专利名称：木薯体细胞胚胎发生再生植株快繁方法
技术领域：
本发明涉及到一种植物的组织培养方法，具体地说是一种通过生物技术达到木薯良种快速繁 殖和规模化生产的方法。
二、 背景技术 技术实用性分析
木薯(MamTjof esra/e"to Crantz)是大戟科(丑wp/ oA/aceae)植物，染色体数为2n = 36, 多年生灌木，高l~5m。木薯是仅次于水稻、玉米、高粱的第四大热带作物，其块根含有丰富 的淀粉，既可作粮食，也可作为工业原料或词料，是热带、亚热带地区6亿人的主要粮食来源。 木薯起源于南美，于16一8世纪传入非洲、亚洲及大洋洲。现在木薯己广泛地分布于全球的热 带及部分亚热带地区。木薯于1820年前由东南亚华侨引入我国，至今己有180多年的栽培历 史。目前我国木薯产区包括海南、广东、广西、福建、云南等省区，四川、贵州、湖南、江西 等地也有种植，现有栽培面积50余万公顷，鲜薯产量1000万吨。木薯主要的优点是具有很高 的产量潜力。它是一种C3-C4中间型作物，在适宜的条件下具有很高的光合作用效率，而在干 旱和高温的胁迫下，也能保持较高的光合效率。
木薯历来采用茎段繁殖，繁殖率低，种茎运输量大，种茎埋土过冬又常受寒害， 一些高产 或抗病品种材料的生产与供应，要在很短的时间内大规模发展是很困难的。由于木薯自身的特 性(如植株的高度杂合、花粉育性低、有性子代严重分离等)及种质资源的局限性(如抗性基 因资源贫乏、己知的品种均含有氰化物等)，传统的育种方法在木薯上受到限制。组织培养是 木薯生物技术的基础，木薯组织培养不仅在快速繁殖及种质保存方面具有重要意义，木薯基因 工程(如转抗病、抗虫基因，与产量、品质有关的基因等)也有赖于组织培养技术获得突破。 木薯组培的早期工作主要是分生组织培养，即所谓的非不定芽再生途径。再生植株来源于高度 联系的多细胞团，如茎尖及侧芽，该方法用于种质资源的保存和交换，品种的提纯、复壮、脱 毒等。
自上世纪70年代以来，研究者们利用芽殖方法、木薯茎段诱导愈伤组织，或从木薯幼叶分 离出原生质体诱导愈伤组织并获得再生植株1'3]，实验结果一直没有得到重复。1982年，Stamp 和Henshaw以木薯合子胚的子叶和胚轴为外植体成功诱导出胚状体[4]。 1993年Raemakers从6 个木薯基因型的幼叶中诱导出初生体胚，并获得再生植株。这是木薯体细胞发生的突破，但是 成熟胚状体的成苗频率很低，且根的发育不全5]; Li等在前人工作基础上发展了体细胞胚子叶 切割，成功地诱导高频率器官发生并获得再生植株[6' 7' 9' ， Zhang Peng报道了 AgN03有促进 器官发生的作用，而麦芽糖与蔗糖是优先选择的碳源[913]。但是有关如何利用体细胞胚胎发生 快速繁殖基因型的技术并无专门的论述，也未见相关国际专利。
在国内，马国华等(1999)从木薯幼叶诱导体胚和形成器官，其植株再生频率仅为 23.4-26.1%[8];李洪清等(2000)在研究木薯品种Co112胚状体子叶器官发生和植株再生发现，
最佳的器官发生频率达到64%，植株再生系数为5.7倍'1；杭玲(2001)等对木薯腋芽分生组 织培养产生丛生芽进行了尝试，芽的切割增殖系数达到3.8[12];莫饶等(2003)以木薯茎段作 为外植体进行快速离体繁殖研究，木薯芽发生频率达到85%以上，芽生根率100%,但试管苗 直接移栽成活率只有20%,而经过适度练苗的成活率可以达到80% [13]。朱文丽等(2006)利 用华南8号等7个木薯基因型对木薯茎秆芽殖和利用叶片、腋芽和顶芽为外植体通过体细胞胚 胎发生产生高频率再生植株的技术进行了系统的比较筛选['4]，针对体细胞胚胎发生和离体快繁 两个方面，完善了木薯体细胞胚胎发生体系和离体快繁体系①建立了木薯体细胞胚胎发生 再生植株的培养体系，同时证明该培养体系在多个基因型间具有通用性。②建立适合多个基因 型木薯快繁体系，利用基础培养基在大多数基因型中获得良好的离体繁殖效果，每个继代周期 4-5周，扩繁系数5-7倍，每株试管苗在一年可以繁殖1.5万株。③提高了木薯大田移栽成活 率，炼苗移栽成活率达到90%以上，为木薯新品种的快速推广利用提供技术基础。 本发明专利的新颖性可以归纳为-
(1) 在非愈伤化茎秆芽殖快繁方面，通过改变激素组成，达到非基因型依赖性的通用快 繁方法，单株可年繁殖15， 000株以上的试管苗，繁殖系数达到年1-1.5万倍，此前未见报道 和相关专利；
(2) 体细胞胚胎发生再生快繁植株方面，解决了适合于多个基因型的体细胞胚胎分化培 养基问题，以及初生胚子叶切割再生大量胚状体的培养条件和胚芽生根条件，达到年度繁殖系 数2-2.5万倍。所述技术要素组合未见报道和相关专利。
(3) 在试管苗炼苗移栽方面，掌握了试管苗环境适用驯化所需要的光照与温度条件和所 需要时间，将移栽成活率提高到90%以上，除了作为本专利发明人的2个文献外，未见国内报 道。
发明内容
本发明是以带有顶芽或侧芽的木薯茎段为外植体，利用组织培养技术的微繁方法来获取 木薯组培苗；并以微繁产生的无菌苗嫩叶、茎尖及腋芽为外植体，诱导体细胞胚胎发生和植 株再生，建立木薯体细胞再生体系，以便短时间内进行木薯良种快繁，规模化生产，并为木 薯的转基因和其它育种建立技术基础。以下对本发明作进一步的描述，方法步骤如下
A.木薯的微体快繁体系
(1) 外植体的消毒处理将木薯杆切成约25 35cm长插条，竖插于河沙基质中培养。 待侧芽萌发长大成新枝条后，将叶片去掉，用饱和肥皂水浸泡20min，接着用自来水冲洗20 min。晾干后，在超净工作台上先用70%酒精浸泡3 ~ 5 s，再放入0.2%氯化汞溶液中浸泡6 ~ 8min，无菌水冲洗4 5次。最后将其切成约1.5 ~ 2.0 cm长带有侧芽的茎段作为外植体；
(2) 初始培养将外植体接种于初始培养基MS + GA0.01 0.05mg/L + NAA0.01 0.04mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于温度为25~28°C，每日光照培 养10 12h，光照强度为1500~20001x，培养5 6周；
(3) 继代培养培养5 6周后，外植体上长出7 10cm的小苗，切取带有侧芽的茎段
按其生长极性接种于继代培养培养基(与初始培养基同)上，每5 6周为一个循环，繁殖率 为5 7倍；
(4) 生根培养将带有侧芽的茎段接种于生根培养基MS + NAA0.02mg/L+蔗糖30 g/L 十卡拉胶5.6g/L (pH=5.8)上，培养温度为25 28。C，每日光照培养12h，光照强度为1500 20001x。培养1周后长出不定根，生根率达100%。
(5) 试管苗移栽及管理室内培养5 6周后，移至遮荫度60。/。的大棚进行炼苗。2周后， 将小苗取出试管，用清水洗净附着在根系上的培养基，用0.2%多菌灵浸泡0.5 h后直接再栽 到装满营养土 (先装营养土再覆盖两至三公分河沙)的营养杯中，浇透定根水，然后覆盖上 塑料薄膜保水保湿。1周左右小苗恢复生长，以后按一般常规小苗管理方法管理。木薯试管 苗移栽成活率起伏大。因此在移栽后的10天内，管理非常重要。
B.木薯的体细胞胚胎发生再生体系
(1) 诱导愈伤组织与体细胞胚胎发生采用木薯微体快繁技术培养成试管苗的带有侧芽 的茎段或茎尖(长1.2 1.5cm)或嫩叶(长3 6mm)接种于诱导培养基(即MS + 2,4-D 3 5 mg/L或Picloram10 13 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上进行暗培养。两周后 可见从部分愈伤组织中长出球形胚状体；
(2) 体细胞胚胎的伸长将胚状体块从愈伤组织中剥离，继续培养于诱导培养基中进行 暗培养。两周后，胚状体进一步伸长长大；
(3) 体细胞胚胎的成熟将胚状体接种于胚状体成熟培养基(即MS + BAO. 1-0.3 mg/L + 蔗糖20 g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上培养，其培养条件为温度为25 28。C，每日光照 培养10 12h，光照强度为1500~ 18001x。两周后，胚状体进一步长大成熟，子叶快速增大 并转绿。此时，可将子叶切成几小块4mn^接种于诱导培养基或器官发生培养基上进行再生 循环培养，获得更多的次生胚状体或小苗；或者，将成熟的胚状体直接进行再生植株培养。
(4) 再生植株培养将转绿的胚状体接种于再生培养基(即MS+BA0.01 0.03mg/L+GA 0.01 0.05mg/L + NAA0.01 0.04mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上，培养1周 后长出不定根，生根率达100%， 4周后长成植株。此时，可将植株切成带有腋芽的茎段接种 于快繁培养基进行扩繁，从而获得更多的小苗；或者，在培养至5 6周后移至荫棚进行炼苗。
(5) 移栽及管理室内培养5周后即可移至大棚炼苗。2周后，可将小苗取出试管，用清 水洗净附着在根系上的培养基，用0.2%多菌灵浸泡半个小时直接栽到营养杯中，浇透定根 水，然后覆盖上塑料薄膜保水保湿。1周左右小苗恢复生长，以后按一般常规小苗管理方法 管理。
具体实施例方式
实施例l:采用带有侧芽的茎段进行微体快繁 试验品种为华南5号；
外植体的消毒处理将木薯杆切成30cm长插条，竖插于河沙基质中培养，待侧芽萌发 长大成新枝条后，将叶片去掉，用饱和肥皂水浸泡20 min,接着用自来水冲洗20min。晾干 后，在超净工作台上先用70。/。酒精浸泡4s，再放入0.2。/。氯化汞溶液中浸泡6min，无菌水冲
洗5次。最后将其切成约2.0 cm长带有侧芽的茎段作为外植体；
初始培养将外植体接种于初始培养基MS + GA 0.02 mg/L + NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于温度为28'C，每日光照培养12 h，光照强度为 20001x，培养40天；
继代培养培养40天后，外植体上长出8cm左右的小苗，切取带有侧芽的茎段按其生 长极性接种于继代培养培养基(与初代培养基同)上，每40天为一个循环，繁殖率为7倍；
生根培养将带有侧芽的茎段接种于生根培养基MS + NAA 0.02 mg/L +蔗糖30 g/L + 卡拉胶5.6g/L (pH=5.8)上，培养温度为28'C，每日光照培养12h，光照强度为2000k。培 养l周后长出不定根，生根率达100%;
试管苗移栽及管理室内培养5周后，移至遮荫度60%的大棚进行炼苗。2周后，将小 苗取出试管，用清水洗净附着在根系上的培养基，用0.2%多菌灵浸泡0.5 h后直接再栽到装 满营养土 (先装营养土再覆盖两至三公分河沙)的营养杯中，浇透定根水，然后覆盖上塑料 薄膜保水保湿。l周左右小苗恢复生长，以后按一般常规小苗管理方法管理。
实施例2木薯的体细胞发生再生体系
试验品种为华南8号；
外植体的消毒处理将新枝条上长出的叶子去掉后，用饱和肥皂水浸泡20 min，接着用 自來水冲洗20min。晾干后，在超净工作台上先用70%酒精浸泡4 s，再放入0.2%氯化汞溶 液中浸泡8min,无菌水冲洗5次。最后将其切成约2.0 cm长带有侧芽的茎段作为外植体；
初始培养将外植体接种于初始培养基MS+ GA 0.02 mg/L +NAA 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8)上。然后置于温度为28'C，每日光照培养12h，光照强度为 20001x ，培养40天；
继代培养培养40天后，外植体上长出7cm左右的小苗，切取带有侧芽的茎段按其生 长极性接种于继代培养培养基(与初代培养基同)上，每40天为一个循环，繁殖率为7倍； a.以嫩叶为外植体的体细胞发生培养体系
诱导愈伤组织与体细胞胚胎发生取5mm长的试管苗嫩叶,切成约4 mn^的片段接种于 诱导培养基(即MS + 2,4-D 4 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上进行暗培养。 两周后可见从部分愈伤组织中长出球形胚状体；
体细胞胚胎的伸长将胚状体块从愈伤组织中剥离，继续培养于诱导培养基中进行暗培 养。两周后，胚状体进一步伸长长大；
体细胞胚胎的成熟将胚状体接种于胚状体成熟培养基aPMS + BA0.1mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上培养，其培养条件为温度为28'C，每日光照培养12h， 光照强度为18001x。两周后，胚状体进一步长大成熟，子叶快速增大并转绿；
再生植株培养将转绿的胚状体接种于再生培养基(即MS +BA0.01 mg/L + GA 0.02 mg/L + NAA0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶5.6§几(pH=5.8))上，培养1周后长出不定根，生根 率达100%， 4周后长成植株；
移栽及管理室内培养5周后即可移至大棚炼苗。2周后，可将小苗取出试管，用清水
洗净附着在根系上的培养基，用0.2 %多菌灵浸泡半个小时直接栽到营养杯中。l周左右小 苗恢复生长，以后按一般常规小苗管理方法管理。 'b.以茎尖和腋芽为外植体的体细胞发生培养体系 外植体预培养将试管苗切成带有侧芽的约1.2 1.5的茎段和茎尖平放于预处理培养基
(即MS + Cu0.128 mg/L + BA2.0 mg/L +蔗糖20 g/L +卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上进行培养1 周；
诱导培养用解剖针将茎尖和经预培养的腋芽挑出，接种于诱导培养基(即MS+2,4-D2 mg/L+蔗糖20g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上进行暗培养，培养温度为26°C,1周后开始形 成胚性的愈伤组织；
体细胞胚胎的生长将胚状体块从愈伤组织中剥离，继续培养于诱导培养基中进行暗培 养。两周后，胚状体进一步伸长长大；
体细胞胚胎的成熟将胚状体接种于胚状体成熟培养基(即MS + BAO.l mg/L+蔗糖20 g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上培养，其培养条件为温度为28'C，每日光照培养12h， 光照强度为18001x。两周后，胚状体进一步长大成熟，子叶快速增大并转绿；
再生植株培养将转绿的胚状体接种于再生培养基(即MS +BA0.01 mg/L + GA0.02 mg/L + NAA0.01 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶5.6g/L (pH=5.8))上，培养l周后不定根长出，生根 率达100%， 2周后长成完整植株，5周后，植株有10cm左右高。
移栽及管理培养5周后即可移至遮荫度60%的大棚炼苗。2周后，可将小苗取出试管， 用清水洗净附着在根系上的培养基，用0.2 %多菌灵浸泡半个小时直接栽到营养杯中。l周 左右小苗恢复生长，以后按一般常规小苗管理方法管理。
参考文献Kartha K K. Regeneration of cassava plants from apical meristems, Plant Sci Lett, 1974， 2: 107 113Tilquin J P. Plant regeneration from stem callus of cassava, Can J Bot, 1979， 57: 1761-1763 [3]Shahin E A， Shepard J F. Cassava mesophyll protoplasts: isolation, proliferation and shoot
formation, Plant Sci Lett, 1980, 17: 459-465 [4]Stamp J A, Henshaw G G. Somatic embryogenesis in cassava, Z P_/7a"ze"/ /z 1982, 105:183-187 [5]Raemakers CJJM，Amati M，Staritsky G " a/. Visser RGF. Cyclic somatic embryogenesis and
plant regeneration in cassava, Ann Bot 1993,71:289-294 [6]Li H Q, Huang Y W, Liang C Y e/ a/. Improvement of plant regeneration from cyclic somatic
embryos in cassava. In: Cassava Biotechnology Network: Proceedings of the 2ed International
Scientific Meeting, Bogor, Indonesia, CIAT working document, 1995,150:289-302 [7]Li H Q, Huang Y W， Liang C Y a/. Regeneration of cassava plant via shoot organogenesis [J],
Plant Cell Rep, 1998, 17:410-414 [8J马国华，许秋生，羡蕴兰.几种生长素对木薯体细胞胚胎发生和植株再生的作用，热带亚热 带植物学报，1999， 7 (1): 75-80 [9]Zhang P， Phansiri S, Puonti-Kaerlas J. Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of
silver nitrate in vitro, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2001, 67(1): 47-54 [10]Barbara Woodward, Johanna Puonti Kaerlas. Somatic embryogenesis from floral tissue of
cassava (她m7zo/" ei^cw/e"to Crantz ), Euphytica, 2001,120(l):l-6 [ll]李洪清李美茹梁承邺.几种影响木薯芽器官发生及植株再生的因素，植物生理学通讯，
2000, 36(4): 297-299杭玲，陈丽娟，蔡炳华等.木薯离体培养与快速繁殖，亚热带植物科学，2001， 30 (1):
24-26莫饶，吴繁花，叶剑秋等.木薯离体培养的研究，华南热带农业大学学报，2003， (9) 1: 1-5朱文丽.木薯胚胎发生再生植株及离体保存技术的初步研究，华南热带农业大学硕士学位论 文，2006， Pp: 16-4权利要求
1.一种非基因型依赖的木薯组织培养再生植株快速成苗的方法。其特征如下a.用任意基因型植株带有侧芽的茎段进行培养诱导不定芽，利用不定芽分化再生小植株并生根成苗。其中采用的基本培养基是MS培养基，以及附加适度浓度的GA，NAA激素；b.用大多数基因型无菌苗的嫩叶、茎尖和腋芽进行分化培养诱导愈伤化组织，并挑取胚性愈伤组织诱导胚状体发生及植株再生。其中采用的基本培养基是MS培养基，并附加适度浓度的激素2，4-D或Picloram，BA等。
2. 如权利要求l.a所述，用带有侧芽的茎段进行离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于不 定芽诱导及分化再生小植株所需附加的激素GA浓度0.01 0. 05 mg/L，NAA的浓度是0.01 0.04 mg/L。
3. 如权利要求l.a所述，用带有侧芽的茎段进行离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于植 株生根所需附加激素NAA的浓度为0.02 mg/L。
4. 如权利要求l.b所述，用无菌苗的嫩叶、茎尖和腋芽进行愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生及 植株再生的方法，其特征在于诱导愈伤组织及体细胞胚所需附加激素2， 4-D浓度为3 5 mg/L 或Picloram为10 13 mg/L。
5. 如权利要求l.b所述，用无菌苗的嫩叶、茎尖和腋芽进行愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生及 植株再生的方法，其特征在于体细胞胚胎成熟培养阶段所需附加激素BA浓度0.1~0.3 mg/L。
6. 如权利要求l.b所述，用无菌苗的嫩叶、茎尖和腋芽诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生及植株 再生的方法，其特征在于体细胞胚胎诱导及成熟阶段需要附加蔗糖的浓度为20g/L。
7. 如权利要求l.b所述，用无菌苗的嫩叶、茎尖和腋芽进行愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生 及植株再生的方法，其特征在于再生植株培养阶段需附加激素组合及浓度值为BA0.01~0.03 mg/L + GA 0.01 0.05 mg/L + NAA 0.01~0.04 mg/L。
8. —种木薯试管苗温室二步炼苗的方法，步骤如下室内培养生根试管苗5~6周后，移至遮 荫度60%的大棚进行炼苗。2周后，将小苗取出试管，用清水洗净附着在根系上的培养基， 用0.2%多菌灵浸泡0.5 h后直接再栽到装满营养土 (先装营养土再覆盖两至三公分河沙)的 营养杯中，浇透定根水，然后覆盖上塑料薄膜保水保湿。1周左右小苗恢复生长，以后按一 般常规小苗管理方法管理。
全文摘要
本发明涉及木薯的组织培养繁殖方法。木薯(Manihot esculenta Crantz)是全球三大薯类作物之一，非洲第一大粮食作物，目前被列为我国重要的生物能源作物。通常采用茎段无性扦插进行繁殖，其繁殖率低是新品种推广和缩短育种周期的限制性因素。本方法包括以带有茎尖或侧芽的木薯茎段为外植体，通过微繁方法快速获取木薯组培苗；以微繁得到的无菌苗的嫩叶、茎尖及腋芽为外植体，诱导体细胞胚胎发生和植株再生，建立木薯体细胞再生体系。具有繁殖率高，无基因型依赖等特点，对于短时间内进行木薯良种快繁，规模化生产具有重要的价值，并为木薯的转基因和其它育种建立技术基础。
文档编号C12N5/04GK101347097SQ20071013891
公开日2009年1月21日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者鹏 张, 朱文丽, 王文泉, 王海燕, 饶 莫 申请人:朱文丽;张 鹏;莫 饶;王海燕;王文泉