专利名称：抗人肿瘤坏死因子α的单克隆抗体的抗体可变区及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及特异性结合人肿瘤坏死因子-a的单克隆抗体的抗体可变区、编码它 的基因、含有该基因的重组载体和转化该重组载体的细胞。
背景技术：
人肿瘤坏死因子-a (下文称作"hTNFa")是由三个17 kDa蛋白质亚基组成的 同源三聚体(Eck MJ et al.， JBC 267:2119-2122， 1992; Smith RA et al" 7BC 262 : 6951-6954,1987)。 hTNFa是由单核细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子，在多种细 胞反应如坏死和凋亡中作为信号传递物起作用(Beyaert R et al.， T^^J 340: 9-16,1994)。
hTNFa产生导致组织破坏的促炎作用，所述组织破坏例如分解软骨和骨 (Saklatvala, Wfl,"M 322: 547-549,1986)，以及增加中性粒细胞和淋巴细胞的粘附 (Pober et al.， K. /附m"wo/. 138 : 3319,1987)。此外，已知hTNFa在对抗感染性疾病 和肿瘤的防御机制中起着重要作用(Fiers W，F五aSi:战.285: 199-212,1991)。
hTNFa参与炎性疾病、自身免疫病、细菌感染、癌症和退形性病变。在这些疾 病中，hTNFa已经被当作特异性生理治疗类风湿性关节炎和节段性回肠炎(Crohn's disease)的有用靶蛋白。
同时，还提示使用hTNFa抑制剂来治疗类风湿性关节炎。已经报道hTNFoc在分 离自早期类风湿性关节的滑膜细胞中过表达(Buchan G et al.， /附m""o/. 73:
449-455,1988)，上述滑膜细胞用抗hTNFa单克隆抗体处理时，与类风湿性关节炎病 变相关的细胞因子下降(Butler DM et al.，五"f Q;toAi"e TVe加.6: 225-230,1995)。另外，已经发现抗hTNFot抗体或重组可溶性hTNFa受体抑制胶原诱导的小鼠关 节炎模型中关节的炎症和破坏(Wpiquet PF et al.， J附附""o/05y 77: 510-514,1992; Wooley PH et al" / J附腦,zo/. 151: 6602-6607, 1993; Williams RO et al" 7m聽wo/柳 84: 433-439,1995)。此外，观察到过表达hTNFa的转基因小鼠中诱导了炎性关节炎 (Keffer J et al"皿必O /. 10: 4025-4031,1991 )。
这些结果表明hTNFa作为控制炎性细胞因子的直接或间接调节因子在类风湿性 关节炎中起着重要作用。因此，需要开发对hTNFa具有高度选择性和反应性的单克 隆抗体来治疗类风湿性关节炎。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供特异性结合hTNFot的单克隆抗体的抗体可变区。 本发明的另一个目的是提供编码特异性结合hTNFa的单克隆抗体的抗体可变区
的基因；包含该基因的重组载体；和转化该重组载体的细胞。
根据本发明的一个方面，提供了特异性结合hTNFa的单克隆抗体的抗体可变区，
其包含下列至少一种
包含SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸序列的重链可变区；和 包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列的轻链可变区。
根据本发明的另一个方面，提供了编码特异性结合hTNFa的单克隆抗体的重链
可变区的核酸分子，其中所述的重链可变区包含SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了编码特异性结合hTNFa的单克隆抗体的轻链 可变区的核酸分子，其中所述的轻链可变区包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸 序列。
具体实施例方式
本发明涉及特异性结合hTNFa的单克隆抗体的抗体可变区及其编码基因。 为了制备特异性结合hTNFa的单克隆抗体，用重组hTNFa(BiosourcePHC3011,Belgium)免疫小鼠。将从免疫小鼠获得的脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0-Ag14， ATCC CRL1581)融合，以制备杂交瘤细胞库(pool)。将这种杂交瘤细胞进行后续的克隆 和选择程序，以提供多种单克隆抗体。在这些单克隆抗体中，选择特异性结合hTNFa 的某些单克隆抗体进行进一步分析。结果，获得了杂交瘤细胞系TSKll，其产生特 异性结合hTNFoc并对TNFa表现出高度结合亲和力的单克隆抗体。
从杂交瘤细胞系TSK11提取总RNA，进行逆转录酶-聚合酶链式反应 (RT-PCR),以合成单克隆抗体重链和轻链的cDNA分子。使用这种cDNA分子作 为模板进行聚合酶链式反应(PCR),从而获得编码重链可变区并包括SEQ ID NO: 5 核苷酸序列的约470bp的cDNA分子；和编码轻链可变区并包括SEQ ID NO: 6核苷 酸序列的约450bp的cDNA分子。
分析这种重链和轻链可变区的互补决定区(CDR)，结果发现重链可变区具有三 个CDR，位于SEQIDNO: 7氨基酸序列中的31-35 (SEQ ID NO: 9)、 50-66 (SEQ ID NO: 10)和99-106 (SEQ ID NO: 11)氨基酸位置处。同样，观察到轻链可变区 具有三个CDR，位于SEQ ID NO: 8氨基酸序列中的24-35 (SEQ ID NO: 12)、 51-57 (SEQ ID NO: 13)和卯-98 (SEQ ID NO: 14)氨基酸位置处。
因此，根据本发明一个实施方案的cDNA分子编码特异性结合hTNFa的单克隆 抗体的重链可变区，其中所述的重链可变区包括SEQ ID NO: 9、 10和11的氨基酸 序列。优选的是，本发明提供了编码含SEQ ID NO: 7氨基酸序列的重链可变区的 cDNA分子，更优选的是具有SEQ ID NO: 5核苷酸序列的cDNA分子。
另外，根据本发明另一个实施方案的cDNA分子编码特异性结合hTNFa的单克 隆抗体的轻链可变区，其中所述的轻链可变区包括SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基 酸序列。优选的是，本发明提供了编码含SEQIDNO:8氨基酸序列的轻链可变区的 cDNA分子，更优选的是具有SEQ ID NO: 6核苷酸序列的cDNA分子。
编码重链可变区和轻链可变区的前述每一种cDNA分子可以插入到传统载体中 以获得重组载体。在本发明的一个优选实施方案中，包括SEQIDNO:5或6核苷酸 序列的cDNA分子可以插入到pCR2.1-TOPO (Invitrogen Co. U.S.A)中，以制备含 有重链可变区的重组载体pTSKll-Hv,或含有轻链可变区的重组载体pTSKll-Lv。另外,可以将这种重组载体导入合适的宿主中，如诸如TOP10F的微生物。 例如，用pTSKll-Hv或pTSKll-Lv转化Eco/ZTOP10F,以获得E.coli转化体，称 作Eco/; TOP 10F/pTSKll-Hv或五.co// TOP 10F/pTSKll-Lv，它们按照国际承认用 于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52， Oun-dong， Yusong-ku， Taejon 305-333, Republic of Korea),保藏编号是KCTC 10514BP或KCTC 10515BP。
上述重组载体可以根据常规方法从转化体中恢复(J. Sambrook et al., 3/ofec"/flr c/卯'VigVo1. 1: 1.25-1.28)。例如，转化体可以用溶液1(50,葡萄糖，25 mM Tris-HCl 和10 mM EDTA)处理以弱化其细胞膜，然后用溶液2 (0. 2 N NaOH和1% SDS) 处理以完全破坏细胞膜，变性所暴露的蛋白质和染色体。然后，通过进一步用溶液3 (5M醋酸钾和醋酸)处理使重组载体之外的细胞组分聚集。然后，将所得的溶液进 行离心以获得含重组载体的上清液。重组载体可以通过乙醇沉淀从上清液中回收。
本发明的抗体可变区可以包含下列至少一种包含SEQ ID NO: 9、 10和11的 氨基酸序列的重链可变区；和包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列的轻链可 变区。优选的是，抗体可变区可以包含具有SEQIDNO:7氨基酸序列的重链可变区 和具有SEQ ID NO: 8氨基酸序列的轻链可变区中的至少之一。
抗hTNFa的人源化单克隆抗体可以通过将人抗体基因和编码含有SEQ ID NO: 9-11所示CDR的重链可变区或编码含有SEQ ID NO: 12-14所示CDR的轻链可变区 的cDNA分子融合而得到。作为替代方案，人源化单克隆抗体可以将人抗体可变区 替换为这种cDNA分子而得到。
如上所述，由于本发明的抗体可变区特异性结合hTNFa,它可以有效地用来中 和并灭活hTNFa。
在下列实施例中进一步解释本发明。应理解这些实施例虽然指出了本发明的优 选实施方案，但只是以说明方式给出。
实施例1:用hTNFa免疫小鼠
将30吗重组hTNFa (Biosource PHC3011, Belgium)溶解于150^1磷酸缓冲液(PBS)中，和150^1弗氏完全佐剂(Sigma F5881, U.S.A.)混合而乳化。将300^1 所得乳液腹腔注射(i.p.)到6周龄雄性BALB/c小鼠体内。两周后，小鼠腹腔注射 300^1含30吗hTNFa和150|La弗氏不完全佐剂(Sigma F5506, USA)的乳液混合物。 第二次注射两周后，将溶解于150nl PBS中的30吗重组hTNFa静脉注射(i.v.)到 小鼠体内。第3次注射10天后，小鼠静脉注射30吗的重组hTNFa的PBS溶液而加 强免疫。
实施例2:产生抗hTNFa抗体的小鼠脾细胞的融合
将实施例中免疫的小鼠通过碳酸钾窒息而处死，然后从中摘除脾脏。从小鼠脾 脏获得脾细胞，并与非分泌性骨髓瘤细胞Sp2/0 (ATCC CRL1581)以10:1比例混合。 为了细胞融合，将预热到37'C的lml50。/。聚乙二醇(PEG 1500， Roche 783641)加 到细胞混合物中。将融合细胞用含20V。胎牛血清(FBS， JRH， 12-10678P)、 50 ng/ml 庆大霉素(Gibco-BRL， 15750-060)、 lxDMEM (JRH， 56499-10L)和lxHAT补 充物(O.l mM次黄嘌呤钠、0.4pM氨基蝶呤、16pM胸腺嘧啶；Gibco-BRL，31062-037) 的生长培养基稀释，并以1.1xl()5细胞/孔的浓度、以0.2 ml小份分到96孔板(Nimc， 469949, Denmark)中。将融合细胞于37'C的湿化CO;j孵箱中以5% <:02培养2~3 周。
实施例3:产生抗hTNFa抗体的细胞系的筛选和克隆
一旦融合细胞形成集落，就取它们的上清液进行ELISA分析以确证抗体产生。 为进行ELISA分析，将孔用lpg/ml hTNFa于4'C包被过夜，向每个孔中加入200^1 0.5。/。酪蛋白-PBS溶液，然后在37'C进行反应1小时。接着，向每个孔中加入100nl 上清液，在37'C进行反应2小时。然后，向每个孔中加入100nL以1:1000比例稀释 的偶联辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Bio-Rad，170-6516)，于37'C保持1.5小时。 最后，向每个孔中加入100^1辣根过氧化物酶底物溶液(Bio-Rad， 172-1064)，将这 些孔于37'C保持3分钟以诱导显色。用ELISA酶标仪(Dinatec inc.，USA)测定410nm 处的光吸收。实施例4:产生抗hTNFa抗体的细胞系的选择
在实施例3克隆的细胞系中，获得了比获自hTNF-a免疫小鼠的阳性对照血清表 现出更高光吸收的9个产生IgG的细胞系。在这些细胞系中，选择表现出最高光吸 收的TSK11进行进一步分析。
实施例5:从杂交瘤细胞系TSK11获得的单克隆抗体的同种型分析
通过如下的ELISA分析确认从杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的同种型。向预 先包被100ng/ml TSK11抗体的孔中加入100^1的小鼠MonoAb ID kit HRP溶液 (Zymed，卯-6550),然后，将孔板保持于室温下3分钟，以诱导显色。用ELISA 酶标仪(Dinatec inc., USA)测定410nm处的光吸收。结果发现TSK抗体含有IgGl
型重链和K型轻链。
实施例6:来自杂交瘤细胞系TSK11的单克隆抗体的体外结合亲和力
通过ELISA分析测定抗hTNFa的TSKll抗体的体外结合亲和力。这里，将每 个孔用100^1浓度为4ng/ml的重组hTNFa包被。然后，在微管(Micro Tube) (AXYGEN， U.S.A.)中，将重组hTNFa用补充0.02%牛血清白蛋白的PBS稀释， 以获得5xl(T9M-lxl(T1QM的终浓度。将各浓度的hTNFa稀释物和30 ng TSK11抗体 混合，于37'C保持2小时。将混合溶液分到用重组hTNFa包被的每个孔中，于37 'C孵育2小时。然后，向每个孔中加入100^1辣根过氧化物酶底物溶液(Bio-rad， 172-1064),于37'C保持3分钟以诱导显色。用ELISA酶标仪(Dinatec inc., USA) 测定410nm处的光吸收。
根据Scatchard plot分析(Friguet E. etal., t / /挑挑训o/og/cfl/ Me,Aorf 77: 305-319， 1985)计算抑制竞争性ELISA中50。/。的最大结合所需的抗原浓度的倒数来 确定表观亲和力。结果，TSKll对hTNFa的亲和力为1.95xl(T9M OW)。
实施例7:从杂交瘤细胞系TSK11的RNA分离和cDNA合成
8用RNeasy试剂盒(QIAGEN， U.S.A)从杂交瘤细胞系TSK11的lx108细胞中 提取总RNA，并使用Thermotranscript试剂盒(GibcoBRL, U.S.A)进行cDNA合 成。将作为模板的5吗RNA和0.5ng寡聚d(T)悬浮于蒸馏水中，并将终体积调至l(Hil。 将混合物保持于65'C下5分钟以变性RNA，并冷却到室温以诱导引物退火。用于 cDNA合成的RT-PCR反应溶液通过将1^1逆转录酶(1单位/pI)、 2.5pl 0.1M DTT、 2.5nl 10mM dNTP和1^1 RNase抑制剂(1单位/pl)混合而制备，其终体积用蒸馏水 调至25pl。 RT-PCR反应于50'C进行1小时，通过将反应混合物于95'C加热5分钟 而终止。
使用2pg的合成cDNA作为模板和扩增重链的一对引物(SEQ ID NO: 1和2) 或扩增轻链的另一对引物(SEQ ID NO: 3和4)进行PCR。 PCR反应溶液含有0.5^1 AmpliTaq Gold聚合酶(5单位小1, Perkin-Elmer Biosystem Co.， U.S.A)、 lpl 10 mM dNTP和5nl25mMMgCl2,终体积用蒸馏水调至50nl。 PCR条件如下95'C初始变 性5分钟，然后是94'C l分钟，55'C l分钟，72'C 2分钟的30个循环，接着于72 'C最终延伸10分钟。
将扩增的DNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶用100 ml的0.5jig/ml溴化乙 锭溶液染色20分钟。结果，鉴定到了两个扩增的DNA产物，对于重链在对应于约 470bp的位置处，对于轻链在对应于约450bp的位置处，参照100bp的标准DNA ladder (Lifetechnology Co. U.S.A.)。
实施例8: cDNA克隆
利用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen， U.S.A.)从琼脂糖凝胶回收并 纯化实施例7中扩增的470bp的重链DNA片段。将纯化的DNA片段亚克隆到载体 pCR2.1-TOPO (Invitrogen Co.， U.S.A.)中，将所得的载体导入五.co// TOP10F (Invitrogen Co., U.S.A.),以获得转化体(Cohen, S. N. et al.， Prac. Ato.69: 2110,1972)。如此制备的Eco//转化体在补充100ng/ml氨苄青霉素的LB培养基中培 养过夜。从培养的转化体中提取质粒DNA,并用限制酶&oRI (BioLabCo., USA) 处理，以获得含470bp重链DNA片段的克隆TSKll-Hv。对于实施例7中扩增的450bp的轻链DNA片段进行同样的程序，以获得 TOP10F转化体。￡.co//转化体在补充100pg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。 从培养的转化体中提取质粒DNA,并用限制酶五"RI (BioLab Co.， USA)处理， 以获得含450bp轻链DNA片段的克隆TSKll-Lv。
实施例9: cDNA核苷酸测序
使用Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, U. S. A.)纯 化实施例8中获得的克隆TSK11-Hv和TSK11-Lv，并进行核苷酸测序。
结果发现获得的重链DNA片段含有SEQ ID NO: 5核苷酸序列和SEQ ID NO: 7 氨基酸序列。验证了属于克隆TSKllHv的三个具体DNA片段(TSKllHvl、 TSKllHv2和TSKllHv3)，它们的核苷酸序列相同。从克隆TSKllHv获得的质粒 载体命名为pTSKll-Hv。另外，具有质粒载体pTSKll-Hv的五.c^/转化体命名为 TOP10F/pTSKll-Hv，按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 的条款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52， Oun-dong，Yusong-ku， Taejon 305-333， Republic of Korea),保藏编号是KCTC 10514BP。
另外，发现获得的轻链DNA片段含有SEQ ID NO: 6核苷酸序列和SEQ ID NO: 8氨基酸序列。验证了属于克隆TSKllLv的两个具体DNA片段(TSKllLvl和 TSKllLv3)，它们的核苷酸序列相同。从克隆TSKllLv获得的质粒载体命名为 pTSKll-Lv。另外，具有质粒载体pTSKll-Lv的转化体命名为五.co/Z TOP10F/pTSKll-Lv,按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条 款，于2003年8月26日保藏在Korean Collection for Type Cultures (地址#52, Oun-dong，Yusong-ku， Taejon 305-333， R印ublic of Korea),保藏编号是KCTC 10515BP。
根据从杂交瘤细胞系TSK11获得的单克隆抗体可变区的氨基酸序列分析 (Harris. L. et al" 5W. 4:306-310， 1995; Kabat. E. A. et al.， 5"甲e歸
/7ratoVw t>/ Z附附"訪/og/cfl/ ,' tems《.5th Ed.， 1991; Williams A. F. et al.， ifev./柳m"no/. 6: 381-406， 1988)，发现重链属于由Kabat定义的11类之外的混杂类，轻
链属于K6-型亚类。
重链中识别抗原的CDR发现位于氨基酸位置31-35(SEQ ID NO: 9)、50-66(SEQ ID NO: 10)和99-106 (SEQ ID NO: 11)，轻链中识别抗原的CDR发现位于氨基酸 位置24-35 (SEQ ID NO: 12)、 51-57 (SEQ ID NO: 13)和卯-98 (SEQ ID NO: 14)。
虽然描述并说明了本发明的实施方案，显而易见的是，可以在不背离本发明实质 的情况下进行各种改变和改进，本发明实质仅受所附权利要求范围的限定。序 列 表
<110> (株)柳韩洋行
<120>抗人肿瘤坏死因子a的单克隆抗体的抗体可变区及其编码基因
<130> P国171-YUH
<150> KR 1CH2003-0080950
<151> 2003-11-17
<160> 14
<170> Kopat印tln 1.71
<210> 1
<211> 39
<212> 薩
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链正向引物
< 1
actagtcgac atggcttggg tgtggaactt gccattcct
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链反向引物
<400> 2
cccaagcttc caggggccag gggatagacg ggtgg
<210> 3 <211> 3939
30
60 120 180 240 300 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链正向引物
< 3
actagtcgac atggatttac aagtgcagat tttcagctt
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
< 4
ccca柳tta ctggatggtg gga柳tgga
<210> 5 <211> 351 <212> DMA
<213> 编码重链可变区的cDNA分子的核苷酸序列 <400> 5
caggtccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggag柳cagtcaagatc
tcctgcaaggcttctggatataccttcacacactatggaatgaactgggtgaagcaggct
ccaggag柳gtttaaagtggatgggctgg3ta3acacc3acactggsgagccaagatat
g3tg33g3gttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctat
ttacagatc3acaacctcag3cgtg3gg3cacggctacatatttctgtgcaagatatgat
tcca咖gatttgactgctggggccaaggcaccactctcacagtctcctc3
<210> 6 <211> 327
轻链反向引物
> >
o 3
2 2<212> DNA
<213> 编码轻链可变区的cDNA分子的核苷酸序列
< 6
caaattgttctC3CCC3gtCtccagcastcatgtctgcatctctagggga acgggtcacc60
atgacctgcactgccagctcjaagtataagttacaattactttc8ictggtEi tcsgcagagg120
ccaggatcctCCCCC幼3Ctctggatttatagctcatccaatctggcttc tggagtccca180
cctcgcatcagtggcagtgggtctggg3cctcttactctctcacaatcag cagcatggag240
gctgaagatgctgccacttattactgccaccagtatg柳gttccccgtg gacgttcggt300
ggaggcaccaagctggaaatcaaacgg327
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 编码重链可变区的cDNA分子的氨基酸序列
<400> 7
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly T卬I le Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu化r Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Arg Arg Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gin Gly Thr Thr 化O 105 110Uu Thr Val Ser Ser 115
<2化> <211> <212> <213>
Gin lie
8
109 PBT
编码轻链可变区的cDNA分子的氨基酸序列
8
Val
1
Glu
Arg Val
Leu Thr 5
Thr Met 20
Tyr Phe His Trp Tyr 35
lie Tyr Ser Ser Ser 50
Gin Ser Pro Ala
Thr Cys Thr Ala 25
Gin Gin Arg Pro 40
Asn l_eu Ala Ser 55
lie Met 10
Ser Ser
Ser Ala Ser Leu Gly 15
Gly 65
Ser
Gly Asp T卬Thr Phe
Ala Glu
Ser G[y Thr Ser 70
A(a Ala Thr Tyr 85
Gly Gly Gly Thr 100
Tyr Ser Tyr Cys
Lys l_eu 105
Gly Ser Gly Val
l_eu Thr 75
Ser Ile Ser 30
Ser Pro Lys 45
Pro Pro Arg 60
Tyr Asn Leu Trp Ile Ser
lie Ser Ser Met
His Gin 90
Tyr Glu Arg Glu Ile Lys Arg
Ser 95
Glu 80
Pro
<210> <211> <212> <213>
9 5
PRT
重链CDRl
<參 9 His Tyr Gly Met Asn 1 5
<210> 10 <211> 17 <212> PRT<213> 重链CDR2 < 10
Trp Me Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15
Gly
<210> <211> <212> <213>
11
8
PRT
重链CDR3
< 11
Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys 1 5
<210> <211> <212> <213>
12 12 PRT
轻链CDRl
< 12 Thr Ala Ser Ser Ser 1 5
Ile Ser Tyr Asn Tyr Phe His '10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 轻链CDR2
< 13
Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<2化> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 轻链CDR3
< 14His Gin Tyr Glu Arg Ser Pro Trp Thr 1 权利要求
1. 特异性结合人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体的轻链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO12、13和14的氨基酸序列。
2. 权利要求l的轻链可变区，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。
3. 权利要求l的轻链可变区，其由包含SEQIDNO:6的核苷酸序列的cDNA分子 编码。
4. 编码特异性结合人肿瘤坏死因子-a的单克隆抗体的轻链可变区的核酸分子，其中 所述的轻链可变区包含SEQ ID NO: 12、 13和14的氨基酸序列。
5. 权利要求4的核酸分子，其中所述的轻链可变区包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序 列。
6. 权利要求4的核酸分子，其包含SEQIDNO:6的核苷酸序列。
7. 包含权利要求4的核酸分子的重组载体pTSKll-Lv。
8. 转化体五."//1^^1(^*181^11-1^,其保藏编号为KCTC 10515BP，转化有权利 要求7的重组载体pTSKll-Lv。
全文摘要
特异性结合人肿瘤坏死因子-α的单克隆抗体的抗体可变区，含有具有特异性互补决定区的重链可变区和轻链可变区的至少之一。还提供了编码它的核酸分子、含有该核酸分子的重组载体和转化该重组载体的细胞。
文档编号C12N15/28GK101440131SQ200810006270
公开日2009年5月27日 申请日期2004年11月16日 优先权日2003年11月17日
发明者姜熙日, 宋武泳, 朴相久, 李载善, 柳泰亨, 罗康仁, 金昶硕, 高仁泳 申请人:(株)柳韩洋行