产生生长和/或生产培养基。在某些实施方案中，通过在相似或者相同于生产培养基在某些实施方案中，通过在与生物反应器的生产条件下典型地遇到的条件相似或者相同的条件(例如，在与生物反应器中典型发现的培养基一致的培养基)中生长细胞而使细胞适应，其中该生物反应器以分批模式、补料分批模式和/或灌流模式操作。在某些实施方案中。待适应的细胞是未转染细胞。在某些实施方案中，待适应的细胞是已用外源核酸分子(例如表达目的蛋白质的核酸分子)转染的细胞。在某些实施方案中，通过在用外源核酸分子转染细胞之前使细胞适应蛋白质生产条件，而使一个或者多个细胞培养物特征在蛋白质生产期间得到改善。在某些实施方案中，这些改善的细胞培养物特征包括(但不限于)改善的生长、改善的整体细胞生存力、提高的活细胞密度积分、增加的滴度和/或提高的细胞比生产力。生产培养基典型地比生长培养基更富集，并且例如相比较于生长培养基，被补加了更高水平的养分、维生素、痕量元素和/或其它培养基组分。在某些实施方案中，本发明的方法用于产生适应蛋白质生产条件的宿主细胞系。这样适应化的宿主细胞系能够被种种目的蛋白质中的任何一种转染。在某些实施方案中，这种适应化的、转染的细胞系被直接置于蛋白质生产条件中。在某些实施方案中，这种适应化的、转染的细胞系在生长期生长到所需要的细胞密度和/或所需要的细胞数量，之后该细胞系过渡到蛋白质生产期。根据本发明，相比较于未适应的、转染的细胞系，这种适应化的、转染的细胞系在过渡期显示出较少或者较低严重程度的有害影响。0064在某些实施方案中，为了生产目的蛋白质，经适应化的细胞用外源核酸分子转染。在某些实施方案中，才艮据本发明，导入细胞的核酸分子编码所需要表达的蛋白质。在某些实施方案中，核酸分子含有调控序列或者编码可以诱导或者增强细胞表达所需要的蛋白质的基因产物。作为非限制性实例，这种基因产物可以是提高目的蛋白质表达的转录因子。在某些实施方案中，指导蛋白质表达的核酸被稳定地导入宿主细胞。在某些实施方案中，指导蛋白质表达的核酸被瞬时地导入宿主细胞。本领域普通技术人员能够基于实验、商业或者其它需要选择是稳定或者瞬时将核酸导入细胞。4艮据本发明，可以使用任何能够进行细胞培养并能表达蛋白质的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞的其它非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACCNo:85110503);人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden,TheNetherlands));SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾细胞系(293细胞或者亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞，Graham等人，J.GenVirol.，36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4216(1980));小鼠支持细月包(TM4，Mather,Biol.R印rod.，23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HeLa，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34);buffalo大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺瘤细胞(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383:44-68(1982));MRC5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(HepG2)。在某些实施方案中，通过将细胞培养在补加有抑制剂的生长培养基中而使细胞(例如未转染的哺乳动物细胞)适应。在某些实施方案中，剂。这样的抑制剂的非限制性实例包括乳酸、氨、丙氨酸、谷氨酰胺和/或乙酰乳酸。本领域普通技术人员将意识到根据本发明可以用于使细胞适应蛋白质生产条件的其它抑制剂。本领域技术人员可以容易地确定生产培养基和生长培养基中的组分和/或补充物。如本领域已知的，组分和/或补充物可以基于使用的宿主细胞和所需要的目的蛋白质而改变。另外，这些条件和产生的副产物的量可以或者将根据不同的生物反应器条件以及根据每个不同的细胞系而改变。通过下述的、非限制性的实施例对本发明进行进一步说明。细胞培养领域技术人员将充分明了在使哺乳动物细胞适应于生产不同蛋白质的细胞培养基的过程中可能成为必需的任何修饰。实施例实施例1:使未转染的中国仓鼠卵巢细胞适应与生产匹配的条件[0079将未转染的CHOK1细^^以标准的3天/4天分批再补料条件培养在生长培养基(组分在下述表1中列出)中，或者以7天分批再补料模式培养在加富的生产培养基(组分在下述表2中列出)中，进行多个周期。在从10至大约30ml的工作体积中在37Gc培养细胞。来自该实验的细胞数目在图la和lb中显示。在图la的分批再补料方法的大约第58天，细胞经9天而非7天传代，并且该随后的传代细胞生长不良。然而，在该不良的7天传代后，细胞能够恢复。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>NaH2P04'H20114.3MgS0448,7MgS04.7H208.6W)gCI228.5NaHC032缀0亚硒酸钠D,007Fe(隨)3'9H200.050CuS04隨1CuS04.5H20D.007FeS04'7H201.543ZnS04'7H201.384MnS04*H200細2Na2Si03*9H200.140(NH4)6Mo7024*4H200.001隨V030細氢化可的松0篇腐胺'2HCI2.柳亚油酸0.D57硫辛酸0.142D-葡萄糖(右旋糖)11042.2PVA2520.0Nucellin14.00D丙酮酸钠54.849然后在具有pH控制的条件下，在第二补料分批实验中评估适应无胰岛素的CHOK1细胞。在这个实验中，将未适应的CHOK1细胞和适应无胰岛素的CHOK1细胞设置在三个不同条件中。第一个条件在基础培养基和进料中都含有胰島素(分别为50mg/L和0.006mg/mL)，在图6-9中用(+/+)表示。第二个条件包含无胰岛素的基础培养基和含有胰岛素的进料，在图6-9中用(-/+)表示，第三个条件包含无胰岛素的基础培养基和无胰岛素的进料培养基，在图6-9中用(-/-)表示。当在无胰岛素的培养基中培养时，相比较于未适应的CHOK1细胞，适应无胰岛素的CHOK1细胞表现出更好的生长、生存力和IVCD(参见图6-9)。该CHOKl-胰岛素酸(参见图9)。这种对有害副产物的清除导致更健康的细胞培养物，并且净皮认为是非常有希望的表型。与相关的对照相比，这种有希望的表型提供更好的生长条件和容许细胞达到更高的密度。应注意的是，由于当在含有胰岛素的培养基中培养时，该CHOKl-胰岛素适应的细胞系具有与对照样品相似的乳酸生产速率，因此这种表型直接与从培养基中清除胰岛素相关。[0087实施例3显示CHOK1细胞对无胰岛素条4牛的适应导致当细胞在工业相关生产模式中培养时的期望表型。该改善的代谢表型导致增加的细胞生长和生存力，其预计对重组CHO细胞培养物的容积生产率具有显著的积极影响。[0088尽管在此已经公开了本发明的某些实施方案，但是以上描述仅仅是举例说明性质的。本领域技术人员可以对本文公开的实施方案作出进一步的修改，并且所有这些修改被认为是属于所附权利要求所限定的实施方案的范围。权利要求1.用于使细胞适应蛋白质生产条件的方法，其包括在适应培养基中培养细胞；筛选细胞并选择细胞亚群，该亚群当在蛋白质生产条件下生长时表现出改善的细胞培养物特征，该特征不同于在于非适应培养基的培养基中培养的细胞中所观察到的相应细胞培养物特征，其中该改善的细胞培养物特征选自改善的生长、提高的生存力、提高的活细胞密度积分、增加的滴度、提高的细胞比生产力和其组合。2.权利要求1的方法，其进一步包括在篩选步骤之前对细胞传代的步骤。3.权利要求2或3的方法，其中该传代步骤包括在篩选步骤之前两次或者两次以上对细胞传代。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中该传代步骤包括在适应培养基中大约3天或者4天之后对细胞传代。5.权利要求1-3中任一项的方法，其中该传代步骤包括在适应培养基中大约7天或者8天之后对细胞传代。6.权利要求1-5中任一项的方法，进一步包括在传代步骤之后在非适应培养基的培养基中培养细胞的步骤。7.权利要求6的方法，其中该非适应培养基的培养基是标准的生长培养基。8.权利要求l-7中任一项的方法，其中该细胞是未转染的细胞。9.权利要求1-7中任一项的方法，其中该细胞已被转染以表达目的蛋白质。10.权利要求9的方法，其中该目的蛋白质是抗体。11.权利要求9的方法，其中该目的蛋白质是治疗性的蛋白质。12.权利要求l-ll中任一项的方法，其中该适应培养基包含生产培养基。13.权利要求12的方法，其中该生产培养勤目比较于标准生长培养基包含一种或者多种增加水平的培养基组分，该培养基组分选自养分、维生素、痕量元素和其组合。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中该适应培养基包含选自乳酸、氨和其組合的次生代谢物。15.权利要求14的方法，其中该次生代谢物在细胞培养的开始添加到适应培养基中。16.权利要求14或15的方法，其中该次生代谢物的水平随着细胞培养的进程而被提高。17.权利要求16的方法，其中该次生代谢物的水平由于细胞的代谢活性而提高。18.权利要求16或17的方法，其中该次生代谢物的水平通过向细胞培养物中添加该次生代谢物而被提高。19.权利要求14-18中任一项的方法，其中该被选择的细胞亚群摄取次生代谢物，使得当经适应化的细胞在生产培养基中生长时该代谢物的水平降低。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中该适应培养基包含一种或者多种选自乳酸、氨、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰乳酸和其组合的抑制剂。21.权利要求14-20中任一项的方法，其中乳酸以大约2至大约10g/L的浓度存在。22.权利要求21的方法，其中乳酸以大约2至大约10g/L的浓度于细胞培养的开始时存在。23.权利要求14-20中任一项的方法，其中氨以大约0.1至大约0.5g/L的浓度存在。24.权利要求23的方法，其中氨以大约0.1至大约0.5g/L的浓度于细胞培养的开始时存在。25.在先权利要求中的任一项的方法，其中该适应培养基缺少胰岛素。26.在先权利要求中的任一项的方法，其中该适应培养基包括浓度低于大约10mg/L的胰岛素。27.在先权利要求中的任一项的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞。28.在先权利要求中的任一项的方法，其中该蛋白质生产条件包括用于生物反应器的条件。29.权利要求28的方法，其中该生物反应器是生产用的生物反应器。30.在先权利要求中的任一项的方法，其中该蛋白质生产条件包括在补料分批蛋白质生产过程中培养细胞。全文摘要本发明提供使细胞例如哺乳动物细胞适应细胞培养过程的方法。当该经适应化的细胞被遗传修饰和用于蛋白质生产时，其表现出有利的特征，例如，能够获得更高的细胞密度和/或实现所生产的蛋白质的更高整体产量。文档编号C12N5/00GK101300342SQ200680041039公开日2008年11月5日申请日期2006年11月2日优先权日2005年11月2日发明者D·T·理查兹,G·W·李,M·S·西纳科雷,M·伦纳德,M·梅尔维尔,R·A·海勒-哈里森,T·S·沙勒布瓦申请人:惠氏公司