专利名称：：免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体的制作方法免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体本申请是申请日为2003年6月30日、中国申请号为03820458.4、发明名称为"免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体"的发明申请的分案申请。相关申请本发明涉及双特异性配体。该发明特别提供一种制备双特异性配体的方法，该配体包括结合第一种抗原或表位的第一免疫球蛋白单个可变区，及结合第二抗原或表位的第二免疫球蛋白单个可变区。更具体地，本发明涉及双特异性配体，其与第一和第二抗原或表位至少其一的结合延长该配体的体内半衰期。本发明描述包含一个以上结合特异性的开放和闭合构象配体。
背景技术：
：抗体中的抗原结合区包括两个分开的区域重链可变区(vh)和轻链可交区(Vl:Vk或VjJ。抗原结合位点本身由6个多肽环组成3个来自VH区(HI,H2和H3)，3个来自VL区(LI，L2和L3)。基因区段的组合重排造成编码VH区和VL区的V基因的多种多样的一级库(primaryrepertoire)。VH基因是由3个基因区段即VH、D和Jh重組而成的。根据单元型(haplotype),人类大约有51种功能性VH区段(CookandTomlinson,ImmunolToday16:237(1995))，25种功能性D区段(Corbett等，J.Mol.Biol.268:69(1997))和6种功能性jh区段(Ravetch等，Cell27:583(1981))。vh区段编码多肽链中形成vh区第一和第二抗原结合环(HI和H2)的区域，而Vh、D和Jh区段共同形成Vh区第三抗原結合坏(H3)。Vl基因只由2个基因区段即Vl和Jl重組而成。根据单元型，人类大约有40种功能性VK区段(SchableandZachau，Biol.Chem.Hoppe-Seyler374:1001(1993)),31种功能性V、区段(Williams等，J.Mol.Biol.264:220(1996)和Kawasaki等，GenomeRes7:250(1997)),5种功能性jk区段(Hieter等，j.Mol.Biol.257:1516(1982))和4种7功能性Jx区段(VasicekandLeder，J.Exp.Med.172:609(1990》。VL区段编码多肽链中形成Vl区第一和第二抗原結合坏(LI和L2)的区域，而Vl和Jl区段共同形成Vl区第三抗原結合坏(L3)。一般认为，这些初始库具有足够多样性，可以选择出至少能以中等亲和力与几乎所有抗原结合的抗体。经过基因重排的"亲和力成熟，，可产生高亲和力抗体，在此过程中，发生点突变，并根据结合能力的增强由免疫系统进行选择。分析抗体的结构和序列表明6个抗原结合环中的5个(H1、H2、Ll、L2和L3)具有数目受限的主链构象和规范结构(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)和Chothia等，Nature342:877(1989))。主链构象取决于(i)抗原结合环的长度，和(ii)抗原结合环和抗体框架中某些关键位置的具体残基或残基类型。分析抗原结合环的长度和关键残基可以推测由大多数人类抗体序列编码的H1、H2、Ll、L2和L3主链构象(Chothia等，J.Mol.Biol.227:799(1992);Tomlinson等，EMBOJ14:4628(1995);Williams等，J.Mol.Biol.264:220(1996))。虽然H3区在序列、长度和结构方面的多样性大得多(由于D区段的作用)，但其长度及抗原结合环和抗体框架中关键位置特殊残基或残基类型的存在决定该区也为短环长度形成数目受限的主链构象(Martin等，J.Mol.Biol.263:800(1996);Shirai等,FEBSLetters399:1(1996》。本领域已知包含VH区和Vl_区互补对的双特异性抗体。这些双特异性抗体必须包含两对VH区和VL区，每对VH/VL结合单个抗原或表位。曾经描述的方法包括杂种杂交瘤4支术(MilsteinandCuelloAC，Nature305:537-40),微体(minobody)(Hu等，CancerRes56:3055-3061(1996》，双抗体(diabody)(Holliger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993);WO94/13804),螯合重组抗体(CRAb)(Neri等，J.Mol.Biol.246:367-373(1995))，双Fv抗体(biscFv)(Atwell等，Mol.Immunol.33:1301-1312(1996》，"凸凹吻合(knobsinholes)"稳定化抗体(Carter等，ProteinSci.6:781-788(1997》。每种情况下每种抗体类别包括两个抗原结合位点，每个抗原结合位点的样式为Vh区和V^区的互补对。因此，通过一个Vh区和它的互朴Vt区结合每个抗原或表位，使得每个抗体能同时结合两个不同的抗原或表位。这些技术的每一种均有其特有的缺点，例如杂种杂交瘤技术中无活性的VH/VL对可大大减少双特异性IgG所占分数(fraction)。此外，大多数双特异性方法依赖于不同VH/V^对的结合或Vh和V^链的结合而重新产生两种不同的Vh/Vl結合位点。因此，在组装分子中不可能控制对每种抗原或表位的结合位点比率，所以许多组装分子只结合一种抗原或表位，而不结合另一种抗原或表位。在一些情况下已可以在亚基界面上改造重链或轻链(Carter等，1997)以增加具有结合两种抗原或表位的位点的分子的数目，但这样不能使所有的分子都具有结合两种抗原或表位的能力。有些证据表明两种不同抗体结合特异性可以掺入同一结合位点，但通常这些抗体表现出对结构相关的抗原或表位或广泛交叉反应性抗体的两种以上特异性。例如描述过交叉反应性抗体，通常见于两种在序列和结构上相关的抗原如鸡卵白溶菌酶和火鸡溶菌酶(McCafferty等，WO92/01047)或游离半抗原和与载体偶联的半抗原(GriffithsAD等，EMBOJ13:143245-60(1994))。另一例见WO02/02773(Abbott实验室)描述的具有"双特异性"的抗体分子。这里所涉及的抗体分子是针对多种抗原产生或选择的，也就是说它们的特异性范围多于一种抗原。在WO02/02773描述的抗体中，每对互补VH/VL具有针对两种或两种以上结构相关抗原的单一结合特异性，这些互补对中的Vh区和VL区各自不具有单独的特异性。因此，所述抗体具有涵盖结构上相关的两种抗原的广泛的单一特异性(broadsinglespecificity)。此外，已描述过的天然自身抗体是多反应性的(CasaliandNotkins，Ann.Rev.Immunol.7:515-531),可与至少两种(通常更多)结构上无关的不同的抗原或表位反应。已表明采用噬菌体展示技术在单克隆抗体上选择随机肽库将能鉴定一系列适合抗原结合位点的肽序列。某些序列非常相关，符合共有序列，而其它序列十分不同且^皮命名为单一体(mimotope)(LaneandStephen,CurrentOpinioninImmunology5:268-271(1993))。因此，很显然含有相关和互补VH区和VL区的天然四链抗体能够结合无数已知抗原中的许多不同抗原。不明确的是如何在同一抗体中制备出与两种给定抗原的结合位点，特别是一些结构上未必相关的抗原。蛋白工程技术方法提示其可在这方面有所帮助。例如有人建议制备一种催化抗体，该抗体可通过一个可变区与金属离子结合，通过与金属离子和一个互补可变区接触而与半抗原(底物)结合(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯6385-6389(1993))。然而这种情况下，结合和催化底物(第一抗原)需要与金属离子(第二抗原)的结合。因此，与VH/VL对的结合与单一但多成分的抗原相关。已描迷过从骆驼抗体重链单区(Singledomain)中制备的双特异性抗体，在抗体中通过一个可变区与一种抗原结合，通过第二个可变区与第二种抗原结合。然而这些可变区不互补。因此，选择第一个重链可变区针对第一种抗原，第二个重链可变区针对第二种抗原，然后将这两个可变区连接在同一链上成为一个双特异性抗体片段(Conrath等，J.Biol.Chem.270:27589-27594)。然而，不同寻常的是駱驼重链单区来自无轻链的天然骆驼抗体，事实上，重链单区不能与骆驼轻链结合组成互补的VH/V^对。还描述过源于天然抗体的单个重链可变区，该重链可变区通常与轻链(来自单克隆抗体或功能区库；见EP-A-0368684)结合。已表明这些重链可变区能特异性与一种或一种以上的相关抗原相互作用，而未与其它重链或轻单区在体内的半衰期很短，因此其治疗价值受限。曾有人建议将不同特异性的重链可变区相连在一起制备双特异性抗体片段(如上所述)，但该策略的缺点是分离的抗体可变区可能有一个通常可与轻链相互作用的疏水界面，其暴露于溶剂且可以是粘性的，从而允许该单区结合到疏水表面上。此外，缺乏轻链伴侣的两个或两个以上不同重链可变区的组合和可能通过疏水界面的结合，可阻止它们结合一个而不是两个在它们独立时能结合的配体。而且，这种情况下，重链可变区不与互补轻链可变区结合，故稳定定性很差，折叠易打开(WornandPluckthun，Biochemistry37:13120-7(1998))。发明概述本发明人在未决的国际专利申请WO03/002609和未决且未公开的UK专利申请0230203.2中描述了包含免疫球蛋白单个可变区(singlevariabledomains)的双特异性免疫球蛋白配体，每个可变区具有不同特异性。这些区域结合靶分子上的抗原或表位时或相互竟争或互不依赖。在第一构型中，本发明提供了由发明者发明的对双特异性配体的进一步改进，其中配体的一个特异性是针对有机体体内某种蛋白或多肽的，所述蛋白或多肽通过与配体结合能增强该配体的半衰期。因此，首先，本发明提供了一种双特异性配体，该配体包含第一免疫球蛋白单个可变区，该可变区对第一抗原或表位有结合特异性，该配体还包含互补的第二免疫球蛋白单个可变区，该可变区具有与第二种抗原或表位的结合活性，其中所述抗原或表位中的一种或两种起延长配体在体内的半衰期的作用，所述的第一和第二免疫球蛋白单个可变区缺乏具有同一特异性的共同互补区域，倘若所述的双特异性配体不是由抗-HSAVH区和抗-p半乳糖苷酶Vk区組成的。优选的是第一和第二可变区都不与人血清清蛋白(HSA)结合。有利的是，发明中所述的延长配体半衰期的抗原或表位是有机体中发现的体内蛋白或多肽。实例包括胞外基质蛋白、血液蛋白和有机体各种组织中存在的蛋白。这些蛋白的作用是降低配体从血中清除的速率，例如可作为增容剂(bulkingagent)或将配体锚定在所希望的作用位点上。延长配体体内半衰期的抗原/表位实例在下面附件1中给出。延长半衰期的方法在免疫球蛋白，特别是抗体，特别尤其是小型抗体片段的体内应用中十分有用。这些片段(Fv,二硫化物键合的Fv,Fab，scFv,dAb)受制于从体内快速清除；因此，一方面它们能快速到达身体大部分部位并迅速生产而且易于操作，一方面由于其在体内的存在短暂而限制了其在体内的应用。本发明提供了在体内半衰期延长的配体，致使配体的功能性活性在体内持续时间延长，从而解决了上述问题。药代动力学分析和配体半衰期的测定方法已为本领域技术人员熟知。详纟田资津+见Kennetl等的ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists(药物的化学稳定性药剂师手册)和Peters等的Pharmacokineticanalysis:APracticalApproach(药动力学分4斤实用方法)(1996)。还可参考MGibaldi和DPerron等的Pharmacokinetics(药代动力学)，MarcelDekker出版，第2修订版，1982年，该书描述了ta半衰期、t卩半衰期和曲线下面积(AUC)等药代动力学参数。半衰期(tl/2a和tl/2[3)以及AUC可从配体的血清浓度与时间的关系曲线中求出，例如可采用WinNonlin分析软件包(可从PharsightCorp.,MountainView,CA94040,USA获得)模拟曲线。第一阶段(a相)主要是配体在患者体内分布并有一些清除。第二阶段(p相)是终末期，此时配体分布完毕且由于配体在病人体内清除，其血清浓度开始下降。to半衰期是第一阶段半衰期，t卩半衰期是第二阶段半衰期。因而，有利的是，本发明一方面提供了依照本发明的配体或包含配体的组合物，其ta半衰期为15分钟或15分钟以上的范围。在一个实施方案中，所述范围的下限可为30分钟，45分钟，l小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，IO小时，11小时，12小时。另外，或可选择地，本发明所述的配体或组合物的ta半衰期可在高达12小时且包括12小时的范围内。在一个实施方案中，所述范围的上限可为11,10,9,8，7,6或5小时。适当范围的实例是1-6小时，2-5小时或3-4小时。半衰期在2.5小时或2.5小时以上的范围。在一个实施方案中，所述范围的下限为3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，10小时，11小时或12小时。另外，或可选择地，本发明所述的配体或组合物的tp半衰期可在高达21天且包括21天的范围内。在一个实施方案中，所述范围的上限可为12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。有利的是，本发明的配体或组合物的t(3半衰期范围为12-60小时。在又一个实施方案中，范围为12-48小时。在又一个实施方案中，范围为12-26小时。除上述标准之外，或可选择地，本发明提供了依照发明的配体或包括配体的组合物，其曲线下面积(AUC)值在1mg.min/ml或以上的范围。在一个实施方案中，所述范围的下限为5，10,15,20，30,100，200或300mg.min/ml。另夕卜，或可选择地，本发明所述的配体或组合物的AUC值可在高达600mg.min/ml的范围。在一个实施方案中，所述范围的上限可为500,400，300,200，150，100，75或50mg.min/ml。有利的是，本发明的配体的AUC范围从以下几组中选出15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml,15-75mg.min/ml和15-50mg.min/ml。第一实施方案中，双特异性配体包括两个互补可变区，它们在自然环境中可作为关联对(cognatepair)/组一起发挥作用，即使在本发明中，它们分别结合它们的关联表位。例如，互补的可变区可以是免疫球蛋白重链和轻链可变区(Vh和Vl)。Vh和Vl可十分便利地由scFv或Fab抗体片段提供。可变区可以相连形成多价配体，例如，通过每个V区C末端的铰链区以及铰链区半胱氨酸间的二硫键连接，或由结构域C末端的半胱氨酸经二硫键连在一起的dAb提供，或者由V-CH和V-CL组成的Fab形式，或者使用肽接头(如下所述的Gly4Ser接头)制备二聚体、三聚体和多聚体。12发明者发现互补可变区的应用使得两个区的表面挤在一起(packtogether)并与溶剂隔绝，再者，两个互补区能相互稳定。此外，还使得双特异性IgG抗体去除了过去所用的杂合杂交瘤的缺点，或在亚基界面上改造重链或轻链的需要。第一，本发明中双特异性抗体具有至少一个VH/VL对。所以，本发明的双特异性IgG可包含两个这样的对，Y型分子的每个臂上各有一个。因此，不同于常规的双特异性抗体或双抗体，它们制备过程中肽链使用的比率决定抗体制备的成功，因而制备存在着实际困难，而本发明的双特异性配体不存在链平衡问题。常规双特异性抗体链不平衡原因是两种不同的VL链和两种不同的VH链的结合，当Vt链1和VH链1在一起时能结合抗原/表位1，V^链2和VH链2在一起时能结合抗原/表位2，两个正确匹配对可以某种方式彼此相ii。因此，在单个分子中，只有VL链1和VH链1配对和VL链2和VH链2配对后才能生成双特异性抗体。有两种不同方式制备该种双特异性抗体。第一种方式是通过两个存在的结合不同抗原/表位的VH/V^对的结合(如双特异性抗体IgG)。这样VHA^对一起出现的比率必须为1:1,以便合成的所有抗体分子为双特异性的群体。不会出现双特异性抗体和只能与一种抗原/表位结合而不能与另一种结合的抗体分子的混合物(即使当通过凸凹吻合技术增强互补CH区时)。形成双特异性抗体的第二种方式是通过两个不同VH链和两个不同的VL链的同时结合(如双特异性双抗体)。这样虽然倾向于VL链1与VH链1匹配，V^链2与VH链2匹S己(这可通过Vi区与Vh区"凸凹吻合，，的改造而增强)，这种匹配决不会在所有分子中出现，会形成混合物形式，使得错配发生导致有些抗体不能结合任一抗原或表位。根据本发明第一方面的双特异性配体方法构建的双特异性抗体克服了所有这些问题，原因是与抗原或表位1结合的残基位于Vh或Vl区中，与抗原或表位2结合的残基位于互补的Vh或VL区中，这两种结合是独立的。由于VH/VL对是1:1的，所以全部VH/VL对是双特异性的并且应用这些VH/VL对构建的所有形式(Fv，scFv，Fab，微体(minibody)，IgG等)有100%双特异性的活性。本发明上下文中的第一和第二"表位"可理解为不同的表位并且不被单一单特异性配体结合。在本发明的一个方面，所述表位在不同抗原上，其中之一的作用是增加配体体内半衰期。同样有利之处是第一和第二抗原不相同。本发明中的双特异性配体不包括WO02/02773所述的配体，因此，本发明中的配体不包括通过共同作用(co-operativdy)结合任意一个或更多抗原或表位的互补VH/VL对。相反，本发明第一方面的配体包含VH/VL互补对，其中所述V区具有不同特异性。此外，本发明第一方面的配体包括对结构上不相关的表位或抗原具有不同特异性的VH/Vt互补对。结构上相关的表位或抗原，它们具有充分的结构相似性，以致于得到常规VH/VL互补对的结合，而这些常规互补对是通过共同作用方式结合表位或抗原。这种结构相关的表位在结构上十分相似，这使它们"适合"进入Vh/Vl二聚体抗原結合位点上形成的同一結合袋中。本发明第二方面提供了一种配体，包括具有第一抗原/表位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区和具有第二抗原/表位结合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中所述第一和第二可变区之一或二者结合增加配体在体内的半衰期的抗原，并且可变区互相之间不互补。在一个实施方案中，与一个可变区的结合调节配体同第二可变区的结合。在该实施方案中，可变区可以例如是VH区对或Vt区对。与抗原在第一位点的结合有可能调节(增强或抑制)与抗原在第二位点的结合。例如，第一位点的结合至少部分抑制抗原在第二位点的结合。在这样的实施方案中，配体通过结合一种可增加配体半衰期的蛋白而使配体在宿主生物体内持续存在，直到配体与第二靶抗原结合而与延长半衰期的蛋白解离。上文所述的结合调变可作为抗原结合位点相互间结构邻近的结果，这种结构邻近可通过连接两种或两种以上抗原结合位点的结构成分的本质决定，例如，提供一种容纳了紧邻的抗原结合位点的相对刚性结构的配体。优势在于，这些抗原结合位点之间在物理学上彼此十分接近，因此，通过免疫球蛋白分子中的空间位阻和/或构象变化而使一个位点调变抗原分子在另一个位点的结合。第一和第二抗原结合区可以以共价或非共价方式结合。以共价方式结合时，结合可通过二硫键或多肽接头如(Gly4Ser)n介导，其中n-l-8，例如2,3,4,5或7。本发明中配体可以与非免疫球蛋白多配基结构组成多价复合物，与具有相同抗原的靶分子结合，因此具有高亲合力，同时至少一个可变区结合一种抗原以增加多聚体的半衰期。例如，天然细菌受体如SpA被用作支架结构(Scaffold)，将CDRs移植以产生能特异性结合一种或更多表位的配体。这一过程详细资料在US5,831,012中描述。其它适用的支架结构包括那些以纤连蛋白和亲合体(affibody)为基础的物质。适用方法详细资料在WO98/58965中描述。其它合适的支架结构lipocallin和CTLA4，参见vandenBeuken等，J.Mol.Biol.310,591-601(2001)，在WO0069907(MedicalResearchCouncil)中描述的支架是以细菌GroEL或其它伴侣多肽的环状结构为基础的。蛋白支架结构可以是组合的，例如，CDR可以被嫁接于CTLA-4支架结构上，并与免疫球蛋白的Vh区或V^区一起应用组成配体。同样，纤连蛋白、lipocallin和其它支架结构也可以组合。如果这里描述的可变区是来自采用噬菌体展示技术筛选的V区基因库的，那么这些可变区可以包含一个通用框架区，即可被在此定义的特异性属类酉己体(specificgenericligand)i口、另l！。通用冲匡架、属类酉己体(genericligand)等等在W099/20749中描述。本发明中涉及的噬菌体展示包括噬菌体和/或噬菌粒的应用。在采用V基因库时，多肽序列的变异优选于可变区的结构环中。采用DNA改组或突变技术，可改变可变区多肽序列，以增强每个可变区与其互补对之间的相互作用。本发明的优选实施方案中"双特异性配体"是一种单个链(singlechain)Fv片段。本发明中另一实施方案中双特异性配体由抗体分子的Fab区组成。术语"Fab区"包括Fab样区，其中应用了两个VH区或两个VL区。可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。或者，可变区也可来自诸如那些表达在丝状噬菌体表面的单个抗体区的库中。选择方法如下所述。第三方面，本发明提供了一种制备配体的方法，该配体包括具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和具有第二(不同)结合特异性的第二单个免疫王求蛋单个可变区.(Singleimmunoglobulinsinglevariabledomain),所述结合特异性之一或二者是特异性针对一种能延长配体体内半衰期的抗原分子的，该方法包括以下步骤(a)根据能与第一个表位结合的能力选择第一个可变区，(b)根据能与第二个表位结合的能力选择第二个可变区，(C)组合这些可变区；和(d)根据能与上述第一和第二表位结合的能力筛选配体。配体能同时与上述第一和第二表位结合，或者当存在结合区间表位结合的竟争时而出现一个区域的结合排除另一个区域与其关联表位的结合。因此，在一个实施方案中，上述步骤(d)中要求同时结合第一和第二(可能更多)表位。在另一实施方案中，与第一和第二表位的结合不是同时的。所述表位优选在不同抗原上。有利的是，配体包括如上所述的免疫球蛋白可变区的VH/V。Vh/Vh或Vl/Vl組合。此外，配体可包括CamelidV朋区。只要针对能延长配体体内半衰期的抗原特异性的V朋区不能结合如Conrath等，JBC276:7346-7350(2001)和W099/23221中所述的鸡卵白溶菌酶(heneggwhitelysozyme)(HEL)、猪胰腺a淀粉酶或NmC-A、hcg、BSA-连接的RR6含氮染料或S.mutansHG982细胞，上述文献都未描述针对延长配体体内半衰期的抗原的特异性的应用。在一个实施方案中，上述第一可变区是根据在缺乏互补可变区的情况下其能与上述第一表位结合而筛选的。在另一实施方案中，上述第一可变区是根据在第三可变区存在的情况下其能与上述第一表位/抗原结合而筛选的，在这里第三可变区不同于上述第二可变区，它与第一可变区互补。同样，第二可变区也可在有/无互补可变区的情况下筛选。本发明中配体的靶抗原或表位除了是能增加半衰期的蛋白外，也可以是任意抗原或表位，不过最有利的是具有治疗价值的靶抗原或表位。本发明提供的配体，包括特异性针对所述靶，特别是较进步确定的靶的开放/闭合式构象的配体和分离的dAb单体配体。这些靶可以或部分是天然或合成的多肽、蛋白或核酸。这样，本发明中的配体可以结合表位或抗原，并可作为拮抗剂(antagonist)或激动剂(agonist)起作用(如EPO受体激动剂)。本领域技术人员知道所述靶的选择是广泛多样的。例如，它们可以是人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的辅助因子(enzymeco-factor)或DNA结合蛋白。适当的细胞因子和生长因子包括但不仅限于ApoE,Apo-SAA，BDNF,心脏营养蛋白画l(Cardiotrophin-l),EGF，EGF受体，ENA-78,Eotaxin,Eotaxin-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF,碱性FGF,成纤维细胞生长因子-10,FLT3配体，CX3C趋化因子(FractaMne)(CX3C),GDNF，G-CSF,GM陽CSF,gf-(31,胰岛素，ifn-y，igf画i,igf-ii,il-1a,il画1(3,il-2,il-3,il-4,il-5,IL-6,IL-7，IL画8(72a.a.),IL-8(77a.a.),IL-9，IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18(IGIF)，a抑制素(inhibin),(3抑制素，IP-IO，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2),KGF,瘦蛋白，LIF,淋巴细胞趋化因子，苗勒抑制物(Mullerianinhibitorysubstance),单核细胞集落抑制因子，单核细胞趋化蛋白(monocyteattractantprotein),M-CSF,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.),MCP-1(MCAF),MCP-2，MCP-3，MCP-4,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.),MIQMIP-1a,MIP-1[3,MIP-3oc,MIP-3(3,MIP-4,髓样祖细胞抑制因子(myeloidprogenitorinhibitorfactor)-l(MPIF-l),NAP-2,Neurturin,神经生长因子，(3-NGF,NT-3,NT-4,制瘤素(Oncostatin)M,PDGF-AA,PDGF-AB，PDGF-BB,PF-4,RANTES，SDFlcx，SDFlP,SCF,SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC,TGF-a，TGF-(3,TGF-132,TGF-(33,月中瘤坏死因子(TNF),TNF-a,TNF-(3，TNF受体I,TNF受体II,TNIL-l,TPO,VEGF,VEGF受体1,VEGF受体2,VEGF受体3,GCP-2,GRO/MGSA,GRO-13，GRO-Y,HCC1,1-309,HER1,HER2,HER3和HER4。细胞因子受体包括前述的细胞因子的受体。以上用于举例，并不表示只限于所列物质。本发明一个实施方案中，可变区来自针对抗原或表位的不同的抗体。在优选实施方案中，可变区来自抗体单个可变区库。此外，本发明提供一种或更多核酸分子，编码至少一种在此定义的双特异性配体。单个核酸分子可编码双特异性配体;或者每个区可分别由一个独立的核酸分子编码。由单个核酸分子编码的配体，功能区可以融合多肽、scFv分子形式表达，或者分别表达最后连接在一起，例如用化学连接剂。不同核酸分子表达的配体可以适当的方式连接在一起。核酸可进一步编码信号序列以引导宿主细胞表达的多肽输出，还可在表达时与丝状噬菌体粒的表面成分(或筛选展示系统的其它成分)发生融合。本发明进一步提供了一种载体，包含编码本发明双特异性配体的核酸。本发明更进一步提供了一种宿主细胞，转染有编码本发明中所指的双特异性配体的载体。此种载体可以构建为例如在噬菌体粒表面表达可变区以供选择。这样采用本发明的方法允许筛选所展示的可变区和双特异性配体。本发明进一步提供了包含至少一种本发明双特异性配体的试剂盒。本发明双特异性配体优选包含重链区和轻链区的组合产物(combination)。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，它们以scFv形式连接在一起。此外，配体可包括一个或更多个CH区和CL区。例如，配体可包含ChI,Ch2或Ch3区，和/或Cl区，Cm1,Cp3或C^4区，或它们的任意组合。铰链区也可以包含在内。这些功能区的结合可例如模拟天然抗体如IgG或IgM,或它们的片4爻如Fv，scFv,Fab或F(ab')2分子。其它结构如包含有VH、VL，Ch1和Cl区的IgG分子的单臂也在设想当中。本发明优选实施方案中，可变区是从单个V区基因库中筛选的。通常，单个抗体功能区的库是在丝状噬菌体表面上展示的。本发明优选实施方案中，每一单个抗体区是通过噬菌体库与抗原结合的方式筛选的。本发明优选实施方案中每一单个可变区是在缺乏互补可变区的情况下根据其与靶抗原/表位的结合筛选的。另一个实施方案中，单个可变区是在互补可变区存在的情况下根据其与靶抗原/表位的结合筛选的。因此，第一个单个可变区可以在第三个互补可变区存在情况下筛选，第二个可变区可以在第四个互补可变区存在情况下筛选。互补的第三或第四可变区可以是具有与受试单个可变区相同特异性的天然关4关可变区(naturalcognatevariabledomain),或者是非关联互补区如一个"模拟(dummy)"可变区。本发明的双特异性配体优选包括^l两个可变区，尽管几个这样的配体可以组合在一起形成同一蛋白，例如两个这样的配体可以被纳入IgG或多聚免疫球蛋白如IgM。或者，在另一实施方案中，多个双特异性配体组合在一起形成一个多聚体。例如，两种不同的双特异性配体组合生成四特异性分子。本领域技术人员将会理解，依照本发明方法制备的双特异性配体的轻链和重链可变区可以在同一多肽链上，或者不同的多肽链上。如果可变区在不同多肽链上，那么它们可以通过一个接头，通常是一个柔韧的接头如多肽链，化学连接基团，或本领域已知的任意其它方法连接。另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种可通过本发明提供的方法获得的双特异性配体和一种可用于药物中的载体、稀释液或赋形剂。此外，本发明提供了一种采用本发明的双特异性配体或组合物治疗/预防疾病的方法。在第二种构型中，本发明另一方面提供了包含至少两个非互补可变区的多特异性配体。例如，配体可包含一对VH区或一对Vl区。优势之处在于可变区是非Camelid来源的，优选它们是人源的功能区或者包括人源框架区(FWs)以及一种或一种以上的异源CDR。CDR和框架区是免疫相关蛋白序列Kabat数据库中定义的免疫球蛋白可变区的。优选的人源框架区是由种系基因片段DP47和DPK9编码的。优势之处在于VH区或VL区中的FW1、FW2和FW3具有来自DP47或DPK9的FW1，FW2或FW3序列。人源的框架可以任选包含突变，例如，在本发明配体中使用的人源框架中可包含例如总共多达大约5个或IO个氨基酸的改变。本发明中第二构型的多特异性配体可变区可以一种开放或闭合构象排列，也就是说，它们可以同时独立地结合在关联配体上，或者在任一时刻只有一个可变区结合在它的关联配体上。发明者意识到在一些结构状态下，非互补可变区(如两个轻链可变区或两个重链可变区)可以出现在一个配体中，以致第一表位与第一可变区的结合抑制第二表位与第二可变区的结合，即使这种非互补区不以关联对方式一起发挥作用。本发明配体优势是包含两对或两对以上可变区，也就是说，包含至少4个可变区；优选这四个可变区含有人源框架。在优选实施方案中，人源框架与人种系序列一致。殊用途。因此，本发明第二种构型的第一方面，提供了制备多特异性配体的方法，包括以下步骤a)选择能与第一个表位结合的第一个表位结合区，b)选择能与第二个表位结合的第二个表位结合区，c)组合这些表位结合区，和d)筛选能与上述第一和第二表位结合的闭合构象的多特异性配体。本发明第二种构型的另一方面，提供了一种制备闭合构象的多特异性配体的方法，该多特异性配体包括具有第一表位结合特异性的第一表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合区，其中第一和第二结合特异性竟争表位结合，致使该闭合构象的多特异性配体不可以同时结合两个表位，上述方法包括以下步骤a)选择能与第一个表位结合的第一个表位结合区，b)选择能与第二个表位结合的第二个表位结合区，c)组合这些表位结合区以使所述区域处在闭合构象中，和d)根据与上述第一和第二表位结合的能力而不是同时与上述两表位结合的能力筛选闭合构象的多特异性配体。此外，本发明提供了一种闭合构象的多特异性配体，包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合区，其中，第一和第二结合特异性竟争表位结合，致使闭合构象的多特异性配体不可以同时结合两个表位。本发明上述第二构型的另一选择的实施方案可任选包含另外的步骤(bl),包括筛选第三或进一步的表位结合区。这样，不管是开放或闭合构象，所产生的多特异性配体均含有两个以上表位结合特异性。本发明第二构型的优选方面，当多特异性配体包含两个以上的表位结合区时，所述区中的至少两个区为闭合构象且竟争结合，其它区可以竟争结合也可以独立自由地与其关联的表位结合。参照本发明，术语"多特异性配体，，是指这里定义的具有一种以上的表位结合特异性的配体。这里定义的术语"闭合构象"(多特异性配体)是指配体的表位结合区相互依附或相互结合，任选通过蛋白框架，致使一个表位结合区的表位结合可与另一个表位结合区的表位结合竟争。也就是说，关联的表位被每个表位结合区单独而不是同时结合。配体的闭合构象可通过这里描述的方法获《曰付。"开放构象，，是指配体的表位结合区相互依附或相互结合，任选通过蛋白框架，致使一个表位结合区的表位结合不与另一个表位结合区的表位结合竟争。关于这里的术语"竟争"是指当第二表位与其关联的表位结合区结合时，第一表位与其关联的表位结合区的结合受到抑制。例如，结合可以在空间上被抑制，例如通过结合区的物理封闭或通过结合区的结构或环境的改变，致使与表位结合的亲和力或亲合力降低。本发明第二构型的进一步实方案中，表位在结合时可相互置换(displace)。例如，第一表位可存在于抗原上，第一表位与其关联的第一结合区结合时可造成对第二结合区的空间位阻或者构型改变，这样置换了与第二结合区结合的表位。优选结合能力降低25%或更多，优选40%、50%、60%、70%、80%、2090%或更多，优选高达100%或近乎100%，以致结合^皮完全抑制。表位的结合可用常规的抗原结合分析如ELISA，或基于荧光的技术如FRET,或观'J量分子质量的表面等离子体共才展4支术(sufaceplasmonresonance)等方法测定。本发明提供的方法优选每一个表位结合区具有不同的表位结合特异性。本发明上下文中的第一和第二"表位"可理解为不相同的表位且不被单一的单特异性配体结合。它们可以分布在不同抗原上，或分布在相同抗原上，但以充分的距离隔开，不形成能被常规抗体中单个单一特异性的Vh/V^结合对结合的单个实体。实验中，如果单链抗体形式(功能域抗体(domainantibody),或dAb)的独立的两个可变区被一个针对两个表位的单一特异性的VH/VL配体分别竟争的话，那么认为这两个表位相距不够远，不能认为是本发明所指的分开的表位。本发明中闭合构象的多特异性配体不包括WO02/02773中描述的配体。因此，本发明中配体不包括能通过共同作用结合任一种或多种抗原或表位的互补VH/Vi对。取而代之，本发明中的配体优选包括非互补的VH-VH对或VL-V^对。优选，在每一个V『Vh或VL-VL对中的每一个VH区或VL区具有不同的表位结合特异性。并且表位结合位点如此排列使得一位点上的表位结合竟争另一个位点上的表位结合。依照本发明，优选每一表位结合区包含免疫球蛋白可变区；更具优势的是每个免疫球蛋白可变区或者是轻链可变区(VO或重链可变区(VH)。本发明的第二构型中，存在于本发明配体中的免疫球蛋白的功能区是非互补的，也就是说，它们不相结合成VH/VL抗原结合位点。因此，本发明中第二构型定义的多特异性配体包含同一亚型的免疫球蛋白的功能区，即,轻链可变区(vo或重链可变区(VH)。此外，本发明配体是闭合构象时，所述免疫球蛋白的功能区可以是CamelidVHH型。另一实施方案中，本发明的配体不包含CamelidVHH区。更具体的是，本发明中的配体不包括相对于人VH区而言是CamelidVHH区特有的一个或多个氨基酸残基。优选单个可变区来自针对不同抗原或表位有结合活性的抗体。例如，通过人工免疫法至少可部分分离出可变区。其它的方法在本领域也是已知的，包括从人抗体库的分离或通过人工抗体基因的合成。可变区可优选结合超抗原如蛋白A或蛋白L。能结合超抗原是正确折叠的抗体可变区的一个特性，使得这些可变区从重组或突变的功能区文库中分离出来。本发明中表位结合区包含蛋白框架和表位相互作用位点(优选存在于蛋白框架表面)。表位结合区也可以基于蛋白框架而不是免疫球蛋白功能区。例如，天然细菌受体如SpA等已被用作嫁接CDR的框架，以生成能与一种或多种表位特异性结合的配体。这一方法的详细资料参见US5,831,012。其它适宜框架包括基于纤连蛋白和亲和体的那些框架。适用方法在WO98/58965中详述。其它适用框架包括lipocallin和CTLA4，参见vandenBeuken等，J.Mol.Biol.310,591-601(2001),以及诸如在WO0069907(MedicalResearchCouncil)中描述的那些框架，它们是基于例如细菌GroEL或其它伴侣多肽的环状结构。蛋白框架可以组合，例如，CDR可以嫁接于CTLA-4框架上，并与IgVH区或Vl区一起組成多价配体。同样，纤连蛋白、lipocallin和其它框架也可以組合。本领域技术人员将会理解，依照本发明方法制备的闭合构象多特异性配体的表位结合区可以在同一多肽链上，或者不同的多肽链上。如果可变区在不同多肽链上，那么它们可以通过一个接头相连，优选通常是一个柔韧的接头如多肽链，化学连接基团，或本领域已知的任意其它方法。第一和第二表位结合区可以通过共价或非共价方式结合。如果所迷区是共价结合，那么结合可例如由二硫键介导。在本发明第二构型中，第一和第二表位优选是不同的。它们可以全部或部分是多肽，蛋白或核酸，可以是天然的或合成的。这样，本发明中的配体可以结合表位或抗原，并作为拮抗剂或激动剂起作用(如EPO受体激动剂)。在一个实施方案中配体的表位结合区具有相同的表位特异性，可以例如同时结合其相应表位(当多个表位拷贝出现在同一种抗原上时)。在另一个实施方案中这些表位由不同的抗原提供，因此配体能结合表位并桥联所述抗原。本领域技术人员会理解对表位和抗原的选择是广泛而且多样的。例如，它们可以是人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶辅助因子或DNA结合蛋白。适当的细胞因子和生长因子包括但不仅限于ApoE,Apo-SAA,BDNF，心脏营养蛋白-1,EGF,EGF受体，ENA-78,Eotaxin,Eotaxin-2,Exodus-2，EpoR，酸性FGF,碱性FGF,成纤维细胞生长因子-10,FLT3配体，CX3C趋化因子(CX3C),GDNF,G-CSF,GM-CSF,GF-卩l,胰岛素,IFN-y，IGF-I,IGF-II,IL-la,IL-1卩，IL-2,IL-3,IL-4,IL-5，IL-6,IL-7，IL-8(72a.a.),IL-8(77a.a.),IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18(IGIF),a抑制素，(3抑制素，IP-10,角质形成细胞生长因子-2(KGF-2),KGF，瘦蛋白，LIF,淋巴细胞趋化因子，苗勒抑制物，单核细胞集落抑制因子，单核细胞趋化蛋白，M-CSF,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2,MCP-3,MCP-4,MDC(67a.a,)，MDC(69a.a.),MIQMIP-la,MIP-1卩,MlP-3a,MIP-3卩，MIP-4,髓样祖细胞抑制因子-l(MPIF-l),NAP-2,Neurturin,神经生长因子，卩-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M,PDGF-AA，PDGF-AB,PDGF-BB,PF-4,RANTES，SDFla，SDF1(3,SCF,SCGF,干细胞因子(SCF),TARC，TGF-a,TGF-卩，TGF-(32,TGF-卩3，肿瘤坏死因子(TNF),TNF-a,TNF-(3,TNF受体I,TNF受体II，TNIL-l,TPO,VEGF，VEGF受体1,VEGF受体2,VEGF受体3,GCP陽2，GRO/MGSA，GRO-卩，GRO-y,HCC1,1-309,HER1,HER2,HER3，HER4，TACE识别位点，TNFBP-I和TNFBP-II,以及在本文附件2和附件3中公开的任何靶物质，可以是以附件中阐述的组合方式、以不同的组合方式或独立存在。细胞因子受体包括前述细胞因子的受体如IL-1RI;IL-6R;IL-10R;IL-18R,以及附件2或3中阐明的细胞因子的受体和附件2和3中公开的受体。可以理解，所列举的实例并不是穷尽性的。当多特异性配体结合两个表位(相同或不同抗原上的两个表位)时，所述抗原可以从此列表中选择。双特异性配体优选可用于靶向作用于细胞因子和其它在生物体治疗情形下起协同作用的分子。因此，本发明提供了增加两种或两种以上细胞因子活性的方法，包括给予一种能结合上述两种或两种以上细胞因子的双特异性配体。在这一发明中，双特异性配体可以是任何双特异性配体，包括含有互补和/或非互补区的配体，开放构象的配体和闭合构象的配体。例如，本发明这方面涉及VH区和VH区的组配物(combinations)，只有VH区组配物和只有VL区组配物。治疗环境中的协同作用可通过多种途径获得。例如，如果在两个靶位被配体瞄准的条件下，目的组配物才具有治疗活性，而只瞄准一个靶位无治疗活性。在另一实施方案中，一个靶单独可提供少许或极小治疗效果，不过，与第二把位结合在一起可提供一种协同升高的治疗效应。优选本发明这方面的双特异性配体结合的细胞因子是从附件2列表中选出的。另外，双特异性配体可用于肿瘤学应用中，其中一个特异性靶是表达在细胞毒细胞上的CD89,另一个是肺瘤特异性的。作为靶的肿瘤抗原的例子在附件3中给出。本发明第二构型的实施方案中，可变区来自针对第一和/或第二抗原或表位的抗体中。优选实施方案中，可变区来自单个抗体可变区的库中。在一个实例中，该库不是在动物体内产生的或人工合成的。在另一实例中，单个可变区不是通过动物免疫分离(至少部分)的。因此单个区域可以从初始文库(naivelibrary)中分离。本发明第二种构型的另一方面，提供了一种多特异性配体，包括具有第一表位结合特异性的第一表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补第二表位结合区。所述第一和第二结合特异性可以相同或不同。此外，本发明进一步提供了一种闭合构象的多特异性配体，包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合区，其中，第一和第二结合特异性能竟争表位结合，致使闭合构象的多特异性配体不能同时结合两个表位。本发明更进一步提供了开放构象的配体，包含非互补结合区，其中，结合区是特异性针对同一靶物的不同表位。这种配体以增强的亲合力结合靶。同样，本发明提供了多价配体，包含特异性针对相同表位的非互补结合区，指向包含多拷贝所述表位的靶，如IL-5，PDGF-AA，PDGF-BB,TGF-卩,TGF-(32,TGF-(33和TNFa,例如人TNF受体1和人TNFa。同一方面，本发明的配体可构建为低亲和力结合独立表位的配体，致使结合独立表位无治疗意义；但是，结合两个表位可增加亲合力可提供治疗益处。在一实例中，正常细胞类型上独立存在的而只在异常或病变细胞如肿瘤细胞上合并存在的表位可被靶向。这种情况下，只有异常或病变细胞才能被本发明中的双特异性配体有效靶向。特异性针对相同靶上的多拷贝同一表位或相邻表位的配体(称为螯合dAb)还可以是三聚体或多聚体(四聚体或更多)配体，包含3个，4个或更多非互补结合区。例如，配体可以构建成含有3个或4个VH区或Vl区。另外，还提供了结合多亚基靶的配体，在这里，每个结合区特异性针对上述耙的亚基。配体可以是二聚体、三聚体或多聚体。优选的是根据本发明上述方面多特异性配体可通过本发明第一方面的方法获得。根据发明的第二构型的上述方面，优选第一表位结合区和第二表位结合区是非互补免疫球蛋白可变区，正如这里定义的一样。即既可以是Vh-Vh或Vl-Vl^可交区。具体的是，鳌合dAb可根据本发明的一个优选方面来制备即，采用锚定dAb制备。在此，采用一个载体构建了二聚、三聚或多聚dAb文库，该载体包含恒定的dAb，位于接头序列上游或下游，并在接头的另一端插入第二、第三和其它dAb库。例如，锚定或引导dAb可以是TAR1-5(VK),TAR1-27(VK),TAR2h-5(VH)或TAR2h-6(VK)。用不同的方法，可以避免接头的应用，例如，可采用非共价键或结合区如Vh和VK之间的天然亲和力。因此本发明提供了一种制备鳌合多聚配体的方法，包含如下步骤(a)提供一种载体，含有编码特异性针对靶的第一表位的单个结合区的核酸序列；(b)提供一种载体，编码包含特异针对上述輩巴上第二表位的第二结合区的库，第二表位和第一表位可以相同或不同，所述第二表位和所述第一表位邻近；并且(c)表达第一和第二结合区；并且(d)分离那些第一和第二结合区结合在一起的组配物，制备成靶结合二聚体。第一和第二表位是邻近的，故多聚配体能同时结合在这些表位上。这样提供的配体具有结合时亲合力增强的优势。当表位相同时，增强的亲合力是通过靶上存在多拷贝表位而获得的，为了获得亲合力增强的效果，允许至少同时有两个拷贝的表位被结合。结合区可通过几种方法结合，和接头的应用一样好。例如，结合区可包括cys残基、亲合素和链霉亲合素基因或其它方式以在合成后非共价附着。有效结合靶的那些组配物将被分离。或者，接头可出现在第一和第二结合区之间，这些结合区可从单个载体中以单个多肽形式表达，该多肽包括第一结合区、接头和第二结合区库，如上所述。在一个优选方面，结合抗原时，第一和第二结合区是自然结合的，例如，VH区和VK区在结合相邻表位时将自然地以三种相互作用方式结合成稳定二聚体，这种结合的蛋白能通过靶结合实验分离出来。这一方法优势在于，只有结合相近邻的表位的结合区才能以正确构型结合，因此由于其对靶的高亲合力而被分离。上述发明中第二构型的上述方面的另一个实例中，至少一个表位结合区包含非免疫球蛋白"蛋白框架"或"蛋白支架"，正如这里定义的。适用的非免疫球蛋白框架包括但不仅限于从SpA，纤连蛋白，GroEL和其它伴侣分子，lipocallin,CTLA-4和亲和体(如上面提到的)中选出的任一种。根据本发明第二构型的上述方面，优选表位结合区附着在一个蛋白框架上，优选，本发明蛋白框架是免疫球蛋白框架。本发明中术语"免疫球蛋白框架"是指包括至少一个免疫球蛋白折叠的蛋白，并且可作为一种或多种表位结合区的核。正如这里所定义的。这里定义的优选免疫球蛋白框架包括从以下选出的任一种或多种一种免疫球蛋白分子，包含至少(i)抗体的QXk或人亚型)区；或(ii)抗体重链CH1区；一种免疫球蛋白分子，含有抗体重链CHl区和Ch2区；一种免疫球蛋白分子，含有抗体重链CHl区、Ch2区和Ch3区；或(ii)中任一亚类与抗体QXK或X亚型)区的联合物。铰链区也可包含在内。这些区的联合物可以例如片莫拟天然抗体，如IgG或IgM或其片,殳如Fv，scFv,Fab或F(ab')2分子。本领域技术人员会理解该举例不是穷尽性的。框架和表位结合区之间的连接，正如这里定义的一样，可以在多肽水平获得，即在编码框架和/或表位结合区的核酸表达之后。或者，连接步骤可以在核酸水平上进行。依照本发明连接蛋白框架和一种或多种表位结合区的方法包括釆用蛋白化学和/或分子生物学技术，这些方法在本领域是常规的并在本文有描述。优选闭合构象的多特异性配体可包含能结合靶分子的第一区和能结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区，例如，所述分子或基团可以是增容剂(bulkyagent)如HSA或细胞基质蛋白。正如这里应用的短语"延长配体半衰期的分子或基团"是指被本文描述的双特异性配体结合后，相对于未结合该分子或基团的配体而言增加这些双特异性配体在动物体内应用时的体内半衰期的分子或基团。在下文中描述了能延长配体半衰期的分子或基团的例子。在一个优选实施方案中，闭合构象多特异性配体只有在半衰期增强分子或基团置换时才能结合靶分子，因此，例如，一个闭合构象多特异性配体可借助增容分子(bulkymolecule)如HAS使其在受试者血流中维持循环。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体结合区之间竟争导致HSA置换并结合靶。本发明任一方面的配体，以及构建此配体中所用的dAb单体优选它们能与其关联的靶(cognatetarget)解离，解离常数(Kd)为300nM-5pM(即，3x10:5x1(T12M)，优选50nM-20pM,或5nM-200pM或lnM-100pM,1xl(T7m或更小，1x10-8m或更小，1x10-9M或更小，1x1(T"m或以下，1x10—"m或以下；和/或K。ff速率常数(K。ffratecontant)为5x10"-1xi(r7S",优选1xi(r2-1xi(r6S",或5x10-3-1xl(r5S-1,或5x10-1S-1或以下，或1x1(T2S-11或以下，或1x1(^S"或以下,或1x10"S"或以下，或1xl(rV或以下，或1x1(T6S"或以下，这通过表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance)测定得出。解离常数(Ka)定义为Koff/K。n。特别是本发明提供了一种抗TNFocdAb单体(或包含该dAb的双特异性配体)，同二聚体，异二聚体或同三聚体配体，在这里每个dAb结合TNFct。配体与TNFcx的结合的Kd为300nM-5pM(即3xl(T7-5x1(T12M)，优选50nM-20pM,更优选5nM-200pM，并且最优选1nM-100pM;若以另一种方式表达，Ka为1x1(^M或以下，优选lx1(ySM或以下，更优选lxl(T9M或以下，再优选lx10"GM或以下，且最优选1x10"M或以下；和/或K。ff速率常数为5x10"-1xi(T7S",优选1x10-2-1xio-6S",更优选5x10-3-1x1(T5S"，例如5xIO"S"或以下，优选1xl(rVl或以下，更优选1xl(y3S"或以下，更优选的是1x10"S"或以下，更优选的是1xio-5s"或以下，最优选为1x10"S-'或以下，由表面等离子体共振测定得出。更适宜的是，采用标准L929分析得出配体中和TNFoc的ND50为500nM-50pM,优选100nM-50pM,更优选lOnM-lOOpM,进一步优选InM-lOOpM;例如50nM或以下，优选5nM或以下，500pM或以下更有利，更优选200pM或以下，最优选1OOpM或以下。更加适宜的是，S己体抑制TNFot和TNFaRI(p55受体)的结合，IC50为500nM-50pM,优选100nM-50pM，更优选10nM-100pM,优选lnM100pM;例如50nM或以下，优选5nM或以下，更优选500pM或以下，200pM或以下更有利，且最优选100pM或以下。优选的是TNFa是人27TNFa。本发明进一步提供了一种抗TNF受体I的dAb单体；或包含这种dAb的双特异性配体，其与TNF受体I结合的Kd为300nM-5pM(即，3xl(T7-5x10"2M),优选50nM-20pM,更优选5nM-200pM且最优选为InM-lOOpM,例如1x1(r7M或以下，优选1x10-8M或以下，更优选1x10—9m或以下，再优选1x1(T化M或以下，且最优选1x10"M或以下；和/或K。ff速率常数为5xlO"-lx10-7s",优选1x10'2陽1xi(T6S",更优选5x10-3-1xio-5S-1,例如5x10"S"或以下，优选1x1(T2S"1或以下，更优选1xl(T3S"或以下，更优选的是1x10"S"或以下，更优选的是1x10—SS"或以下，最优选为1x10"S"或以下，由表面等离子体共振测定得出。优选的是，dAb单体配体中和TNFcc的标准实验(如，这里描述的L929或HeLa实验法)测得ND50为500nM-50pM,优选100nM-50pM,更优选10nM-100pM,lnM-100pM更有利；例如50nM或以下，优选5nM或以下，更优选500pM或以下，200pM或以下更有利且最优选1OOpM或以下。优选的是，dAb单体或配体抑制TNFoc和TNFocRI(p55受体)的结合，IC50为500nM-50pM，优选100nM-50pM,更优选10nM-lOOpM，lnM-1OOpM更有利；例如50nM或以下，优选5nM或以下，更优选500pM或以下，200pM或以下更有利，且最优选1OOpM或以下。优选的是TNF受体I靶是人TNFa。更进一步，本发明提供了一种结合血清清蛋白(SA)的dAb单体(或包含该dAb的双特异性配体)，Kd为lnM-500)LiM(即，1xl(y9-5xl(T4),优选lOOnM-lOpM。优选的是，对于包括第一个抗-SA的dAb和第二个抗另一靶的dAb的双特异性配体，第二dAb结合它的耙的亲和力(如通过表面等离子体共振测得Kd和/或Koff值，例如采用BiaCore)为第一dAb结合SA的亲和力的1-100000倍(优选100-100000,更优选1000-100000,或10000-100000倍)。例如，第一dAb结合SA的亲和力大约为lO(aM，而第二dAb结合它的靶的亲和力为100pM。优选的是，血清清蛋白为人血清清蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)结合SA(如，HSA)的Kd值约为50,优选70,更优选100，150或200nM。本发明还提供了前述dAb单体的二聚体，三聚体和多聚体，这与本发明前述方面相一致。依照本发明的包括dAb单体、二聚体和三聚体的配体可与抗体Fc区相连，Fc区包括CH2和CH3区或其中之一，还可任选包含铰链区。例如，编码作为单一核苷酸序列与一个Fc区连接的配体的载体可用来制备这种多肽。本发明第二构型另一方面，提供了一种或一种以上编码本文定义的至少一种多特异性配体的核酸分子。在一个实施方案中，配体是一种闭合构象配体。在另一个实施方案中配体是一种开放构象。多特异性配体可由单个核酸分子编码；或者，每个表位结合区可由独立的核酸分子编码。由单个核酸分子编码配体时，所述功能区可以表达为一种融合多肽，或者分开表达然后连在一起，例如采用化学连接剂。由独立的核酸分子表达的配体可通过适当的方式连在一起。核酸可进一步编码信号序列，辅助表达的多肽从宿主细胞中输出，并且表达时可与丝状噬菌体颗粒表面成分(或选择展示系统的其它成分)融合。可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示中的前导序列包括pe旧，stll,ompA,phoA,bla和pelA。本发明第二构型的另一方面，提供了一种包含本发明核酸的载体。本发明更进一步提供了一种转染有本发明载体的宿主细胞。这种载体例如在噬菌体颗粒表面表达可构建成产生用于筛选的肽结合区。因此，采用本发明的方法可选择所展示的功能区以及多特异性配体。本发明第二构型的一个优选实施方案中，肽结合区是免疫球蛋白可变区并且从单个功能区V基因库中选出。通常单个抗体的功能区的库是在丝状噬菌粒表面展示的。在优选实施方案中，每一单个抗体的功能区(domain)是通过噬菌体库与抗原结合的方式选出的。本发明还提供了一种试剂盒，至少包括本发明中的一种多特异性配体，可以是开放构象配体或闭合构象配体。本发明试剂盒可以是例如诊断试剂盒、治疗试剂盒或化学或生物种类(biologicalspecies)检测试剂盒等等。本发明第二构型的另一方面，提供了一种利用本发明配体的均相免疫观'J定法(homogenousimmunoassay)。本发明第二构型另一方面，提供了一种组合物，包含可通过本发明方法获得的闭合构象多特异性配体，和药物学上可应用的载体、稀释液或赋形剂。此外，本发明提供了采用本发明中的闭合构象多特异性配体或其组合物治疗疾病的方法。本发明一个优选实施方案中的疾病是癌症或炎症性疾病如类风湿关节炎、哮喘或克罗恩氏病(Crohn'sdisease)。本发明第二构型的另一方面，提供了一种诊断方法，包括采用本发明中的闭合构象多特异性配体或其组合物诊断疾病。因此，通常一种分析物(analyte)与闭合构象多特异性配体的结合可用作置换一种试剂，导致置换过程中信号产生。例如分析物(第二抗原)的結合能置换与抗体结合的酶(第一抗原)，提供免疫测定基础，特别是通过活性位点与抗体结合的酶。因此，本发明第二构型最后一方面提供了一种检测靶分子存在的方法，包括(a)提供一种结合在一种试剂上的闭合构象多特异性配体，上述配体特异性针对所述靶分子和所述试剂，其中，结合在配体上的所迷试剂从配体置换时导致一种可测信号的产生；(b)使闭合构象多特异性配体暴露于所述靶分子；并且(c)检测作为试剂置换结果所产生的信号。根据本发明第二构型上述方面，优势在于，试剂是酶，该酶与闭合构象多特异性配体结合时无活性。或者，试剂可以是选自以下组中的一种或多种酶底物、荧光分子、发光分子或发色分子，其与配体结合时无活性或淬灭。与这里公开的序列类似或同源(如，至少约70%序列同一性)的序列也是发明的一部分。在某些实施方案中，在氨基酸水平上，序列同一性可能约为80%、85%、90%、91%、92%，、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。核酸水平上的序列同一性可能约为70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。或者，当核酸片段在选择性杂交条件下(如很高严格杂交条件下)与该链的互补链杂交时，存在实质性同一性(substantialidentity)。核酸可存在于整个细胞或细胞裂解物中，或以部分纯化或充分纯化形式存在。两个序列的同源性或序列同一性或相似性(此处术语可交替使用)的计算按下法进行。为了最佳比较目的，对序列进行排列(如为了最佳排列，可在第一和/或第二个氨基酸或核酸序列中引入缺口而且为了比较目的可忽略非同源序列)。在一个优选实施方案中，用于比较目的的所比对的参考序列的长度为至少30%,优选至少40°/。，更优选至少50%，甚至更优选至少60%,并且甚至更优选至少70%、80%、90%、100%的参考序列的长度。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苦酸残基。当第一序列中一个位置被第二序列相应位置上的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在这个位置上是相同的。(此处使用的氨基酸或核酸"同源性"等于氨基酸或核酸"同一性")。两个序列同一性的百分比是所述序列共有相同位置的数目的函数，考虑缺口数目和每个缺口的长度，缺口的引入是两个序列达到最佳排列所需。有利的是，有默认值参数的BLAST运算法则(version2.0)可用来排列序列。在美国政府(".gov")国立卫生研究院(".nih")的国立生物技术信息中心(".ncbi，，)网址("www")中详细叙述BLAST运算法则，在7Blast/"地址录中的"blast—help,html"文件中。搜索参数定义如下，并且方便地设置了定义的默认值。BLAST(基础局部比对搜索工具，BasicLocalAlignmentSearchTool)启发式搜索法则，被blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx等程序所应用；这些程序的重要意义归因于使用Karlin和Altschul于1990在Proc.Natl.Acad.Sci,USA87(6):2264-8中的统计方法(参见上述"blasthelp.html"文件)及少数改进的发现。BLAST程序经改造用于序列相似性搜索，例如确定查询序列的同源序列。该程序通常不适用于基序-模式搜索。有关相似性搜索序列数据库中基本问题参见Altschul等(1994)。在NCBT网址中可以找到5种BLAST程序，它们执行以下任务"blastp"将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库比较；"blastn"将核苦酸查询序列与核苦酸序列数据库比较；"blastx"将核苷酸查询序列(双链)六读框(six-frame)的推测翻译产物与蛋白序列数据库比较；"tblastn"将蛋白查询序列与核苦酸序列数据库的动态六阅读框(双链)的翻译比较；"tblastx"将核苦酸查询序列六读框翻译产物与核苷酸序列数据库的六读框翻译产物比较。BLAST采用以下搜索参数HISTOGRAM显示每次搜索得分的柱状图；默认值是"yes"(见BLAST手册中参数H)。DESCRIPTIONS限定所报告指定数目的匹配序列简短描述的数目；默认值是100条描述。(见手册页参数V)也可参照EXPECT和CUTOFF。ALIGNMENTS限制指定数目数据库序列以便报告高分值片段对(HSPs);默认值是50。如果大于此值的数据库序列偶然符合报告的统计学显著性阈值(见以下EXPECT和CUTOFF),那么只有最大统计学显著性的匹配才被报告。(见BLAST手册中参数B)。EXPECT统计学显著性阈值用来报告与数据库序列的匹配；默认值是10,这样根据KarlinandAltschul(1990)的随机性才莫型，预计只有10个匹配会被偶然发现。如果一个匹配的统计学显著性大于EXPECT阈值，匹配将不被报告。EXPECT阈值越低则越严格，导致报告匹配的机会较少。分数值也可接受。(见BLAST菜单中参数E)。CUTOFFCutoff分值报告高分值片段对，默认值可从EXPECT值中计算出(见上)。只有在HSPs的统计学显著性至少与等于CUTOFF值的单个HSP统计学显著性一样高时，该HSPs用作数据库序列报告。CUTOFF值越高则越严格，导致报告匹配的机会较少。(见BLAST手册中参数S)。通常采用EXPECT,显著性阈值可以被更直观地控制。MATRIX详细说明BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的可选择的分值矩阵。默认值是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff,1992,Proc.Natl.Aacad.Sci,USA89(22):10915-9)。有效备选包括PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。BLASTN没有备选的评分矩阵；详细说明BLASTN请求中MATRIX指示回复错误反应。STRAND限定TBLASTN搜索为数据库序列的上下链；或限制BLASTN、BLASTX或TBLASTX搜索为查询序列上下链的阅读框。FILTER屏蔽如Wootton&Federhen(1993)ComputersandChemistry17:149-163中SEG程序测出的组成简单的查询序列;或屏蔽如Claverie&States,1993,ComputersandChemistry17:191-201中XNU程序测出的短周期内部重复序列，或者，用在Tatusov和Lipman(见NCBI网址)DUST程序中的BLASTN。过滤能去除blast输出中的有统计学显著性但无生物学意义的报告(例如，普通的酸、碱或富含脯氨酸区的发现)，剩余查询序列中更有生物学意义的区域可用作与数据库序列特异性匹配。由过滤程序发现的低复杂性序列，在核苷酸序列中用字母"N"取代(如N重复13次)和在蛋白序列中用字母"X"取代(如X重复9次)。过滤只用于查询序列(或其翻^^产物)，不用于数据库序列。BLASTN中默认过滤是DUST，其它程序默认滤过是SEG。SEG和XNU中一个或二者根本什么也没有屏蔽也不稀奇，当应用在SWISS-PROT中的序列时，所以不应期待过滤总会产生效果。此外，在某些情况下，序列被完全屏蔽，表明所报告的对未过滤的查询序列的任何匹配的统计学显著性是不可信的。NCBI-gi使NCBIgi标式符显示在输出中，其中还包括编号和/或基因座名称(theaccessionand/orlocusname)。最优选的是序列的比较是采用BLAST搜索简单算法进行的，在上述NCBI网址中"/BLAST"目录提供。本发明包括以下各项1.一种双特异性配体，其包含具有对第一表位或抗原的结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和互补的具有对第二表位或抗原的结合活性的第二免疫球蛋白单个可变区，其中所述抗原或表位之一或两者发挥延长配体体内半衰期的作用，且其中所述第一和第二可变区缺乏具有相同特异性的共同互补区，条件是所述双特异性配体不是由抗-HSAVH区和抗-P半乳糖苷酶Vk区组成的。2.项1的双特异性配体，其至少包含一个单个的抗体重链可变区和一个互补的单个的抗体轻链可变区，致使这两个区域能结合而形成互补的3.项2的双特异性配体，其中的Vh和Vl由抗体scFv片段提供。4.项2的双特异性配体，其中的Vh和VL由抗体Fab区提供。5.—种四链IgG免疫球蛋白配体，其包含项2中的双特异性配体。6.项5的四链IgG免疫球蛋白配体，其中所述IgG包含两个双特异性配体，所述双特异性配体在它们的可变区是相同的。7.项5的四链IgG免疫球蛋白配体，其中所述IgG包含两个双特异性配体，所述双特异性配体在它们的可变区是不同的。8.—种配体，其包含具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区和具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中所述第一和第二可变区之一或两者与延长配体体内半衰期的抗原结合，且所述可变区彼此不互补。9.项8中的配体，其中的第一和第二免疫球蛋白可变区是重链可变区(VH)。10.项8中的配体，其中的第一和第二免疫球蛋白可变区是轻链可变区(Vl)。11.前述任一项项的配体，其中的第一和第二表位独立结合，致使双特异性配体可以同时结合第一和第二表位或抗原。12.项11中的配体，其中的双特异性配体包含在溶液中均衡存在的第一种形式和第二种形式，其中的两种表位或抗原都独立地结合第一种形式，但竟争与第二种形式的结合。13.前述任一项项的配体，其中的可变区源自针对所述表位或抗原的免疫球蛋白。14.前述任一项项的配体，其中所述第一和第二表位存在于不同的抗原上。15.项1-11中的任何一项项的配体，其中所述第一和第二表位存在于相同的抗原上。16.前述任一项项的配体，其包含源自单个抗体功能域库的可变区。17.项16中的配体，其中所述库展示于丝状噬菌体表面，并且其中的单个抗体功能域是通过噬菌体库与抗原的结合而选出的。18.前述任一项项的配体，其中至少一个可变区的序列经突变或DNA改组纟务饰过。19.前述任一项项的双特异性配体，其中所述可变区是非共价结合的。20.项1-18中的任何一项项的双特异性配体，其中的可变区是共价结合的。21.项20中的双特异性配体，其中的共价结合是通过二硫键介导的。22.TNFa特异性的dAb单体配体，其以50nM至20pM的解离常数(Kd)和5xlO"至lxl(TS"的K。ff速率常数与人TNFa解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。23.项22中的TNFa特异性的dAb单体配体，其中的dAb是Vk。24.TNF受体1(p55)特异性的dAb单体配体，其以50nM至20pM的解离常数(Kd)和5x10"至lxl(T7S"的K。ff速率常数与TNF受体1解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。25.项22-24任一项的dAb单体配体，其中的单体在标准细胞测定法中以500nM至50pM的ND50中和人TNFa或TNF受体1。26.TNF受体1(p55)特异性的dAb单体配体，其中的dAb在标准细胞测定法中以《lOOnM的ND50拮抗TNF受体1的活性，并且dAb在该测定法中在《lO(iM的浓度刺激TNF受体1活性达<5%。27.血清清蛋白(SA)特异性的dAb单体配体，其以InM至500|aM的解离常数(Kd)与SA解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。28.项27中的dAb单体配体，其中的单体在标准配体结合测定法中以InM至500|liM的IC50结合SA。29.TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TARl-5-19的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。30.TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR1-5的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。31.TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR1-27的氨基酸序列或与其至少80。/。同源的序列。32.TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-10的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。33.TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-10的氨基酸序列或与其至少90%同源的序列。34.TOP受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-5的氨基酸序列或与其至少80。/。同源的序列。35.TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-5的氨基酸序列或与其至少90%同源的序列。36.SA特异性的dAb单体配体，其中dAb包含MSA-16的氨基酸序列或与其至少80。/。同源的序列。37.SA特异性的dAb单体配体，其中dAb包含MSA-26的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。38.项29至37任一项的dAb单体配体，其中TNFa、TNF受体1或SA是人源的形式。39.—种dAb单体，其还包含末端Cys残基。40.项29-38中的任何一项项的dAb单体，其还包含末端Cys残基。41.包含项22-40中任一项项的至少一种dAb单体的双特异性配体。42.项41的双特异性配体，其是二聚体。43.项42的双特异性配体，其中的二聚体包含项22、23和28-30中任何一项项的抗人TNFadAb和项26、27和34-36中任4可一项项的抗SAdAb。44.项42中的双特异性配体，其中的二聚体是一种同或异二聚体，其包含第一和第二抗人TNFadAb，每个dAb是项22、23和28-30中的任何一项项的dAb。45.项41中的双特异性配体，其是三聚体。46.项45中的双特异性配体，其是同三聚体，包含3个拷贝的项22、23和29-31中的任何一项项的抗人TNFadAb。47.前述任一项项的配体，其包含通用框架。48.项47中的配体，其中的通用框架包含选自DP47、DP45和DP38的VH框架；和/或VL框架是DPK9。49.前述任一项项的配体，其包含属类配体的结合位点。50.项49中的配体，其中的属类配体结合位点选自蛋白A、蛋白L和蛋白G。51.前述任一项项的配体，其中的配体包含具有一个或多个框架区的可变区，所述框架区包含与人种系抗体基因片段编码的相应框架区一样的氨基酸序列，或者所迷一个或多个框架区的氨基酸序列整体包含多至5个不同于人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。52.项1-51中的任4可一项项的配体，其中的配体包含可变区，其中FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列整体包含多至IO个不同于所述人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。53.项51或52的配体，其包含含有FW1、FW2和FW3区域的抗体可变区，所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相同。54.项51-53任一项的配体，其中所述人种系抗体基因片^:选自DP47、DP45、DP48和DPK9。55.前述任一项项的配体，其包含Vh区，该区不是Camelid免疫球蛋白可变区。56.项55中的配体，其包含VH区，该区不包含与人VH区相比对Camelid免疫球蛋白可变区而言是特异的一个或多个氨基酸。57.—种制备配体的方法，该配体包含具有第一结合特异性的第一免疫球蛋单个可变区和具有第二结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述结合特异性之一或两者是特异性针对能延长配体体内半衰期的蛋白质的，该方法包括如下步骤(a)根据能与第一表位.结合的能力选择第一可变区，(b)根据能与第二表位结合的能力选择第二可变区，(c)组合这些可变区，并且(d)根据能与上述第一和第二表位结合的能力选择配体，其中，当所述可变区互补时，所述区域都不是特异针对HSA的Vh区。58.项57中的方法，其中所述第一可变区是根据互补可变区不存在时结合所述第一表位而选择的。59.项57中的方法，其中所述第一可变区是根据第三互补可变区存在时结合所述第一表位而选择的，所述第三可变区不同于所述第二可变区。60.编码项1-56中的4壬何一项项的双特异性配体的核酸。61.项60中的核酸，其是TNFa特异性的，包含TAR1-5-19的核酸序列或与其至少70%同源的序列。62.项60中的核酸，其是TNFa特异性的，包含TAR1-5的核酸序列或与其至少70%同源的序列。63.项60中的核酸，其是TNFa特异性的，包含TAR1-27的核酸序列或与其至少70%同源的序列。64.项60中的核酸，其是TNF受体1特异性的，包含TAR2-10的核酸序列或与其至少70%同源的序列。65.项60中的核酸，其是TNP受体1特异性的，包含TAR2-10的核酸序列或与其至少80%同源的序列。66.项60中的核酸，其是TNF受体1特异性的，包含TAR2h-5的核酸序列或与其至少70%同源的序列。67.项60中的核酸，其是TNF受体1特异性的，包含TAR2h-5的核酸37序列或与其至少80%同源的序列。68.项60中的核酸，其是SA特异性的，包含MSA-16的核酸序列或与其至少70°/。同源的序列。69.项60中的核酸，其是SA特异性的，包含MSA-26的核酸序列或与其至少70%同源的序列。70.—种载体，其包含项60-69中的任何一项项的核酸。71.项70中的载体，其还包含表达双特异性配体所必需的成分。72.—种转染有项71的载体的宿主细胞。73.—种制备闭合构象多特异性配体的方法，该配体包含具有第一表位结合特异性的第一单个表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合区，其中的第一和第二结合特异性能竟争结合表位，致使闭合构象多特异性配体不能同时结合这两个表位，所述方法包括以下步骤a)根据能与第一表位结合的能力选择第一表位结合区，b)根据能与第二表位结合的能力选择第二表位结合区，c)组合这些表位结合区，致使所述区域处在闭合构象中，并且d)根据与所述第一表位和第二表位结合的能力而不是与所述两表位同时结合的能力选择闭合构象多特异性配体。74.项73中的方法，其中的第一和第二表位结合区是免疫球蛋白重链可变区(VH)。75.项73中的方法，其中的第一和第二免疫球蛋白可变区是免疫球蛋白轻链可变区(VL)。76.项73-75中的任何一项项的方法，其中的免疫球蛋白功能域源自针对所述表位的免疫球蛋白。77.项73-76中的任何一项项的方法，其中所述第一和第二表位存在于分开的抗原上。78.项73-76中的任何一项项的方法，其中所述第一和第二表位存在于相同的抗原上。79.项73-78中的任何一项项的方法，其中的可变区源自单个抗体功能域库。SO.项79的方法，其中所述库展示在丝状噬菌体表面，并且其中的单个抗体功能域是通过噬菌体库与抗原的结合而选出的。81.项73-80中的任何一项项的方法，其中至少一个免疫球蛋白可变区的序列是经突变或DNA改组而修饰过的。82.—种闭合构象多特异性配体，其包含具有第一表位结合特异性的第一表位结合区和具有第二表位结合特异性的非互补的第二表位结合区，其中的第一和第二结合特异性能竟争表位结合，致使闭合构象多特异性配体不能同时结合这两个表位。83.项82中的闭合构象多特异性配体，其可通过项73-80中的任何一项项的方法而获得。84.项82或83中的闭合构象多特异性配体，其包含一个以上的单个抗体重链可变区，或一个以上的抗体轻链可变区。85.项84中的闭合构象多特异性配体，其中的VH和VL是通过肽接头相连的。86.项84中的闭合构象多特异性配体，其中的Vh或Vl是由抗体Fab样区域提供的。87.项82-84中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其中的可变区是非共价结合的。88.项82-84中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其中的可变区是共价结合的。S9.项S7中的闭合构象多特异性配体，其中的共价结合是由二硫键介导的。90.项82-89中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其包含通用框架。91.项82-90中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其包含属类配体的结合位点。92.项91中的闭合构象多特异性配体，其中的属类配体结合位点选自蛋白A、蛋白L和蛋白G。93.项82-92中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其中的配体包含具有一个或多个框架区的可变区，所述框架区包含与人种系抗体基因片段编码的相应框架区一样的氨基酸序列，或者所述一个或多个框架区的氨基酸序列整体包含多至5个不同于人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。94.项93的闭合构象配体，其中的配体包含可变区，其中FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列整体包含多至10个不同于所述人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。95.项93或94的闭合构象配体，其包含含有FW1、FW2和FW3区域的抗体可变区，所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与人种系抗体基因片^:编码的相应框架区的氨基酸序列相同。96.项92-95中的任何一项项中的闭合构象配体，其中所述人种系抗体基因片段选自DP47、DP45、DP48和DPK9。97.项92-96中的任何一项项中的闭合构象配体，其包含Vh区，该区不是Camelid免疫球蛋白可变区。98.项97中的闭合构象配体，其中的VH区不包含与人VH区相比对Camelid免疫球蛋白可变区而言是特异的一个或多个氨基酸。99.项82-98中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体，其中所述一个特异性是针对可有效延长所述配体半衰期的制剂的。100.—种试剂盒，其包含项82-99中的任何一项项中的闭合构象多特异性配体。101.—种核酸，其编码至少一种项82-99中的任4可一项项中的闭合构象多特异性配体。102.—种包含项101中核酸的载体。103.项102中的载体，其还包含表达闭合构象多特异性配体所必需的成分。104.—种转染有项103中载体的宿主细胞。105.—种检测靶分子存在的方法，包括(a)提供一种结合在某种制剂上的闭合构象多特异性配体，所述配体是特异性针对所述靶分子和所述制剂的，其中所述配体所结合的所述制剂从该配体置换出来时产生可检测信号；(b)将所述闭合构象多特异性配体暴露于所述靶分子；并(c)检测所述制剂置换所产生的信号。106.项105中的方法，其中所述制剂是一种酶，当被闭合构象多特异性配体结合时是无活性的。107.项105中的方法，其中的制剂是一种酶的底物。108.项107中的方法，其中的制剂是一种焚光剂、发光剂或显色剂，当被配体结合时是无活性的或被淬灭。109.—种实施项105-108中的任何一项项的方法的试剂盒，其包括一种能结合靶分子的闭合构象多特异性配体及任选的一种制剂及其适用的緩沖液。110.—种综合了项105-108中的任何一项项中方法的均4El^^iSi^it111.项1-56中的任何一项项的配体，其用于治疗。112.—种药物组合物，其包含项1-56中的任何一项项的配体和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂.。113.:—种制备螯合多聚体配体的方法，包括以下步骤(a)提供包含某种核酸序列的载体，该核酸序列编码特异性针对靶分子上第一表位的单个结合区；(b)提供一种编码库的载体，所述库包含特异性针对所述靶上第二表位的第二结合区，该表位可以与第一表位相同或不同，所述第二表位与所述第一表位相邻；(c)表达所述第一和第二结合区；和(d)分离那些将所述第一和第二结合区组合在一起而生成耙结合二聚体的组合。114.项113中的方法，其中的第一和第二结合区通过接头共价结合。115.项113中的方法，其中的第一和第二结合区非共价结合。116.项113中的方法，其中的第一和第二结合区通过所述区的天然结合而结合。117.项116中的方法，其中的結合区包括Vh区和Vk区。附图简述图1:显示在VH/HAS的多样性，分布于VH/HAS抗原结合位点中H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98(分别由DVT或NNK编码的)位置上。Vk序列在L50和L53位置上有多样性。图2:显示以噬菌体展示/ScFv形式存在的库l种系VK/DVTVH;库2种系vk/nnkvh;库3种系VH/DVTV/，库4种系VH/NNKVK;这些库是通过与属类配体(genericligand)蛋白A和蛋白L结合而预先筛选的，所以绝大多数克隆和篩选库都是功能性的。这些库通过HSA(第一轮)和卩-gal(第二轮)或HAS/(3-gal选择过程或通过卩-gal(第一轮)和HSA(第二轮)(3-gal/HSA选择过程选择的。来自这些PCR克隆的可溶性scFv序列被扩增。选择编码双特异性抗体K8的一个克隆以备下一步工作。图3:显示VH链和vk链的对比。图4:显示K8抗体结合特性的描述,通过单克隆噬菌体ELISA法定性的K8抗体的结合特性，发现双特异性K8抗体能与HSA和p-gal结合并能在噬菌体表面展示，吸收信号大于l。未测出其它蛋白的交叉反应性。图5:显示用已知浓度的K8抗体片段进行的可溶性scFvELISA。用浓度为10吗/ml的IOO吗的HSA、BSA和(3-gal和浓度为l|iig/ml的100吗/ml的ProteinA包被96孔板。应用50|ug的K8scFv连续稀释液，并且用ProteinL-HRP检测所结合的抗体片段。ELISA结果证实K8抗体的双特异性本质。图6:显示采用可溶性scFvELISA分析K8V"模拟Vh克隆的結合特性。如Harrison等，MethodsEnzymol.1996;267:83-109描述的经IPTG诱导产生可溶性scFv片段，直接测定含scFv的上清。可溶性scFvELISA分析的操作如实施例1描述，结合的scFv用ProteinL-HRP检测。ELISA结果表明该克隆仍能结合(3-gal而不能结合BSA。图7:显示可变区载体1和载体2的序列。图8:是用于构建VH1/VH2多特异性配体的Ch栽体固。图9:是用于构建VK1/VK2多特异性配体的Vk栽体固。图10:TNF受体分析比较TAR1-5二聚体4、TAR1-5-19二聚体4和TAR1-5-19单体。图11:TNF受体分析比较TARl-5二聚体1-6。所有二聚体经过FPLC纯化，并显示了最佳二聚物的种类的结果。图12:不同形式的TAR1-519同型二聚体的TNF受体分析带有3U、5U或7U接头的dAb-接头-dAb形式，Fab形式和半胱氨酸铰链接头形式。图13:库1中模拟VH序列。Vh框架序列基于DP47-JH4b种系序列。库1中并入了随机化(randomisation)的NNK(N=A或T或C或G核芬酸；K=G或T核苦酸)位置用粗体下划线标出。图14:库2中模拟VH序列。Vh框架序列基于DP47-JH4b种系序列。库2中并入了随机化的NNK(N=A或T或C或G核苷酸;K=G或T核苷酸)位置用粗体下划线标出。图15:库3中模拟VK序列。VK框架序列基于DP^-W种系序列。库3中并入随机化的NNK(N=A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸)位置用粗体下划线标出。图16:抗MSAdAbMSA16和MSA26的核苦酸和氨基酸序列。图17:MSA16和MSA26抑制biacore检测。采用抑制biacore方法测定纯化的dAbMSA16和MSA26的IQ值。简言之，检测能在包被高密度MSA的biacoreCM5芯片上获得200RU应答所需dAb的浓度。一旦所需dAb浓度确定，将预期Kd值左右浓度范围的MSA抗原与dAb预先混合并孵育过夜。然后，在30i!l/分的高流速(flow-rate)测定每份预混物中dAb与包被biacore芯片的MSA的结合。图18:注射后MSA16血清水平。测定小鼠体内dAbMSA16的血清半衰期。给CD1小鼠一次静脉注射MSA16,剂量大约为1.5mg/kg。2区室模型(2compartmentmodel)的建模显示MSA16的tl/2a为0.98hr,tl/2卩为36.5hr，AUC为913hr.mg/ml。与HEL4(抗鸡卵白溶菌酶dAb)相比，MSA16具有相对延长的半衰期，HEL4的tl/2a为0.06hr和ti/2[3为0.34hr。图19:ELISA(a)和TNF受体分析(c)显示TNF与一个含有MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab样片段的结合抑制。与Fab样片段一起添加MSA能降低抑制水平。用双特异性VKCH和VKCKFab样片段探查包被有lug/mlTNFa的ELISA板，同时用TNFa结合dAb作对照，其浓度根据ELISA中能产生相同信号来计算。双特异性dAb和对照dAb都用来探查有/无2mg/mlMSA的ELISA板。双特异孔中的信号减少超过50%，而dAb孔中信号丝毫未降低(图19a)。相同的双特异性蛋白也用于有/无MSA的受体分析中，MSA的竟争也在图中显示(见图19c)。这表明MSA和双特异性分子的结合可被与TNFa结合所竟争。图20:TNF受体分析显示TAR1-5-19dAb和MSA16dAb经二石克键连成的异质二聚体对TNF结合的抑制。与二聚体一起添加MSA能以剂量依赖方式降低抑制水平。TNF受体分析(图.19(b))操作中，采用恒定浓度(18nM)的异质二聚体和一系列稀释浓度的MSA和HSA。浓度范围高达2mg/ml的HSA不能使二聚体抑制TNFa的能力降低。然而，MSA的增加以剂量依赖方式引起二聚体抑制TKFa的能力降低。(图19a)。这表明MSA和TNFa竟争结合cys连接的TAR1-5-19,MSA16二聚体。分析中MSA和HSA单独无影响TNF结合水平的作用。发明详述定义互补的(Complementary):当两个免疫球蛋白功能区属于组成关联对或组的结构家族或者它们源自这些家族并保留其特性时，那么这两个免疫球蛋白区是"互补的"。例如，抗体的Vh区和Vl区是互补的，丙个Vh区不是互补的，两个Vt区不是互补的。互补区也可在免疫球蛋白超家族其它成员中发现，如T细胞受体的Va和VP(或Y和5)区。本发明第二构型的上下文中，非互补区不能协同作用结合一个靶分子，但能独立地作用于相同或不同分子上的不同靶表位。人工合成区如不能结合表位(除非改造其能结合表位)的基于蛋白支架的区域，是不互补的。同样，(例如)基于免疫球蛋白区和纤连蛋白区的两个区域不是互补的。免疫球蛋白指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，通常包括两个(3片层和一个保守的二硫键。免疫球蛋白超家族成员参与体内细胞和非细胞相互作用的多个方面，包括在免疫系统的广泛作用(例如，抗体、T细胞受体分子诸如此类)，参与细胞粘附(如ICAM分子)和细胞内信号传导(例如受体分子，如PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合区的免疫球蛋白超家族分子。优选的是本发明涉及抗体。联合(combining):本发明中的可变区联合组成一系列区域；例如互补区可以联合，如VL区和VH区可以联合。非互补区也可联合。所述区域可通过多种方式联合，包括通过共价和非共价方式连接。功能区(区，区域(domain)):功能区是一种折叠蛋白结构，不依赖于蛋白的其它部分而保持其三级结构。通常，功能区负责蛋白的离散功能特性并且在很多情况下，所述功能区可被添加、去除或转移给其它蛋白而不损失蛋白和/或区域剩余部分的功能。单个抗体可变区是指包含抗体可变区序列特征的一个折叠多肽区域。因此，它包括完全抗体可变区和经修饰的可变区，例如，其中一个或多个环被不具有抗体可变区特征的序列取代的可变区，或者被删减的抗体可变区或包含库/文库(Repertoire):不同变异体的集合，例如，一级序列(primarysequence)不同的多肽变异体。本发明中应用的库包含至少1000个成员的多肽集合。文库/库(Library):术语"文库，，指异质多肽或核酸的混合物。文库由多个成员组成，每个成员具有单一多肽或核酸序列。在这层意义上，文库和库相同。文库的成员中序列之间的不同是文库中多样性的成因。文库可以是一种简单的多肽或核酸混合物形式，或者可以是被核酸文库转化的生物或细胞形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞诸如此类。优选的是，每个微生物或细胞单体包含只一个或有限数目的文库成员。有利的是，核酸掺入表达载体中，以便表达核酸编码的多肽。因此，在一个优选方面，文库可以是宿主生物群的形式，每一生物包含表达载体的一个或多个拷贝，载体包含核酸文库单一成员，从所述核酸能表达产生相应的多肽成员。这样，宿主生物群具有编码遗传多样性多肽变异体大库的潜能。闭合构象多特异性酉己体(closedconformationmulti-specificligand):描述一种这里定义的多特异性配体，其包含至少两个这里定义的表位结合区。术语闭合构象(多特异性配体)是指配体的表位结合区的排列使得一个表位结合区的表位结合竟争另一个表位结合区的表位结合。即关联表位可被每个表位结合区单独而非同时结合。闭合构象配体可用本文描述的方法制备。抗体抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)或片段(如Fab、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv,双抗体)不管是源自自然产生抗体的任何种类或通过重组DNA技术产生，或者从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌中分离得来。双特异性配体这里定义的配体包含第一免疫球蛋白单个可变区和第二免疫球蛋白单个可变区，在这里可变区能结合两个不同抗原或同一抗原上的两个表位，所述抗原或表位通常不被单特异性免疫球蛋白结合。例如，两个表位可存在于同一半抗原上，但不是相同表位或充分接近而被单特异性免疫球蛋白结合。本发明双特异性配体由不同特异性的可变区组成，并且不包括具有相同特异性的彼此互补的可变区对。抗原一种被本发明配体结合的分子。通常抗原被抗体配体结合并且能提高体内抗体应答。它可以是多肽、蛋白、核酸或其它分子。一般来说，45本发明中的双特异性配体是通过针对特定抗原的靶特异性而选出的。对于常规抗体和其片段，由可变环(Ll,L2,L3和HI,H2,H3)定义的抗体结合位点能结合抗原。表位常规被免疫球蛋白VH/Vt对结合的结构单位。表位定义抗体的最小结合位点，因此代表抗体的特异性靶。针对单区抗体来说，表位代表被可变区独立结合的结构单位。属类配体(Genericligand):结合库中所有成员的配体。通常，不通过上述抗原结合位点结合。非限制性例子包括蛋白A、蛋白L和蛋白G。选择通过筛选或达尔文选择方法衍化而来，在选择过程中，结合相互作用发生在区与抗原或表位之间或者抗体与抗原或表位之间。因此，第通用框架(Universalframework):对应于序列保守抗体区域的单个抗体才匡架序歹'J3口Kabat所定义的。("SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",USDepartmentofHealthandHumanServices)或对应于人种系免疫球蛋白库或结构，如ChothiaandLesk，(1987)J.Mol.Biol.196:910-917所定义的。本发明提供了单个框架或一系列这样的框架的用途，发现通过高变区单独变异可引起实质上任何结合特异性的衍生。半衰期配体体内血清浓度降低50。/。所需时间，例如，由于配体降解和/或通过自然机制引起的配体清除或隔离。本发明配体在体内能通过结合能抵抗降解和/或清除或隔离的分子而被稳定化而且延长其半衰期。通常这些分子是天然存在蛋白，它们本身具有较长的体内半衰期。如果配体在体内的功能活性持续的时间比无半衰期增加分子特异性的类似配体延长，那么该配体的半衰期即得到了延长。因此，比较针对HSA和靶分子的特异性配体和不存在HSA特异性的类似配体，后者不结合HSA但结合另一分子。例如，它可以结合靶分子的第二表位。通常，半衰期可增加10%、20%、30%、40%、50%或更多。增加的范围可能是所述半衰期的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或以上。或者或此外，增加的范围可能是所述半衰期的30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍。均相免疫分析(Homogeneousimmunoassay):—种免疫分析方法，分析物的检测不需要分离结合和未结合试剂的步骤。基本相同(或基本同源)(substantiallyidentical):第一个氨基酸或核苷酸序列与第二个氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的相同或相等(如具有相似侧链，如保守氨基酸取代)的氨基酸残基和核苷酸，因此，第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。对于抗体来说，第二抗体有与第一抗体相同的结合特异性并且至少有50%的亲和力。这里用的术语"低严格度"、"中等严格度"、"高严格度"或"非常高严格度"描述核酸杂交和冲洗的条件。杂交反应操作指南见于CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6，在这里全部引入作参考。水法和非水法在文献中都有描述，两法兼可用。这里涉及的特异杂交条件如下所述(l)低严格度杂交条件是在约45匸的6x氯化钠/梓檬酸钠(SSC)中孵育，接着用至少5(TC的0.2xSSC和0.1%SDS洗涤两次(低严格度条件洗涤温度可升至55°C)。(2)中等严格度杂交条件是在约45。C的6xSSC中孵育，接着60。C用0.2xSSC和0.1%SDS洗涤一次或一次以上；(3)高严格度杂交条件是在约45t:的6xSSC中孵育，接着65。C用0.2xSSC和0.1%SDS洗涤一次或多次；优选的(4)非常高严格度杂交条件是在65。C0.5M磷酸钠和7%SDS中孵育，接着在65。C用0.2xSSC和1。/。SDS洗涤一次或多次。非常高严格度条件(4)是优选条件，是无其它指定方法时应采用的条件。发明详述所有这里应用的科技术语除非定义为其它的，通常与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)一般技术人员常规理解的意思相同。应用于分子、遗传和生化方法(通常参见Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.和Ausubel等,ShortProtocolsinMolecularBiology第四版(1999),JohnWiley&Sons,Inc.均为这里所SI参考文献)及化学方法的标准技术。基于免疫球蛋白的多特异性配体的制备构象均可以根据以前建立应用于抗体工程中的技术而制备。如制备scFv、噬菌体抗体和其它工程抗体分子。抗体特别是双特异性抗体的制备技术实例在下列综述和引用文献中描述Winter&Milstein,(1991)Nature349:293-299;Plueckthun(1992)ImmunologicalReviews130:151-188;Wrightetal"(1992)Crti.Rev.Immunol.12:125-168;Holliger，R&Winter,G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449;Carter,etal.(1995)J.Hematother.4,463-470;Chester,K.A.&Hawkins,R.E.(1995)TrendsBiotechn.13,294-300;Hoogenboom，H.R.(1997)NatureBiotechnol.15,125-126;Fearon,D.(1997)NatureBiotechnol.15，618-619;Pliickth叫A.&Pack,P.(1997)Immunotechnology3,83-105;Carter,P.&Merchant,A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8,449-454;Holliger,P.&Winter,G(1997)CancerImmunol.Immunother.45,128-130。本发明提供了针对两个不同抗原或表位的可变区的选择以及这些可变区的后续组合。选择可变区的技术采用本领域中众所周知的库和筛选程序。天然库(Marksetal.(1991)丄Mol.Biol.,222:581;Vaughanetal.(1996)NatureBiotech.,14:309)使用从人B细胞中获得的重排V基因，这是本领域技术人员所熟知的。合成库(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.,227:381;Barbasetal.(1992)Proc.Natl.Acad,Sci.USA,89:4457;Nissimetal.(1994)EMBOJ.,13:692;Griffithsetal.(1994)EMBOJ,13:3245;DeKruifetal.(1995)J.Mol.Biol"248:97)是通过克隆免疫球蛋白V基因制备的，通常采用PCR法。PCR中的错误能导致高度随机化。VH和/或Vl库可以针对靶抗原或表位分别或一起选择，在前一种情况下，单区结合直接选择。根据本发明中制备双特异性配体的优选方法包括应用一种选择系统，在这个系统中，一个可变区库是针对结合第一抗原或表位而进行选择的，一个可变区库是针对结合第二抗原或表位而进行选择的。然后，选择出的可变的第一和第二可变区结合在一起，并且选择出能同时结合第一和第二抗原或表位的双特异性配体。闭合构象配体的选择是根据能分别而不是同时结合第一和第二抗原或表位选择出的。A.文库载体系统技术上已知的多种选择系统适用于本发明。下面举例描述这些系统。入噬菌体表达系统可作为噬菌体斑或溶源性菌落直接篩选，二者先前已述。(Huseetal.(1989)Science,246:1275;CatonandKoprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.,87;Mulli腿etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:8095;Perssonetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:2432)并在本发明中应用。尽管这些表达系统能用以筛选高达106种不同的库成员，它们不适用于大量成员(大于106成员)的筛选。文库构建的特殊用途是筛选展示系统，其能使核酸连接到它所表达的多肽。正如本文应用的一样，一种筛选展示系统是采用适当展示方法通过结合属类和/或靶配体筛选文库中的独立成员的系统。技术上已知分离大文库中目的成员的筛选程序，噬菌体展示技术可作为代表。在这些系统中不同肽序列展示在丝状噬菌体表面上(Scott和Smith(1990)Science,249:386)。已证明这些系统在制造抗体片段库中(以及编码它们的核苷酸序列)供体外筛选和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段中是有用的(McCaffertyetal.,WO92/01047)是有用的。编码VH和VL区的核苷酸序列连接在编码引导信号的基因片段上，引导信号指导Vh和V^区到达大肠杆菌周质空间，结果合成的抗体片段展示在噬菌体表位，典型例子是与噬菌体外壳蛋白(如，pin或pvni)的融合物。或者，抗体片段可向外展示在入噬菌体衣壳上(phagebodies)。基于噬菌体的展示系统优点是选择的库成员能通过简单的在细菌细胞中培养包含所选库成员的噬菌体而扩增，因为它们是生物系统。此外，由于编码多肽库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体中，测序、表达和后序的基因操作是相对直接简单的。构建噬菌体抗体展示文库和人噬菌体表达文库的方法已在技术上熟知(McCaffertyetal.(1990)Nature，348:552;Kangetal.(1991)Broc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:4363;Ckcksonetal.(1991)Nature,352:624;Lowmanetal.(1991)Biochemistry，30:10832;Burtonetal.(1991)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A,，88:10134;Hoogenboometal.(1991)NucleicAcidsRes.,19:4133;Changetal.(1991)J.Immunol.,147:3610;Breitlingetal.(1991)Gene,104:147;Marksetal.(1991)supra;Barbasetal.(1992)supra;HawkinsandWinter(1992)J.Immunol,,22:867;Marksetal.,1992，J.Biol.Chem.，267:16007;Lerneretal.(1992)Science，258:1313，纳入本文作参考)。一个特殊优势方法是scFv噬菌体文库的应用(Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879-5883;Chaudharyetal.(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070;McCaffertyetal.(1990)supra;Clacksonetal.(1991)Nature,352:624;Marksetal.(1991)J.Mol.Biol.,222:581;Chiswelletal.(1992)TrendsBiotech"10:80;Marksetal.(1992)J.Biol.Chem.,267)。展示在噬菌体衣壳蛋白上的scFv文库的多种实施方案已描述过。已知噬菌体展示方法的精确细节，正如在W096/06213和W092/01047(MedicalResearchCounciletal.)和W097/08320(Morphosys)描述的一样，这些均引入本文作参考。产生多肽文库的其它系统包括在体外合成库成员的无细胞酶设备。一个方法中，通过针对靶配体的不同轮的筛选和PCR扩增筛选RNA分子(TuerkandGold(1990)Science,249:505;EllingtonandSzostak(1990)Nature,andBach(1990)NucleicAcidsRes.,18:3203;BeaudryandJoyce(1992)Science,257:635;W092/05258和W092A4843)。类似的，体外翻i斧能用于合成多肽，可作为一种产生大文库的方法。通常包含稳定的多核糖体复合体的方法在W088/08453,W090/05785,W090/07003,W091/02076,W091/05058,和W092/02536中进一步描述。其它非基于噬菌体展示系统如在W095/22625和W095/11922(Affymax)公开的系统是采用多核糖体展示多肽用于筛选。又一种技术包括在人造区室中筛选库，使基因与其基因产物连接。如一种筛选系统中编码目的基因产物的核酸可以在油包水乳剂形成的微嚢中筛选，这在W099/02671，WO00/40712和Tawfik&Gri伍ths(1998)NatureBiotechnol16(7),652-6中描述。编码具有目的活性的基因产物的基因元件定位于微嚢中，然后在微嚢中转录和/或翻译成它们相应的基因产物(RNA或蛋白)。然后将产生具有目的活性基因产物的基因元件进行分选。该法通过多种手段检测目的活性而选择感兴趣的基因产物。B.文库的构建目的选4奪库的构建可采用本领域已知的技术，例如上述方法或通过商业渠道购买。例如本发明应用的库在例如W099/20749中被描述。一旦选择了载体系统，那么一种或多种编码感兴趣多肽的核苷酸序列克隆入该文库载体中，通过表达前诱变可产生克隆分子中的多样性；或者，如上所述，在诱变和其它选择轮次发生之前，编码蛋白可以表达和选择。编码结构上优化的多肽的核酸序列的诱变是通过标准分子方法进行的。典型用法是聚50文引用作参考)PCR是技术上熟知的方法，是通过采用一种热稳定性DNA依赖的DNA聚合酶催化多个循环的DNA复制来扩增感兴趣的靶序列。多种抗体库的构建已在Winter等，(1994)Ann.Rev.Immunology12，433-55以及所引用文献中讨论过。PCR过程采用DNA模板(至少lfg;较常用1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物；当引物组严重异质时，使用大量引物可能是有利的，因为每个序列只代表所述组的分子中的一小部分，并且在较后的扩增循环中引物的量变得有限。典型的反应混合物包括2|ilDNA、25pmol的寡核苷酸引物、2.5^1的10XPCR緩沖液l(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)、0.4|^1的1.25(iMdNTP,0.15|^1(或2.5单位)的TaqDNA聚合酶(PerkinElmer，FosterCity,CA)和去离子水，总体积为25^1。用矿物油覆盖反应体系，用程序化热循环仪进行PCR。PCR循环的每一步的长度和温度以及循环数可根据效果需要的严格性来调节。退火温度和时间均根据引物退火至模板的效率和能允许的错配程度来决定的。显然，当核酸分子同时扩增和诱变时，错配至少在合成的第一轮是必需的。优化引物退火条件的严格度是本领域普通技术人员具备的能力。采用的退火温度在3(TC-72。C。模板分子最初变性是在92。C-99。C之间变性4分钟，接着发生20-40个循环，包括变性(94。C-99。C，15秒一l分钟)、退火(根据上述讨论决定的温度，1-2分钟)、延伸(72。C,1-5分钟，根据扩增产物的长度)。最后延伸通常是72。C、4分钟，且可以接着一个不限定的步骤(0-24小时，4'C)。C.单个可变区的结合本发明所用的区，一旦被选出就可以通过技术中已知的多种方法，包括共价和非共价方法联合起来。优选方法包括使用多肽接头，正如在scFv分子连接中所描述过的(Bird等.,(1988)Science242:423-426)。适用的接头的讨论在Birdetal.Science242,423-426;Hudsonetal，JournalImmunolMethods231(1999)177-189;Hudsonetal,ProcNatAcadSciUSA85，5879-5883中提供。接头最好是柔性的、允许两个单一区域相互作用。一个接头例子是(Gly4Ser)n接头，其中『1一8，如2、3、4、5或7。在双抗体中应用的接头虽柔性较差也可以应用。(Holliger等,(1993)PNAS(USA)90:6444-6448)。在一个实施方案中，所用接头不是免疫球蛋白铰链区。可变区也可用接头以外的方法联合，例如，二硫键的使用，通过自然发生或设计的半胱氨酸残基可以开发稳定的VH-VH、Vl-Vl或VH-VL二聚体(Reiter等,(1994)ProteinEng.7:697-704)或通过重新改造可变区之间界面以促进吻合和相互作用的稳定性(Ridgeway等.,(1996)ProteinEng.7:617-621;Zhu等"(1997)ProteinScience6:781-788)。其它连接或稳定免疫球蛋白可变区特别是抗体VH区的方法也可以适当应用。根据本发明，双特异性配体可能是溶液中的闭合构象。闭合构象是两个区(如Vh和Vl)以結合形式存在，如結合的Vh-Vl对形成抗体结合位点。例如，scFv可以呈现闭合构象，取决于连接Vh区和VL区接头的排列。如果接头足以柔韧，允许区域间结合或严格将区域固定在结合部位，所述区域有可能采取闭合构象。类似的，VH区对和VL区对也可以闭合构象存在。通常，这将是区域紧密结合的一种功能，如由配体分子中的刚性接头连接。闭合构象配体不能既结合配体半衰期增加分子又结合第二靶分子。因此，配体通常只结合与配体半衰期增加分子解离的第二靶分子。此外，无接头的VH/VH、Vl/Vl或VH/VL二聚体的构建提供了区域之间的竟争。此外，本发明中配体可以是开放式构象。这种构象的配体将能同时结合配体半衰期增加分子和第二靶分子。代表性地，开放式构象的可变区(就VH-VL对而言)保持足够远的距离以便区域之间不能相互作用，不能组成一个抗体结合位点，并且不竟争结合各自的表位。就Vh/Vh或VL/VL二聚体而言，区域未被刚性接头连在一起。自然情况下，这些区域对将不竟争结合抗原也不形成抗体结合位点。虽然可以理解的是开放和闭合式双特异性配体很可能在不同情况下以多种均衡存在，Fab片段和整个抗体将主要以闭合构象存在。配体与靶的结合有可能将所述均衡的平衡向开放式构象转换。因此，本发明的某些配体在溶液中能以两种构象存在，其中之一(开放形式)能独立地结合两个抗原或表位，而另一种构型(闭合形式)只能结合一个抗原或表位；因此，抗原或表位竟争结合这种构型的配体。虽然开放构象的双特异性配体在溶液中可与闭合形式均衡存在，可以设想的是均衡趋向于闭合形式；此外，通过靶物结合，开放形式能隐变为闭合构象。因此，优选的是本发明的某些双特异性配体是呈现两种构象(开放和闭合)共存的均衡形式存在。本发明的双特异性配体可以改进以便有利于开放式构象或闭合式构象的形成。例如，用二硫键稳定VH-Vt相互作用能稳定闭合构象。此外，可以构建用于连接区域(包括VH区和VL区对)的接头以便有利于开放式构象的形成；例如，接头可在空间阻挡所述区域的结合，如在适宜部位并入大的氨基酸残基或设计一个适当的刚性结构以保持区域间物理空间的分开。D.双特异性配体的特点双特异性配体与其特异性抗原或表位的结合能通过本领域中技.术人员所熟知的包括ELISA的方法进行检测。本发明一个优选实施方案中，结合是采用单克隆噬菌体ELISA方法进行检测的。噬菌体ELISA方法可根据任一适用程序进行操作下面提供了这种方法的一个实例。每一轮选择产生的噬菌体群能通过ELISA方法测定其与所选抗原或表位的结合而得到篩选，以鉴别"多克隆"噬菌体抗体。那么，这些群体中的单个感染细菌菌落中的噬菌体能通过ELISA方法筛选以确定"单克隆"噬菌体抗体。同样有希望筛选出结合抗原或表位的可溶性抗体片段，并且也可通过ELISA方法采用诸如针对C-或N-末端标记的试剂而进行。(参见Winteretal.(1994)Ann.Rev.Immunology12,433-55以及所引文献)。选出的噬菌体单克隆抗体多样性也可采用PCR产物的凝胶电泳(Marksetal.1991,supra;Nissimetal.1994supra)，才果查，或通过载体DNA测序(Tomlinsonetal.，(1992)J,Mol.Biol.227,776)来评价。E.双特异性配体的结构如上所述，本文的抗体定义为含有至少一个重链可变区和一个轻链可变区、至少两个重链可变区或至少两个轻链可变区的抗体(如IgQIgM,IgA,IgA,IgE)或片段(Fab,Fv，二石iU定连接的Fv，scFv,双抗体)。抗体可以是至少部分源于某些种属自然产生的抗体或通过DNA重组技术产生的；或是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌中分离的。本发明优选实施方案中的双特异性配体至少包含抗体的一个单一的重链可变区和抗体的一个单一的轻链可变区，或者两个单一的重链或轻链可变区。例如，配体可包含Vn/VL对或一对VH区或一对Vl区。这种配体的第一和第二可变区可在相同多肽链上，或者，它们也可在不同的多肽链上。在相同多肽链的情况下，它们可由接头连接，接头优选肽序列，如上所述。第一和第二可变区可以共价或非共价结合，如果是共价结合，共价键可以是二硫4t。如果可变区是从V基因库中选出，例如采用这里描述的噬菌体展示技术，那么这些可变区包含通用框架区，这样它们可被本文定义的特定属类配体所识别。通用框架、属类配体等等的使用在WO99/20749中描述。每个可变区的多肽序列可通过DNA改组或突变方法改变以增加每个可变区与它互补对之间的相互作用。DNA改组在技术上已知，如由Stemmer讲授的，Stemmer,1994,Nature370:389-391和美国专利6,297,053,二者均引入本文作参考。诱变的其它方法对本领域技术人员而言是熟知的。在本发明的一个优选实施方案中，双特异性配体是单链Fv片段。在本发明的另一个优选实施方案中，双特异性配体由Fab形式组成。在另一方面，本发明提供了编码至少一种这里定义的双特异性配体的核酸。本领域技术人员依照本发明各方面将理解两个抗原或表位可以同时结合相同抗体分子。或者，它们可以竟争结合同一抗体分子。例如，在两个表位同时被结合时，双特异性配体中两个可变区能独立地结合它们的靶表位。当功能区竟争时，一个可变区能结合它的靶，而另一个可变区不能同时与其关联靶结合；或者说，第一可变区能结合它的靶，而第二可变区不能同时结合其关联靶。可变区可来自针对靶抗原或表位的抗体。另外，它们可以来自如表达在丝状噬菌体表面的单个抗体区的库，选择方法如下。通常，本发明实施中需要的核酸分子和载体构建物可以依照标准实验室手册构建和操作，如Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,USA。本发明中所用核酸操作通常在重组载体中实现。因此，本发明进一步提供了一种包括编码至少一种本发明定义的双特54异性配体的核酸的载体。这里所用载体是指用于将异源DNA引入细胞以便后续表达和/或复制的不连续的元件。选择或构建以及后续应用这些载体的方法为本领域一般技术人员熟知。多种载体已公开并可利用，包括细菌质粒、噬菌体和人工染色体和附加体载体。这些载体可用于简单克隆和诱变；或者基因表达载体也采用。本发明所用载体可被选择以适应目的多肽编码序列的大小，通常大小为0.25-40kb或更长。一种适当宿主细胞可被经体外克隆操作后的载体所转化。每个载体包括多种功能成分，通常包括克隆(或"多接头")位点，复制起点和至少一个选择标志基因。如果已知载体是一种表达载体，它另外具有一个或更多如下成分增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每一种结构位于克隆位点附近，以便与编码本发明配体的基因可操作地相连。克隆和表达载体通常含有能使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。在典型克隆载体中，此序列是一种能使载体独立于宿主染色体DNA外复制的序列，且包含复制起点或自主复制序列。这些序列对多种细菌、真菌和病毒而言是已知的。质粒pBR322的复制起点适用于绝大多数的革兰氏阴性细菌，2nm质粒起点适用于酵母，不同的病毒起点(如，SV40，腺病毒)在哺乳动物细胞克隆载体中有用。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点，除非它们用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞中，如COS细胞。有利的是，克隆或表达载体可包含选择基因，也称为筛选标志。该基因编码一种必需蛋白以供转化的宿主细胞在选择性培养基中存活或生长。未被包含篩选基因的载体转化的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。代表性的筛选基因编码的蛋白能对抗生素和其它毒素如氨苄青霉素、新霉素、氨曱喋呤或四环素产生抵抗，补充营养缺陷性不足或供给生长介质中不含的关键营养物。由于编码本发明配体的载体复制可十分方便地在大肠杆菌中完成，采用大肠杆菌选择标志，如(3-内酰胺酶基因能使大肠杆菌对氨苄青霉素产生抵抗。这些标志能从大肠杆菌质粒如pBR322或pUC质粒如pUC18或pUC19中获得。表达载体通常包含启动子，它可被宿主生物体识别并与目的编码序列可操作相连。该种启动子可以是诱导型的或组成型的。术语"可操作地连接，，是指位置并列(juxtaposition),其中所述成分之间的关系允许它们以既定方式发挥作用。可操作地连接于编码序列的控制序列以这种方式连接，以便使编码序列在与控制序列相容的条件下获得表达。适用于原核宿主的启动子包括如P-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如tac启动子。细菌系统所用启动子也通常包括可操作连接于编码序列的Shine-Ddgamo序列。优选载体是能使多肽库成员对应的核苷酸序列表达的表达载体。因此，筛选第一和/或第二抗原或表位可通过表达多肽文库成员的单个克隆分开的繁殖和表达或应用任意的选择展示系统来完成。如上所述，优选选择展示系统是噬菌体展示技术，因此，可采用噬菌体或噬菌粒载体，如pITl或pIT2。发明中应用的前导序列包括pe旧、stll、ompA、phoA、bla和pelA。一个例子是噬菌粒载体，其包含大肠杆菌复制起点(用于双链DNA复制)，也可以是噬菌体复制起点(用于单链DNA产生)。这些载体的操作和表达是本领域冲支术人员所熟知的(HoogenboomandWinter(1992)supra;Nissimetal.(1994)supra)。简言之，载体包含^-内酰胺酶基因以赋予噬菌粒的选择性，位于表达盒上游的lac启动子，表达盒从N至C末端由pe旧前导序列(指导表达多肽到达周质空间)、多克隆位点(为了克隆文库成员的核苷酸型式)、任选一个或多个肽标记(用于筛选)、任选一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pill所组成。因此，采用不同的抑制或非抑制大肠杆菌菌抹，另加葡萄糖、异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体如VCSM13,所述载体能作为质粒复制而不表达，只产生大量的多肽文库成员或产生噬菌体，其中某些噬菌体表面至少含有一拷贝的多肽-pin融合物。编码本发明配体的载体构建采用常规的连接技术。分离的载体或DNA片段被剪裁，重新连接组成所需载体的形式。如果需要，可用已知方式分析鉴定所构建载体中的正确序列。构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引入宿主细胞和分析评价表达和功能等适用方法为本领域技术人员所熟知。样品中基因序列的存在检测、扩增和/或表达的定量可通过常规方法进行，如Southern或Northern分析、Western印迹、DNA、RNA或蛋白斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或核酸或蛋白分子序列分析。如果需要，本领域的那些技术人员将很容易地想到如何修改这些方法。闭合构象多特异性配体的结构依照本发明第二构型的一方面，两个或两个以上的非互补表位结合区连接在一起以便形成一种本文定义的闭合构象。有利的是，它们可进一步附着于一个骨架或者/另外可附着于本文描述的接头，以促进表位结合位点之间的闭合构象的形成和/或维持。(I)骨架骨架可基于免疫球蛋白分子或来自上述的非免疫球蛋白中。这里定义的优选免疫球蛋白骨架包括从以下选出的任何一种或多种免疫球蛋白分子，其至少包含(i)抗体CL区(k或人亚类)；或(ii)抗体重链的CH1区；免疫球蛋白分子，其包含抗体重链的CH1和CH2区；免疫球蛋白分子，其:包含抗体重链的CH1，CH2和CH3区；或任何子集(ii)与抗体CL(k或X亚类)区的联合。铰链区也可包括在内。这种区域组合例如可模拟天然抗体如IgG或IgM，或其片段，如Fv，scFv,Fab或F(ab')2分子。本领域技术人员知道所列物质并不是穷尽性的。(II)蛋白支架每个表位结合区包括蛋白支架和一个或多个CDR区，CDR区参与该区域与一个或多个表位间的特异性相互作用。本发明表位结合区优势在于包含3个CDR。适用的蛋白支架包括从下列选出的任意一种基于免疫球蛋白区域的、基于纤连蛋白的、基于亲和体(affibody)的、基于CTLA4的、基于伴侣分子如GroEL的、基于lipocallin的和基于细菌Fc受体SpA和SpD的那些蛋白支架。本领域技术人员知道这些举例并不是穷尽性的。F:用于双特异性配体构建的支架i.主链构象的选择免疫球蛋白超家族成员的多肽链均具有相似折叠。例如，虽然抗体在一级序列上高度不同，比较其序列和晶体结构结果显示与预期相反，抗体中6个抗原结合环中的5个(H1,H2,L1,L2，L3)采用有限数目的主链构象或规范结构(ChothiaandLesk(1987)J.Mol.Bio1.，196:901;Chothiaetal.(1989)Nature,342:877)。因此，分析环长度和关键残基能推测大多数人类抗体中找到的HI、H2、LI、L2和L3的主链构象(Chothiaetal.(1992)J.Mol.Biol.，227:799;Tomlinsonetal.(1995)E画OJ.,14:4628;Williamsetal.(1996)J.Mol.Biol.，264:220)。虽然H3区在序列、长度和结构上(由于D区段的应用)57变化非常大，它也为短环长度形成有限数目的主链构象，这取决于长度及环和抗体框架上关键位置的特殊残基或残基类型的存在(Martinetal.(1996)J.Mol,Biol.，263:800;Shiraietal.(1996)FEBSLetter,399:1)。本发明双特异性抗体优势在于它们是区域文库组装而成，如VH区文库和/或Vi区文库。此外，本发明双特异性配体本身可以以文库的形式提供。本发明的一方面，双特异性配体和/或区域文库设计为在某些环长度和关键残基的选择上能保证成员的主链构象是已知的。优选它们是天然免疫球蛋白超家族分子的真正构象，以减少它们无功能的几率，如上所述。种系V基因区段可作为构建抗体或T细胞受体库的一种适用基础框架；其它序列也可应用。变异可低频发生，以便少数功能性成员可以具有改变后的主链构象，而不影响其功能。规范结构理论(canonicalstructuretheory)也用于评估配体编码的不同主链构象的数目，用于根据配体序列推测主链构象，用于选择为了多样化而不影响其规范结构的残基。已知人Vk区中的LI环能采用4种规范结构中的一种，L2环有一单独规范结构，并且90%的人VK区的L3环采用4或5种规范结构中的1种(Tomlinson等(1995),同上)；因此，在羊独的Vk区中，不同规范结构能结合组成一系列不同的主链构象。假设V、区为L1、L2和L3环编码不同范围的规范结构且VK区和区能与编码Hl和H2环数种规范结构的任意VH区配对，那么观察到的这5个环的规范结构组合的数目很大。这意味着主链构象多样性的产生在广谱结合特异性的产生中可能是必要的。然而，通过构建基于单一已知的主链构象的抗体库，结果发现与预期的相反，在靶向基本上所有抗原的充分多样性产生中主链构象多样性不是必需的。更令人惊讶的是，单个主链构象不需要共有结构-一个自然形成的构象可用作整个库的基础。因此，优选方面是本发明的双特异性配体具有单一已知的主链构象。选出的单个主链构象优选在被讨论的免疫球蛋白超家族类型分子中是常见的。若观察到大量自然发生的分子采用某种构象，则该构象是平常的。因此，依照本发明的一个优选方面，分别考虑免疫球蛋白区域每个结合环的自然发生的不同主链构象，然后可选择自然发生的可变区，它们具有不同环的主链构象的所需组合。如无适合的，最接近的相等物也可选。优选的是不同环的主链构象的所需组合是通过编码目的主链构象的种系基因区58段的选择而产生。更优选的是，所选种系基因区段本质上是频繁表达的，最优选的是它们是所有天然种系基因区段中表达最频繁的。在设计双特异性配体及其库时，6个抗原结合环的每一个的不同主链构象的出现几率可分别考虑。对于H1、H2、LI、L2和L3，选择一个特定构象，它采用自然产生分子的20%-100%的抗原结合环。通常是它测得的出现几率大于35%(即介于35%~100%之间)，理想时大于50%或甚至大于65°/0。由于绝大多数H3环无规范结构，最好是选择呈现规范结构的环中普通的主链构象。对于每个环，在自然库中经常观测的构象因此被选。在人抗体中，每个环最常用的规范结构(CS)如下H1-CSl(表达库的79%),H2-CS3(46%),Vk的L1-CS2(39%),L2-CS1(100%),VK的L3-CS1(36。/。)(计算假设K:X比率为70:30,Hoodetal.(1967)ColdSpringHarborSymp.Q画t.Biol，48:133)。对于具有规范结构的H3环，7个残基长度的CDR3(Kabatetal.(1991)Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)最常见，在残基94与残基101之间有一个盐桥。在EMBL数据库中至少有16种人类抗体序列具有所需的H3长度和关键残基以组成这种构象，且在蛋白数据库中至少有两种晶体结构能用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。最常表达的种系基因区段即规范结构的组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、VK区段02/012(DPK9)和JK区段JK1。VH区段DP45和DP38也适用。因此这些区段组合可作为基础以构建有单个目的主链构象的库。或者，基于每个独立结合环的不同主链构象的自然发生而选择的单个主链构象，取而代之的是主链构象组合的自然发生用作选择单个主链构象的基础。例如，就抗体而言，能确定出任意2个、3个、4个、5个或所有6个抗原结合环的规范结构组合的自然出现。这里，优选选择的构象在自然发生抗体中常见，最优选的是它在自然库中最经常观测到。因此，例如在人类抗体中，当考虑5个抗原结合环H1、H2、Ll、L2和L3的自然组合时，决定最常见的规范结构组合并与H3环最通用的构象组合，作为选择单个主链构象的基础。ii.规范序列的多样化已经选择了数个已知的主链构象或优选的单个已知主链构象，本发明的双特异性配体或本发明所用库能通过改变分子结合位点而构建，以产生具有结构和/或功能多样性的库。这意味变体的产生使得它们在结构和/或功能上具有充分多样性，以便能提供一系列活性。目的多样性主要通过在一或多个位置改变所选分子而产生。这些改变的位置可随机选择或优先选择。那么变异的获得既可通过随机化即常规氨基酸被任意氨基酸或其自然或合成类似物取代以产生大量变异体，或可通过用限定子集(subset)的一种或多种氨基酸取代常规氨基酸以产生有限数目的变异体。已报道多种方法引入这种多样性。易错PCR(Hawkinsetal.(1992)J.Mol.Biol.,226:889)、化学诱变(Dengetal.(1994)J.Biol.Chem.,269:9533)或细菌增变抹(Lowetal.(1996)J.Mol.Biol.,260:359)能用于将随机突变引入编码分子的基因中。选择部位的突变方法也在技术上熟知，并且包括错配寡核苷酸或简并寡核苷酸的应用，其中伴有或无PCR的应用。例如，通过靶向突变至抗原结合环已制备出几种合成抗体库。结合人破伤风类毒素的Fab的H3区已随机化生成一系列新的结合特异性(Barbasetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457)。随机或半随机H3和L3区域已附加入种系V基因区段中生成具有未突变框架区的大文库(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol"227:381;Barbasetal.(1992)Proc.Natl.Acad,Sci.USA,89:4457;Nissimetal.(1994)EMBOJ.,13:692;Griffithsetal.(1994)EMBOJ.，13:3245;DeKruifetal.(1995)J.Mol.Biol"248:97)。这种多样化已延伸到包括有些或所有其它抗原结合环(Cramerietal.(1996)NatureMed"2:100;Riechmannetal.(1995)Bio/Technology,13:475;Morphosys,WO97/08320,同上)。由于环随机化具有产生大约超过1015种单独H3结构以及类似大数目的其它5个环的变异体的能力，采用现行的转化技术或采用无细胞系统生产代表所有可能组合的库是不可行的。例如，在一种目前构建的最大库中，产生6x101()种不同抗体，只是所设计库中潜在多样性的一部分(Griffiths等(1994),同上)。在一个优选实施方案中，只有那些直接涉及分子的目的功能的产生或修饰的残基是多样化的。对于许多分子来说，所述功能将是结合靶，因此多样化应该集中于靶结合位点，同时避免分子整体折叠(overallpacking)中或维持所选主链构象中的关键残基的变化。Hi.用于抗体区域的规范序列的多样化至于抗体双特异性配体的情况，耙结合位点通常是抗原结合点。因此，在本发明高度优选的方面，本发明提供了抗体双特异性配体的库或用于抗体双特异性配体组装的库，其中只有那些抗原结合位点上的残基是变化的。这些残基在人抗体库中非常多样化，并已知在高分辨率抗体/抗原复合物中产生接触。例如，已知在自然发生抗体的L2中第50和53的位置上残基是多样的，并且观察到它们与抗原接触。相对而言，常M^方法将使相应互补决定区(CDR1)(Kabat等(1991,同上)定义的)的所有残基发生多样化，大约7个残基，而相比之下本发明所用库中两个残基多样化。这说明创造一系列抗原结合特异性所需要的功能多样化方面的重大改进。抗体多样性的自然形成是两个过程的结果种系V、D、J基因区段的体细月包重组以产生初始一级库(naiveprimaryrepertoire)(也称为种系和连接多样性)，和由V基因重排造成的体细胞高频突变。人类抗体序列分析表明一级库中的多样性集中在抗原结合位点中心，而体细胞高频突变将多样性扩散到抗原结合位点周围即一级库中高度保守的部位(Tomlinsonetal.(1996)丄Mol.Biol.,256:813)。这一补充有可能发展为搜索序列空间的有效策略，虽然主要针对抗体，但也能易于用在其它多肽库。变化的残基是组成靶结合位点的子集。在靶结合点残基的不同(包括重叠)子集，如果需要，在选择过程的不同阶段多样化。对于抗体库来说，起始的"初始(naive)"库产生为某些而不是全部的抗原结合位点残基多样化。正如本文在此引用的术语"初始，，是指未预先决定靶的抗体分子。这些分子类似那些未经免疫多样化个体的免疫球蛋白基因所编码的分子，如胎儿和新生儿的免疫系统未受广泛大量的抗原刺激过。然后针对一系列抗原或表位对库进行选择。如果需要，可在初始库多样化区域之外引入更多的多样性。这种成熟的库能根据改进的功能、特异性或亲和力而得到选择。本发明提供了构建双特异性配体结合区的两种不同初始库，或双特异性配体初始库，其中抗原结合位点的有些或全部残基被改变。初始库模拟了自然发生的一级库，多样性局限在抗原结合位点中心的残基上，这些部位在种系V基因区段上具有多样性(种系多样性)或在重组过程中被多样化(连接多样性)。那些多样化残基包括但不只限于H50,H52,H2a,H53，H55,H56，H58，H95,H96，H97,H98,L50,L53,L91，L92，L93,L94和L96。在"体纟田月包"库中，多样性局限在重组过程中发生多样化(连接多样性)或体细胞高频突变的残基上。发生多样化的残基包括但不只限于H31,H33,H35,H95,H96,H97,H98,L30，L31,L32,L34和L96。上述所列的适于这些库发生多样化的所有残基，已知在一种或多种抗体-抗原复合物中产生接触。由于在两种库中不是抗原结合位点的所有残基是变化的，所以，如果需要，可在选择过程中可通过改变剩余残基的方法引入其它多样性。本领域技术人员很清楚任何这些残基的任何亚集(或包含在抗原结合位点中的其它残基)能用作抗原结合点的最初和/或后续多样化。在构建本发明所用库中，所选部位的多样化主要在核酸水平上获得，通过改变规定多肽序列的编码序列以便使一定数目的可能氨基酸(全部20种或其子集)能整合在那个部位上。采用IUPAC(国际理论与应用化学联合会)命名法，最通用密码子是NNK,它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。NNK密码子优选采用目的是引入所需多样性。其它获得相同目的的密码子也可采用，包括NNN密码子，它可导致额外终止密码子TGA和TAA的产生。人类抗体的抗原结合位点的侧链多样化特征是对某些氨基酸残基有明显的偏爱。如果奸算毎个Vh、VK、VA区域的IO个最多样化位置的氨基酸组成的总和，大于76。/。的侧链多样性只来自7种不同的残基，它们是丝氨酸(24%)、酪氨酸(14%)、天门冬酰胺(11%)、甘氨酸(9%)、丙氨酸(7%)、天门冬氨酸(6%)和苏氨酸(6%)。这种对能提供主链的柔性的亲水残基和小残基的偏爱或许反映了倾向于结合广泛抗原或表位的表面的进化过程，也可以有助于解释在一级库中抗体所需的混杂。因为优选的是模仿这种氨基酸分布，被改变部位的氨基酸分布优选模拟抗体的抗原结合位点中所看到的。这种氨基酸替代的偏爱，允许选择某些针对一系列靶抗原的多肽(不只是抗体多肽)，易于用在任意多肽库中。有多种方法用于偏置改变部位的氨基酸分布(包括采用三核苦酸诱变法(tri-nucleotidemutagenesis)见WO97/08320),由于其易于合成，优选方法是采用常规简并密码子。通过比较由所有筒并密码子组合(单、双、三和四种简并性在每个位置上是相同的)编码的氨基酸分布图与天然氨基酸使用率，能计算出最有代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT),也可分别用IUPAC分接近目的氨基酸的分布图它们编码22%丝氨酸和11%酪氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选的是在每个多样化位置可采用DVT、DVC或DVY密码子构建文库。G:能增加配体半衰期的抗原本发明的双特异性配体以其一种构型能与一种或多种能增加该配体体内半衰期的分子结合。通常所述分子是体内自然发生的多肽，能抵抗机体内部排除非必要物质内源机制的降解和移除。例如，增加有机体半衰期的分子可从以下筛选细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是细胞外基质主要蛋白。目前大约知道位于机体不同部位的15种胶原分子，如I型胶原(占机体胶原90%)分布于骨、皮肤、腱、韧带、角膜和内脏中，II型胶原分布于软骨、脊推盘、脊索、眼玻璃状液中。.血液中蛋白，包括血浆蛋白如纤维蛋白、oc2巨球蛋白、血清清蛋白和纤维蛋白原A、纤维蛋白原B、血清淀粉样蛋白A、七珠蛋白(heptablobin)、抑制蛋白(profilin)、遍在蛋白质(ubiquitin)、子宫珠蛋白(uteroglobulin)和P2微球蛋白；酶和抑制物，如纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、oc-l抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制物。纤溶酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性前体。它通常在血流循环中发现。当纤溶酶原激活后转变成纤溶酶，显露出有效酶区以溶解血凝块中凝结血细胞的纤维蛋白原纤维。这称为纤维蛋白溶解。免疫系统蛋白，如IgE、IgG、IgM。运输蛋白，如视黄醇结合蛋白、cxH敬球蛋白。防卫素，如P防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、2和3。血脑屏障或神经组织上发现的蛋白，如促黑素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白。转铁蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(见US5977307);脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、胰岛素、胰岛素样生长因子l(IGFl)受体、胰岛素样生长因子2(IGF2)受体、胰岛素受体。位于肾脏的蛋白，如多聚胱氨酸(polycystin)、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann's抗原。位于肝脏的蛋白，如乙醇脱氢酶、G250。凝血因子X。ctl抗胰蛋白酶。HNP1a。位于肺脏的蛋白，如分泌成分(结合IgA)。位于心脏的蛋白，如HSP27。这与扩张型心肌病相关。位于皮肤的蛋质白，如角蛋白。骨特异性蛋白，如骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子P超家族的一个亚类，具有生骨活性。例如BMP-2,-4,-5,-6，-7(也称为生骨蛋白(0-1))以及BMP-8(OP-2)。肿瘤特异蛋白，包括人滋养层抗原、herceptin受体、雌激素受体、组织蛋白酶如组织蛋白酶B(见于肝脾中)。疾病特异性蛋白，如只表达在活化T细胞上的抗原包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPGL)参见Nature402,304-309;1999,OX40(TNF受体家族成员，表达在活化T细胞上，并且是唯一已知在人I型T细胞白血病病毒(HTLV-I)产生细胞上被特异性上调表达的共刺激T细胞分子)见JImmunol.2000Jul1;165(1):263-70;金属蛋白酶(与关节炎/癌症关联)，包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白(paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH;血管生成性生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管渗透性因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-a(TGFa)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、血管生成素、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、中期因子(midkine)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)、CX3C趋化因子(fractalkine)。应激蛋白(热休克蛋白，HSP)。HSP—般在细胞内发现。当在胞外发现HSP提示细胞死亡并将内容物溢出。这种非程序性细胞死亡(坏死)只在因为外伤、疾病或损伤而导致在体内胞外HSP引发免疫系统应答从而抗感染和疾病。结合胞外HSP的双特异配体可被定位于疾病部位。涉及Fc转运的蛋白。Bmmbell受体(也称为FcRB),这种Fc受体有两种功能，二者在投递中有潜在的用途。所述功能是(l)通过胎盘将IgG从母体转运给胎儿(2)防止IgG降解以延长其血清半衰期。据认为受体使IgG自内体发生再循环。见Holliger等，NatBiotechnol1997Jul;15(7):632-6。本发明中配体可设计成上述靶特异性而不需要任何增加或不增加体内半衰期。例如本发明中的配体能特异性地针对从前述组织特异性的筛选的輩巴，从而能使双特异性配体具有组织特异性靶向，或者dAb单体结合组织特异性治疗相关靶，不考虑半衰期的任何增加，尽管该结果也可达到。此外，当配体或dAb单体靶向肾或肝，这可以在体内将配体或dAb单体重新引向可选清除途径(例如，配体可从肝清除途径改为肾清除途径)。H:依照本发明第二构型的多特异性配体的应用依照本发明第二构型方法的多特异性配体可应用于体内治疗和预防、体内外诊断、体外分析和反应试剂用途等等。例如，抗体分子可用于基于抗体的分析技术，如ELISA技术，这些方法为技术人员熟知。如上所间接提到的，本发明多特异性配体可用于诊断、预防和治疗。Western分析和原位蛋白才企测；在这些应用中，配体根据技术常用手段而标记。此外，当与层析支持物如树脂复合时，这种抗体多肽可用于制备性亲和层析程序。所有这些方法为本领域技术人员熟知。本发明闭合构象的多特异性配体的诊断用途包括对分析物的均相分析，应用的是闭合构象的多特异性配体能竟争结合两个靶位的能力，从而两个靶不能同时结合(闭合构象)，或应用它们能同时结合两个靶的能力(开放构象)。药物开发应用的诊断和研究分析系统的制造商已十分热切地寻求真正的均相免疫分析形式。主要诊断市场包括医院、诊所和门诊、涉及商业的实验室、血库和家庭中的人类测试，不用于人的诊断(例如食品检测、水检测、环境检测、生物防护和兽医检测)，以及最终研究(包括药物开发、基础研究和学术研究)。目前，所有这些市场应用的免疫分析系统都围绕化学发光、ELISA、荧光或有时采用的放免技术而建立。每一种分析形式需要分离步骤(从非结合试剂中分离结合的试剂)。在某些情况下，需要几步分离的步骤。增加这些附加步骤增加了试剂和自动化操作、需要时间、影响最终分析结果。在人类诊断中，分离步骤可以是自动化的，掩饰了问题，但不能解决问题。机器人技术、添加试剂、添加孵育时间等增加了相当成本和复杂性。在药物开发中如高通量筛选中，用非常低水平测试分子马上逐个测试数百万样本，添加附加分离步骤可使执行筛选的能力丧失。然而，不进行分离会在读数中产生太多的噪音。所以，需要一个真正的均相形式以提供目前分析形式可得到的范围之内的灵敏度。优选的是一种具有高灵敏性和较大动态范围的完全定量读数分析方法。灵敏度是一个非常重要的条件，这样降低所需样品量。这些特征都是均相系统提供的特征。这在健康检测中和在药物开发中样品很珍贵时非常重要。异相系统，其是当前可用的技术，需要大量样本和昂贵的试剂。均相分析用途包括癌症检测，最大分析是用来筛选前列腺癌患者中的前列腺特异性抗原。其它用途包括生育力检查，给打算怀孕的妇女提供一系列检测，包括妊娠的(3-HCG。感染性疾病的实验包括肝炎、HIV、风渗和其它病毒和微生物以及性传播疾病。实验可用于血库检测，特别是检测fflV、A型、B型、C型和非A非B型肝炎。治疗性药物监测实验包括跟踪监测在患者体内显效的处方药水平以避免毒性，例如心率失常所用地高辛、精神病患者的笨巴比妥水平、哮喘所用的茶碱。诊断实验还可用于滥用药物检测，如可卡因、大麻等的检测。代谢实验用于测定曱状腺功能、贫血和其它生理紊乱和功能。均相免疫分析形式还可用于标准临床化验的制造。集免疫分析和化验于同一仪器上在诊断实验中十分占优势。适当的化学分析包括测定葡萄糖、胆固醇和钾等等。均相免疫分析另一个主要用途是发现药物和药物开发高通量筛选包括以超高容量测定针对靶的组合化学文库。检测信号，然后将阳性群体分成更小组，最终在细胞和动物体中检测。均相分析可用于所有这些类型的检测。在药物开发中，特别是动物研究和临床试验大量采用免疫分析。均相分析大大的促进和简化了这些操作。其它用途包括食物和饮料检测测定肉和其它食物中的大肠杆菌、沙门氏菌等；水检测包括水生植物的所有类型污染物包括大肠杆菌的检测；和兽医检测。在一个广泛实施方案中，本发明提供了一种结合分析法，包括一种结合在发明中的闭合构象多特异性配体的可检测的试剂，且通过分析物与所述闭合构象多特异性配体的结合改变可检测特性。这种检测可设定成多种不同形式，每一种均利用上述闭合构象多特异性配体的特性。分析依赖于分析物直接或间接置换制剂，导致所述制剂的可检测特性发生改变。例如当所述制剂是能催化一个具有可检测终点的反应的一种酶时，所述酶能被配体结合从而阻断其活性位点，因此使酶失活。能被闭合构象多特异性配体结合的分析物可置换酶，通过释放活性位点而使酶具有活性。然后该酶与底物反应产生一种可检测事件。在另一实施方案中，配体可以结合在酶活性位点之外，影响酶的构象从而改变其活性。例如活性位点的结构可被结合的配体局限，或活性必需的辅因子的结合被阻止。所述分析的物理实施条件可采用本领域已知的任一种形式。例如闭合构象多特异性配体/酶复合物可以测试条形式提供；底物可在测试条不同区域提供，包含分析物的溶剂允许通过配体/酶复合物迁移，置换酶，并且将它带到底物区域产生信号。或者，配体/酶复合物可以测试棒或其它固相提供，浸在分析物/底物溶液中，将酶释放到溶液中以应答分析物的存在。由于每个分析物分子潜在释放一个酶分子，所以所述分析是定量的，规定时间内产生的信号强度依赖溶液中分析物的浓度。采用闭合构象的分析物有更多可能的构型。例如，闭合构象的多特异性配体可以设计成结合酶的变构部位，从而激活酶。在这一实施方案中，无分析物存在时酶是有活性的。加入分析物可置换酶并且消除变构激活，因此使酶失活。在上述实施方案的上下文利用酶活性衡量分析物的浓度，酶活化或失活是指酶活性的增加和减少，通过测量酶催化信号生成反应的能力测量。例如，酶可以催化不可测底物转化为它的可测形式。例如，辣才艮过氧化物酶以及发色剂和化学发光剂底物在本领域被广泛应用，所述酶和发色剂或化学发光剂底物可方便买到。酶活性的增加或下降可介于10%-100%,例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%;如果是活性增加，所述增加可大于100%,即200%、300%、500%或更多，如果一皮抑制的酶基线活性测不出，不能检测为百分比。在更多构型中，闭合构象多特异性配体可以结合酶/底物对中的底物而不是酶。因此底物难以接触到酶，直到通过结合分析物酶从闭合构象多特异性配体中释放出来。这种构型的实施涉及结合酶的构型。此外，分析可以设定为结合一种荧光分子，如荧光素或另一种荧光团，67当结合配体时焚光就淬灭。这种情况下，分析物与配体结合将置换荧光分子，因此产生一个信号。本发明所用的焚光分子的备选项包括发光剂如萤光素/萤光素酶，和发色剂包括常用于免疫分析的制剂如HRP。本发明制备的多特异性配体的防治用途涉及给哺乳动物受者如人应用本发明配体。多特异性能允许抗体以高亲合力结合多聚体抗原。多特异性配体能使两个抗原交联，例如在募集细胞毒性T细胞介导肿瘤细胞系的杀伤过程中。基本纯的配体或其结合蛋白例如dAb单体，至少90-95%同质性优选给药于哺乳动物，98-99%或更多同质性最优选用于药用，特别是当哺乳动物是人时。一旦纯化，部分或完全达到所需同质性的配体可用于诊断或治疗(包括体外应用)或开发应用分析方法、免疫荧光染色等(LefkoviteandPernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,VolumesIandII，AcademicPress,NY)。配体或其结合蛋白如本发明中的dAb单体将通常用于预防、抑制或治疗炎症状态、变应性超敏反应、癌症、细菌和病毒感染和自身免疫病(包括但不只限于I型糖尿病、哞喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼齊、克罗恩氏病病和重症肌无力)。在即时应用中，术语"预防"包括在诱导疾病前给予保护性组合物。"抑制，，是指诱导事件后但在疾病临床表现前给予组合物。"治疗"包括疾病症状明显后给予保护性组合物。可利用动物模型系统，用于筛选抗体或其结合蛋白在保护或治疗疾病中的有效性。在敏感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法在技术上已知(Knightetal.(1978)J.Exp.Med.，147:1653;Reinerstenetal.(1978)NewEngJ.Med"299:515)。重症肌无力(MG)在SJL/J雌性小鼠中测试,通过用另一物种的可溶性AchR蛋白诱导该病(Lindstrometal.(1988)Adv.Immunol"42:233)。通过注射II型胶原给易感种系小鼠诱导关节炎(Stuartetal.(1984)Ann.Rev.Immunol.,42:233)。已经描述了通过注射分支杆菌热休克蛋白诱导易感大鼠发生佐剂型关节炎的模型(VanEdenetal.(1988)Nature,331:171)。小鼠曱状腺炎的诱导是通过给予曱状腺球蛋白(Maronetal.(1980)J.Exp.Med.,152:1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)自然发生或在某些品系小鼠中诱导，如Kanasawaetal.(1984)Diabetologia,27:113所描述的。EAE小鼠和大鼠作为人MS的模型。在这种模型中，脱髓鞘病变通过给予髓磷脂碱性蛋白诱导(见Paterson(1986)TextbookofImmunopathology,Mischeretal.,eds.,GruneandStratton,NewYork,pp.179-213;McFarlinetal.(1973)Science,179:478;andSatohetal.(1987)J.Immunol.,138:179)。通常，本发明的配体将以纯化形式加适当药物载体而应用。典型的说，这些载体包括水质的、醇/水溶液、乳剂或悬浮剂、包含盐和/或緩沖介质的任何载体。肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸盐林格氏液。如果必须保持多肽复合物呈悬浮态，适当的生理上能接受的佐剂可以选自增稠剂如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。静脉内注射用媒介包括液态营养补充物和电解质补充物如那些基于林格氏葡萄糖的物质。防腐剂和其它添加剂如抗菌剂和抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在(Mack(1982)Remington'sPharmaceuticalSciences,16thEdition)。本发明的配体可用作独立给药的组合物或与其它制剂联合使用。这些包括各种免疫治疗药如环孢菌素、氨曱喋呤、阿霉素或顺铂、和免疫毒素。药物组合物可包括各种细胞毒制剂或其它与本发明配体联合应用的制剂的"混合物，，，或者甚至具有不同特异性的配体的组合如用不同靶抗原或表位选择的配体，不管它们是否在使用前汇聚。本发明药物组合物的给药途径可以是那些本领域任何的一般技术人员知道的。用于治疗，非限制地包括免疫治疗，用标准方法将本发明所选配体给予任一病人。用药能通过任何适当模式包括肠胃外的、静脉内的、肌肉内的、腹膜内的、经皮、经肺途径或也可适当地通过导管直接灌注。用药的剂量和频率将根据病人年龄、性别和条件、是否与其它药物同时给予、临床医生考虑的禁忌症和其它参数来决定。本发明的配体能冻干保存并且在使用前能在适宜载体中重建。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且已知的冻干和重建技术能被应用。本领域那些技术人员知道冻干和重建能导致不同程度的抗体活性的丢失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体倾向于具有更大的活性损失)并且应用水平可以上调以给予4卜偿。包含本发明配体或其混合物的组合物能给药用于预防和/或治疗。在一69些治疗应用中，达到至少部分阻止、抑制、调节、杀伤所选择细胞群的足够剂量，或达到某些其它可测参数的足够剂量被定义为"治疗有效量"。需要达到这个剂量的量将取决于疾病的严重程度和病人本身免疫系统的一般状态，不过通常的剂量范围是每千克体重0.005-5.0mg配体，例如抗体、受体(例如T细胞受体)或其结合蛋白。0.05-2.0mg/kg/剂量较常用。预防用药时，包含本发明配体或其混合物的组合物给药时可以用相似的或略低的剂量。与治疗前出现的症状或与未用该组合物治疗个体(人或动物模型)的症状相比，如果一种或一种以上的症状减轻(如至少减轻10°/。或至少减轻临床评价标准的一个分点)，那么用这里描述的组合物进行的治疗认为是"有效的"。根据所治疗的疾病或紊乱的不同，症状将明显不同，但可由普通技术熟练的临床医师或技师测得。例如，这些症状能通过跟踪检测疾病或紊乱的一种或多种生化指标的水平而测量(例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平，受侵袭的细胞数目等)，通过监测身体表现(如，炎症、肿瘤大小等)，或通过公认的临床评价标准，例如扩大的失能状况等级(用于多发性硬化)、Irvine炎性肠病调查问巻(32个分点评价涉及肠功能、全身症状、社会功能和情感状况的生活质量的得分，范围32-224，高分表示生活质量较好)，类风湿性关节炎生活质量评分或其它公认的临床评分等级在领域中已知。疾病或紊乱的症状的持续减轻(例如，一天或一天以上或优选更长时间)至少10%或临床给出等级的一个或一个以上分点则表明是"有效，，治疗。同样，与未经组合物治疗的相似个体(人或动物模型)的相应症状相比，如果一种或多种症状的发病或严重性被推迟、降低或消除，那么本发明所述的组合物用于预防的作用是"有效的"。包含本发明配体或其混合物的组合物可用于预防和治疗背景以帮助改变、灭活、杀伤或消除哺乳动物中选择的靶细胞群。另外，这里描述的多肽选择库可用于体外选择性地杀伤、消减或者以其它方式有效消除异质细胞集合中的靶细胞群。哺乳动物血液能在体外结合配体，例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白，藉此血液中不想要的细胞被杀死或者从血液中移除，然后按照标准方法将血液回输给哺乳动物。I:本发明中半衰期增加的双特异性配体的应用本发明中方法制备的双特异性配体可以用于体内治疗和预防应用、体内诊断应用等。本发明中制备的双特异性配体的治疗和预防用途包括将本发明的配体给药于哺乳动物受者如人。本发明的双特异性抗体包含至少一种针对半衰期增强分子的特异性；一种或更多特异性可定向针对靶分子。例如双特异性IgG可以特异性针对4个表位，其中之一是在半衰期增强分子上。双特异性能允许抗体以高亲合力结合多聚抗原。双特异性抗体能使两个抗原交联，例如在募集细胞毒性T细胞介导肿瘤细胞系的杀伤过程中所发生的。基本纯的配体或其结合蛋白如dAb单体，至少90-95%同质性优选给药于哺乳动物，98-99%或更多同质性最优选用于药用，特别是当所述哺乳动物是人时。一旦纯化，部分或完全达到所需同质性的配体可用于诊断或治疗(包括体外)或开发和应用分析方法、免疫荧光染色等(LefkoviteandPernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,VolumesIandII,AcademicPress,NY)。本发明中的配体将典型地用于预防、抑制或治疗炎症状态、变应性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染和自身免疫病(包括但不只限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、克罗恩氏病和重症月几无力)。在即时应用中，术语"预防"包括在诱导疾病前给予保护性组合物。"抑制，，是指诱导事件后先于疾病临床表现出现时给予组合物。"治疗"包括疾病症状明显后给予保护性组合物。可利用动物模型系统，用于筛选双特异性配体在保护或治疗疾病中的有效性。在敏感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法在技术上已知。(Knightetal.(1978)J.Exp.Med.,147:1653;Reinerstenetal.(1978)NewEngJ.Med.,299:515)。重症肌无力(MG)在SJL/J雌性小鼠中测试，通过用另一物种的可溶性AchR蛋白诱导该病(Lindstrometal.(1988)Adv.Immunol.,42:233)。通过注射II型胶原给小鼠易感系诱导关节炎(Stuartetal.(1984)Ann.Rev.Immunol.,42:233)。已经描述了通过注射分支杆菌热休克蛋白诱导易感大鼠发生佐剂型关节炎的模型(VanEdenetal.(1988)Nature,331:171)。小鼠曱状腺炎的诱导是通过给予曱状腺J求蛋白(Maronetal.(1980)J.Exp.Med.,152:1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)自然发生或在某些小鼠系中诱导如Kanasawaetal.(1984)Diabetologia,27:113所描述的。EAE小鼠和大鼠作为人MS的模型。在这种模型中，脱髓鞘病变通过给予髓磷脂碱性蛋白诱导(见Paterson(1986)TextbookofImmunopathology,Mischeretal.，eds.，GruneandStratton,NewYork,pp.179-213;McFarlinetal.(1973)Science,179:478;andSatohetal.(1987)J.Immunol.,138:179)。本发明的双特异性配体和dAb单体能结合涉及内吞作用的胞外靶(如Clathrin),所述靶能使双特异性配体被内吞，使另一种能结合细胞内靶的特异性被投递到细胞内环境。这一策略需要双特异性配体具有在胞内保持功能的物理特征。或者，如果配体的最终细胞内区室是氧化性的，一种适当折叠的配体可能不要求是无二硫键的。通常，本双特异性配体将以纯化形式加适当药物载体而应用。通常，这些载体包括水性的或醇/水溶液、乳剂或悬浮剂、包含盐和/或緩冲介质的任意载体。肠胃外媒介包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸盐林格氏液。如果必须保持多肽复合物呈悬浮态，适当的生理上能接受的佐剂可以选自增稠剂如羧曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷S同、明胶和藻酸盐。静脉内媒介包括液态营养补充物和电解质补充物，如那些基于林格氏葡萄糖的。防腐剂和其它添加剂如抗菌剂和抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在(Mack(1982)Remington'sPharmaceuticalSciences,16thEdition)。本发明的配体可用作独立给药的组合物或和其它制剂联合使用。这些包括各种免疫治疗药如环孢菌素、氨曱喋呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒制剂或其它与本发明配体联合的制剂的"混合物"。本发明药物组合物的给药途径可以是那些本领域任何普通技术人员知道的。用于治疗，包括但不限于免疫治疗，用标准方法将本发明配体给予任一病人。用药能通过任何适当模式，包括肠胃外的、静脉内的、肌肉内的、腹膜内的、经皮、经肺途径或也可适当地通过导管直接灌注。用药的剂量和频率将根据病人的年龄、性别和状况、是否与其它药物同时给予、临床医生考虑的禁忌症和其它参数来决定。本发明的配体能冻干保存并且在使用前能在适宜载体中重建。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且已知方法的冻干和重建技术能被应用。本领域那些技术人员知道冻干和重建能导致不同程度的抗体活性的丢失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体倾向于具有更大的活性损失)并且应用水平不得不上调以补偿。包含本发明配体或其混合物的组合物能给药用于预防和/或治疗。在一些治疗应用中，达到至少部分阻止、抑制、调节、杀伤所选择细胞群的足够剂量，或达到某些其它可测参数的足够剂量被定义为"治疗有效量"。需要达到这个剂量的量将取决于疾病的严重程度和病人本身免疫系统的一般状态，不过配体的通常剂量范围是每千克体重0.005-5.0mg。剂量范围为0.05-2.0mg/kg/剂较常用。预防用药时，包含本发明配体或其混合物的组合物的给药可以用相同的或略低的剂量。一种包含本发明配体的组合物可用于预防和治疗背景以帮助改变、灭活、杀伤或移除哺乳动物中选择的靶细胞群。此外，这里描述的多肽选择库可用于体外选择性杀伤、消减或者以其它方式有效消除异质细胞集合中的靶细胞群体。哺乳动物血液能在体外结合配体，例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白，藉此血液中不想要的细胞^皮杀死或者以其它方式从血液中移除，然后按照标准方法将血液回输给哺乳动物。为了进一步描述本发明，列举了以下实施例。为了命名dAb,这里所用的人TNFa称作TAR1,人TNFa受体1(p55受体)称作TAR2。实施例1:针对人血清清蛋白(HSA)和(J-半乳糖苷酶(P-gal)的双特异性scFv抗体(K8)的筛选本实施例解释了制备针对(3-gal和HSA的双特异性抗体的方法，根据能结合卩-gal而选择与种系(模拟)Vh区連接的Vk可交区庠，根据能结合HSA而选择与种系(模拟)Vk区連接的VH可变区库。然后組合逸出的VhHSA和Vk(3-gal可变区，并且根据能结合(3-gal和HAS而选择出抗体。HSA是在人血液中发现的半衰期增强蛋白。四种用在本实验中的人噬菌体抗体库。库l种系vk/DVTVH8.46xl07库2种系VK/NNKVH9.64x1077库3种系VH/DVTVK1.47x108库4种系VH/NNKVK1.45x1o8所有抗体库基于单一的人VH(V3-23/DP47和Jh41d)和Vk(012/02/DPK9和Ll)的框架，互补决定区(CDR2和CDR3)掺入了侧链多样性。库1和库2包含模拟Vk序列，而Vh序列在H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97和H98(分别由DVT或NNK编码)位置上多样化(图1)。库3和库4包含模拟Vh序列，而Vk序列在L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96(分别由DVT或NNK编码)位置上多样化(图1)。这些库是噬菌粒pIT2/ScFv形式(图2)，并且已经根据结合属类配体、蛋白A和蛋白L而预先选择，所以未筛选库中.的绝大多数克隆是有功能的。上面所显示库的大小相当于预筛选后的大小。库1和库2在用抗原筛选前混合生成单个的Vh/模似Vk庠，库3和库4混合形成单个vk^莫拟Vh庠。对(3-gal应用VJ模拟VH库执行3个选择循环，对HSA应用Vh/模似Vk库执行3个选择循环。就(3-gal来说，噬菌体滴度从第一循环的1.1x106上升到第三循环的2.0x108。就HSA来说，噬菌体滴度从第一循环的2x104上升到第三循环的1.4xl09。该选择的执行如Griffith等(1993)所描述的，除了采用KM13辅助噬菌体(其包含一种pIII蛋白，在D2和D3区之间具有蛋白酶裂解位点)，且用含lmg/ml胰蛋白酶的PBS洗脱噬菌体。胰蛋白酶的添加是裂解来自辅助噬菌体的pIII蛋白(但不是那些来自噬菌粒的)并且通过在c-myc标记处切割来洗脱结合的scFv-噬菌体融合物(图2),因此进一步丰富了表达功能性scFv的噬菌体而背景相应地减少(Kristensen和Winter,Folding&Design3:321-328，Jul9,1998)。选择是采用包被有100吗/ml浓度的HSA或(3-gal的免疫试管。为了检测结合，每次选择的第三个循环来源的24个菌落可通过单克隆喧菌体ELISA法筛选。喧菌体微粒4妄Harrison等，MethodsEnzymol.1996;267:83-109所描述制备。用100pl的浓度为10|ig/ml的HSA或(3-galPBS液包被96孔ELISA板，在4。C条件下过夜。然后进行标准ELISA操作步骤(Hoogenboom等，1991),采用抗-M13-HRP偶联物检测结合的噬菌体。克隆选择释放ELISA信号在50|li1上清中大于1.0。接着，采用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen),对HSA筛选的VH/模拟vk库和对P-gal筛选的V"模拟VH库制备DNA制备物(preps)。为获得更大多样性，DNA制备物可从选择过程3个循环的每个循环中制备，然后一起收集对每一种抗原的DNA制备物。然后用SalI/NotD7。C过夜消化DNA制备物。得到的片段经胶纯化后，在卩-gal上筛选的来自V"模拟Vh庠的Vk链被连接，替代对HSA筛选的Vh/模似Vk庠中的模拟VK链，生成3.3x109个克隆。然后这个库既可以对HSA/(3-gal选择即第一轮关于HSA的选择，第二轮关于P-gal的选择；也可以对卩-gal/HSA选择即第一轮关于卩-gal的选择，第二轮关于HAS的选择。选择过程如上所述。每当第二轮选择之后，采用单克隆噬菌体ELISA方法(如上所述)和可溶性scFv片段的ELISA法检测48个克隆对HSA和(3-gal的结合。可溶性抗体片段的制备如Harrison等(1996)描述的一样，标准ELISA程序按照Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.,19:4133所述的方法，除了采用2%Tween/PBS作为封闭緩沖液且结合的scFv用蛋白L-HRP检测。HSA/卩-gal选择中的3个克隆(E4、E5和E8)和(3-gal/HSA选择中的2个克隆(K8和K10)能结合两种抗原。PCR扩增这些克隆中的scFv并进行测序，所用引物是LMB3和pHENs叫，如Ignatovich等(1999)JMolBiol1999Nov26;294(2):457-65所描述的方法一样。序列分析显示所有克隆是同样的。因此，只选择一个编码双特异性抗体的克隆(K8)用于进一步工作中(图3)。实施例2:K8抗体结合性能的表征首先，用单克隆噬菌体ELISA法表征K8抗体的结合特性。用100^1在PBS中浓度为10吗/ml的HSA和卩-gal以及碱性磷酸酶(APS)、牛血清清蛋白(BSA)、花生凝集素、溶菌酶和细胞色素C(用以检查交叉反应性)4。C过夜包被96孔板。用KM13拯救来自K8克隆的噬菌粒，方法如Harrison等(1996)所描述的，直接分析含噬菌体的上清(50pl)。然后进行标准ELISA程序(Hoogenboom等，1991),采用抗-M13-HRP偶联物检测结合的噬菌体。当展示于噬菌体表面的吸收信号大于1.0时，发现双特异性K8抗体能结合HAS和f3-gal(图4)。对BSA强的结合也可以观察到(图4)。由于HSA和BSA在氨基酸水平上有76。/。是同源的，所以K8抗体能识别两种结构相关蛋白是不足为奇的，未观察到与其它蛋白的交叉反应性(图4)。其次，K8抗体的结合特性可用可溶性scFvELISA法检测。可溶性scFv75片段的产生通过IPTG诱导，正如Harrison等(1996)描述的。为确定K8scFv表达水平，用蛋白A-Sepharose柱纯化50ml诱导上清中的可溶性抗体片段，正如Harlow禾口Lane，Antibodies:aLaboratoryManual,(1988)ColdSpringHarbor描述的方法一样。然后采用Sambrook等(1989)描述的方法测定OD280和计算蛋白浓度。上清中K8scFv浓度为19mg/l。接着用已知浓度的K8抗体片段进行可溶性scFvELISA检测。用100|al浓度为10(ig/ml的HSA、BSA和(3-gal和100|al浓度为l吗/ml的蛋白A包被96孔板，加入连续稀释的K8scFv溶液50)^1，用蛋白L-HRP检测结合的抗体片段。ELISA结果证实了K8抗体的双特异性本质(图5)。为确定结合卩-gal是由Vk区决定以及结合HSA/BSA是由K8scFv抗体VH区决定，用Sall/NotI消化K8scFvDNA将VK区从中切下，连接到经Sall/NotI消化过的包含模拟vh链的pIT2载体上(图1和2)。产生的克隆K8VJ模拟VH的结合特性通过可溶性scFvELISA法分析。可溶性scFv片段的产生通过IPTG诱导，正如Harrison等(1996)描述的一样，直接分析含有scFvs的上清(50ji1)。可溶性scFvELISA法按实施例1中操作，结合的scFvs用蛋白L-HRP检测。ELISA结果显示该克隆还能结合l3-ga1,而与BSA的结合被消除(图6)。实施例3:针对抗原A和抗原B的单个VH区抗体和针对抗原C和抗原D的单个vk区抗体的筛选本实例描述了一种制备针对抗原A和抗原B的单个VH区抗体和针对抗原C和抗原D的单个VK区抗体的方法，通过筛选无互补可变区存在时结合这些抗原的初始(virgin)单个抗体可变区库。结合克隆的筛选和表征通过前述方法进行(见实施例5,PCT/GB02/003014)。选择出4个用于进一步研究的克隆VhI隱抗AVHVh2-抗BVhVK1画抗CVKVK2-抗DVK可以采用上述实施例1-3描述的程序，用所描述的相似方式制备包含VH区组合(即VH-VH配体)和VL区组合(即VL-VL配体)的二聚体分子。实施例4:双特异性ScFv抗体的制备和表征(针对抗原A和抗原B的VH1/VH2和4十对抗原C和抗原D的VK1/VK2)该实施例证实了双特异性ScFv抗体(针对抗原A和抗原B的VH1/VH2和针对抗原C和抗原D的VK1/VK2)能通过在ScFv载体中组合针对相应抗原筛选的VK和VH单个区域而制备。为制备双特异性抗体VH1/VH2，用NcoI/XhoI酶切来自可变区载体l(图7)中的VH1单个区域，将其连接于NcoI/XhoI酶切后的可变区载体2中(图7)以产生VHl/可变区载体2。VH2单个区是从可变区载体1中经PCR扩增的，用引物在5'端引入SalI限制酶位点，在3'端引入Notl限制酶位点。然后PCR产物用SalI/Notl消化并将其连接于SalI/Notl酶切后的VHl/可变区载体2中以生成VHl/VH2/可变区载体2。VKl/VK2/可变区载体2用相似方式生成。制备的VH1/VH2ScFv和VK1/VK2ScFv的双特异性本质是通过前述的可溶性scFvELISA法证实(见实施例6，PCT/GB02/003014)。竟争ELISA按前述方法进行(见实施例8，PCT/GB02/003014)。可能的结果-VH1/VH2ScFv能同时结合抗原A和抗原B-VK1/VK2ScFv能同时结合抗原C和抗原D-VH1/VH2ScFv的结合是竟争性的(当与抗原A结合时，VH1/VH2ScFv不能结合抗原B)-VK1/VK2ScFv的结合是竟争性的(当与抗原C结合时，VK1/VK2ScFv不能结合抗原D)实施例5:双特异性VH1/VH2Fab和VK1/VK2Fab的构建及其结合特性的分析为制备VH1/VH2Fab,将VH1单个区域连接入NcoI/lXho1消化的CH载体中(图8)，以生成VH1/CH;将VH2单个区域连入SalI/Notl消化的CK载体中(图9),以生成VH2/CK。将来自VH1/CH和VH2/CK的质粒共转染感受态大肠杆菌细胞，方法如前述。(见实施例8，PCT/GB02/003014)。用IPTG诱导包含VH1/CH和VH2/CK质粒的克隆以制备可溶性VHl/VH2Fab,方法如前述。(见实施例8，PCT/GB02/003014)VK1/VK2Fab用相似方法制备。通过前述的竟争性ELISA法(见实施例8,PCT/GB02/003014)验证制备的Fab的结合特性。可能的结果-VH1/VH2Fab能同时结合抗原A和抗原B-VK1/VK2Fab能同时结合抗原C和抗原D-VH1/VH2Fab的结合是竟争性的(当与抗原A结合时，VH1/VH2Fab不能结合抗原B)-VK1/VK2Fab的结合是竟争性的(当与抗原C结合时，VK1/VK2Fab不能结合抗原D)实施例6:螯合dAb二聚体概述VH和VK同二聚体是用柔性多肽接头连成dAb-接头-dAb形式。载体的构建是dAb-linker-dAb形式，含有不同长度的甘氨酸-丝氨酸接头3U:(Gly4Ser)3、5U:(Gly4Ser)5、7U:(Gly4Ser)7。二聚体库的构建采用导向dAb在接头上游TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)和在接头下游的相应第二dAb的库。采用该法，选出新的二聚体dAb。二聚化对抗原结合的效应能通过ELISA、BIAcore研究、细胞中和和受体结合分析测定。TAR1-5和TAR1-27的二聚化大大改善了结合亲和力和中和水平。1.0方法1.1库生成1.1.1载体设计pEDA3U、pEDA5U和pEDA7U载体以导入与dAb-接头-dAb形式相容的不同长度的接头。对于pEDA3U,正链和反义的73个石威基对寡核苷酸接头通过在緩沖液中的緩慢退火机制退火(95。C-5分钟，8CTC-10分钟，7CTC-15分钟，56。C-15分钟，42。C直到应用)，所述緩冲液包含O.lMNaCl、10mMTris-HClpH7.4;并克隆在Xhol和Notl限制性位点上。接头包含3个(Gly4Ser)单位和一个位于Sail和Notl克隆位点之间的填充区域(图解1)。为了减少噬菌体展示技术选出单体dAb的可能性，填充区域设计成包含3个终止密码子、一个Sacl限制位点和一个框移突变，目的是当无第二个dAb存在时，将所述区域置于读框外。对于pEDA5U和7U,由于接头长度的需要，每个载体设计了重叠的寡核苷酸接头，退火和用Klenow酶进行延伸。然后，在克隆前纯化片段并用适当的酶消化，采用的限制性位点是XhoI和Notl。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>图解11.1.2库制备对应于引导dAb的N末端V基因克隆于接头的上游，限制性克隆位点是NcoI和XhoI。Vh基因存在相容位点，然而克隆Vk基因需要引入追当的限制性位点。这可以采用修饰性的PCR引物(VK-DLIBF:5'cggccatggcgtcaacggacat;VK-XholR:5'atgtgcgctcgagcgtttgattt3')和2:1的SuperTaq酶(HTBiotechnologyLtd)和pfoturbo酶(Stratagene)混合物经30个循环的PCR扩增而获得。这维持了5'末端的NcoI位点而破坏了相邻的Sail位点并在3'末端引入了Xhol位点。5个引导dAb被克隆入3个二聚体载体的每一个载体中TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK)和TAR2-7(VK)。所有构建物均经测序分析鉴定。在每个载体中(pEDA3U、5U和7U)的接头上游克隆了引导dAb:TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)后，相应的第二个dAb库被克隆在接头下游。为达到这一目的，互补的dAb库是来自第一轮筛选获得的噬菌体的PCR扩增产物，筛选既可以是当TAR1-5或TAR1-27是引导dAb时针对人TNFa的VK库筛选(第一轮循环后大约1x106的多样性)，也可以是当TAR2-5或TAR2-6分别是引导dAb时针对人p55TNF受体的VH或VK库筛选(第一轮循环后二者均大约有1x105的多样性)。对于VK库的PCR扩增是通过采用引物和2:1的SuperTaq酶和pfliturbo酶混合物经30个循环的PCR扩增而获得。vh库是采用能在基因5'端引入一个Sail限制性位点的引物经PCR扩增而获得。用适当的限制酶消化dAb库的PCR产物，并用SalI/Notl限制性位点将其连入相应载体中的接头下游，并经电穿孔进入新鲜制备的感受态TG1细胞中。获得的各个库的滴度如下TAR1-5:pEDA3U=4x108,pEDA5U=8xio7，pEDA7U=1x.l。8TAR1-27:pEDA3U=6.2x108,pEDA5U=1x108,pEDA7U=1x109TAR2h陽5:pEDA3U=4x107，pEDA5U=2x108,pEDA7U=8x107TAR2h-6:pEDA3U=7.4)108,pEDA5U=1.2x108,pEDA7U=2.2xi。81.2筛选1.2.1TNFa采用被动包被有人TNFa的免疫管进行筛选。筒言之，用14ml所需.抗原过夜包被免疫管。然后用PBS洗包被免疫管3次，并用含2%奶粉的PBS封闭1-2小时，再用PBS洗3次。用含2%奶粉的PBS稀释噬菌体溶液并在室温下孵育2小时。然后用PBS洗管，用含lmg/ml胰蛋白酶的PBS洗脱噬菌体。研究了三种选择TARl-5二聚体库的策略。第一轮筛选是在用l昭/ml或20吗/ml人TNFcc包被的免疫管中进行，用含0.1。/oTween的PBS洗20次。用洗脱的噬菌体感染TG1细胞并测定其滴度(例如，MarksetalJMolBiol.1991Dec5;222(3):581-97,RichmannetalBiochemistry.1993Aug31;32(34):8848-55)。收获滴度为pEDA3U=2.8x107(l|ig/mlTNF),1.5x1()8(20吗/mlTNTF)，pEDA5U=1.8x107(lpg/mlTNF),1.6x108(20|ig/mlTNF),pEDA7U=8x106(l|ig/mlTNF)，7x107(20pg/mlTNF)采用三种不同的方法进行第二轮选择。1.在免疫管中，洗涤20次后过夜孵育再洗10次。2.在免疫管中，洗涤20次后在含有lpg/mlTNFa的洗涤緩冲液中室温孵育1小时，再洗10次。3.在链霉亲合素珠上筛选，采用33pM生物素化的人TNFa(Henderikxetal.,2002，Selectionofantibodiesagainstbiotinylatedantigens.AntibodyPhageDisplay:Methodsandprotocols,Ed.O'BrienandAtkin，HumanaPress)。将第二轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，在96孔板中制备粗制上清制备物2ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>关于TAR1-27的选择按前述方法进行，并作以下修改。第一轮篩选是在用1|ug/ml或20(ig/ml人TNFct包被的免疫管中进行，用含0.1%Tween的PBS洗20次。第二轮筛选是洗涤20次后过夜孵育再洗20次。将来自第二轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，在96孔板中制备粗制上清制备物2ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>1.2.2TNF受体l(p55受体；TAR2)如前述方法只筛选TAR2h-5库。3轮筛选是用l吗/ml或10|ag/ml人p55TNF受体包被的免疫管中进行，用含0.1%Tween的PBS洗20次后过夜孵育再洗20次。从第2、3轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，在96孔板中制备粗制上清制备物2ml。TAR2h-5滴度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>1.3筛选单个克隆是从不同筛选方法适当筛选的每个3U、5U和7U库的第2或3轮筛选中挑选出的。克隆在含有100吗/ml氨千青霉素和1%葡萄糖的2xTY中37°C孵育过夜。将这种培养物的1/100稀释液接种于2ml的含100吗/ml氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的2xTY的96孔板中，37。C震荡培养直到OD600约为0.9。然后培养物经lmMIPTG诱导在30。C诱导过夜。上清在sorval平板离心机中4000rpm离心15分钟。上清制备物用于最初筛选。1.3.1EIJSA采用蛋白A/LELISA或抗原ELISA法比较单体和二聚体重组蛋白的结合活性。简言之，用抗原或蛋白A/L4。C过夜包被96孔板。用含0.05%Tween的PBS洗板，用2%Tween-PBS封闭2小时。样品加入板中室温孵育1小时，洗板并用第二(secondary)试剂室温孵育1小时。洗板并用TMB底物显色。蛋白A/L-HRP或India-HRP用作第二试剂。对于抗原ELISAs来说，所用抗原浓度是PBS中l吗/ml的人TNFoc和人TNF受体1。由于引导dAb的存在，在大多数情况下二聚体释放阳性ELISA信号，因此可通过BIAcore测量解离速率(offratedatermination)。1.3.2BIAcore对TARl-5和TAR2h-5克隆进行BIAcore分析。为了筛选，高密度(大约lOOOORU)的人TNFa与CM5芯片偶连。50^1的人TNFa(50吗/ml)偶连到PH5.5醋酸盐緩冲液中的芯片上(5pl/min)。用标准方法再生分析后的芯片是不可能的，因为人TNFa不稳定，因此每个样本分析之后，芯片用緩沖液洗IO分钟。对于TAR1-5,第二轮选择的克隆上清用BIAcore筛选。48个克隆是用以下筛选方法获得的每一个3U、5U和7U库中筛选的。Rl:1lag/ml人TNFa免疫管，R2:lpg/ml人TNFoc免疫管，过夜洗涤。Rl:20吗/m人TNFa免疫管，R2:20昭/ml人TNFcc免疫管，过夜洗涤。Rl:l吗/ml人TNFa免疫管，R2:33pM生物素化的人TNFoc珠子。Rl:20)Lig/ml人TNFa免疫管，R2:33pM生物素化的人TNFoc珠子。为了筛选，高密度(大约4000RU)的人TNP受体与CM5芯片偶连。100^1的人p55TNF受体(10)ag/ml)连接到PH5.5醋酸盐緩沖液中的芯片上(5jal/min)。检测标准再生条件(pH2或pH3的甘氨酸)但在每种情况下抗原从芯片表面移出如TNFa的情况，因此每次分析样本后，芯片用緩冲液洗IO分钟。对TAR2-5，筛选第二轮选择的克隆上清。48个克隆是用以下筛选方法从每一个3U、5U和7U库中筛选的。Rl:l吗/ml人p55TNF受体免疫管，R2:l吗/ml人p55TNF受体免疫管，过夜洗涤。Rl:10(ig/ml人p55TNF受体免疫管，R2:10吗/ml人p55TNF受体免疫管，过夜洗涤。1.3.3受体和细胞分析在受体分析中二聚体的中和能力如下进行爱谬錄合测试抗-TNFdAb对TNF与重组TNF受体1(p55)结合的抑制能力。简言之，用30mg/ml的抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed,SanFrancisco,USA)过夜醉育Maxisorp板。用含0.05%Tween-20的磷酸盐緩冲液(PBS)洗孔，然后在与100ng〃mlTNTF受体1Fc融合蛋白(R&DSystems,Minneapolis,USA)孵育前，用含1。/。BSA的PBS封闭孔。抗-TNFdAb与TNF混合后加入洗好的孔中，终浓度为10ng/ml。检测TNF结合是用0.2mg/ml生物素化的抗TNF抗体(HyCultbiotechnology,Uben,Netherlands)、1:500稀释的HRP标记的链霉亲合素(AmershamBiosciences,UK)，接着与TMB底物(KPL,Gaithersburg，USA)孵育。加入HC1终止反应，读出450nm处的吸光度。抗-TNFdAb活性导致TNF结合的减少，所以与只有TNF的对照组相比吸光度下降。丄"9细應毒为、浙可以检测抗-TNFdAb对TNF杀伤小鼠L929成纤维细胞细胞毒作用的中和能力。(Evans，T.(2000)MolecularBiotechnology15，243-248)。简言之，将L929细胞装入微孔板中与抗-TNFdAb和100pg/mlTNF以及lmg/ml放线菌素D(Sigma，Poole,UK)共同孵育过夜。与[3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-5-(3-羧曱氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑([3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carbboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)(Promega，Madison，USA)孵育后通过读取490nm处的吸光度测定细胞活力。抗-TNFdAb活性导致TNF细胞毒活性下降，所以与只有TNF的对月敎组相比吸光度增力口。在最初的筛选中，上述备用于BIAcore分析的上请也可用于受体分析中。所选二聚体的进一步分析也可采用纯化的蛋白的受体和细胞分析来进行。可测试抗-TNFRl或抗-TNFadAb对TNF诱导Hela细胞分泌IL-8的中和能力(采用根据Akeson，L.等的方法改造的方法(1996)JournalofBiologicalChemistry271,30517-30523，描述了IL-1诱导HUVEC产生IL-8;这里我们观察了人TNFa的诱导作用，并且我们采用HeLa细胞取代HUVEC细胞系)。简言之，将HeLa细胞装入微孔板中与dAb和300pg/mlTNF共同孵育过夜。孵育后将上清吸走，用夹心ELISA(R&DSystems)测定IL-8浓度。与只有TNF的对照组相比，抗-TNFRldAb活性导致分泌入上清中的IL-8下降。L929分析广泛用于下列实验；然而，HeLaIL-8分析优选用来测定抗-TNF受体1(p55)配体；L929分析中小鼠p55的存在造成其用途中的某些限制。1.4序列分析测定在BIAcore和受体分析筛选中被证明具有有意义特性的二聚体的序列。所述序列在序列表中详细记载。1.5格式化(formatting)1.5.1TAR1-5-19二聚体显示具有良好中和特性的TAR1-5二聚体在细胞和受体分析中被重定格式(re-formatted)和分析。TAR1-5引导dAb被亲和力成熟的克隆TAR1-5-1984取代。为实现这一目的，从单独二聚体对中克隆出TAR1-5并用PCR扩增的TARl-5-19取代。此外，TAR1-5-19同二聚体也在3U、5U和7U载体中构建。基因N-末端拷贝经PCR扩增并用上述方法克隆，且C-末端基因片段利用存在的Sail和Notl限制位点克隆。1.5.2诱变琥珀终止密码子出现在dAb2中，通过定点i秀变将TAR1-5二聚体对中的C-末端dAb突变成谷氨酰胺。1.5.3Fab包含TAR1-5或TAR1-5-19的二聚体重定格式进入Fab表达载体中，用Sfil和Notl限制性位点将dAb克隆入含有CK或CH基因的表达载体中，并对其进行测序分析验证。CK载体衍生自一种基于耐氨千青霉素的pUC载体，CH载体衍生自一种耐氯霉素的pACYC载体。为了表达Fab，将dAb-CH和dAb-CK构建体共同转染进HB2151细胞中，在含有0.1%葡萄糖、100吗/ml氨千青霉素和10吗/ml氯霉素的2xTY中培养。1.5.4铰链二聚作用测定借助胱氨酸键构成的dAb二聚化。一段修改后的人IgGCl铰链区氨基酸短序列EPKSGDKTHTCPPCP通过基因工程加入到dAb的C末端区。按前述方法对编码此序列的寡核香酸接头进行合成和退火。用XhoI和Notl限制酶位点将接头克隆入含有TAR1-5-19的pEDA载体中。二聚作用原位发生于周质。1.6表达和纯化1.6.1表达如前所述，96孔板中制备的2ml上清用于初始筛选。初筛后进一步分析筛选的二聚体。二聚体构建体表达在TOP10F或HB2151细胞的上清中。简要地说，新鲜划线平板上的单个菌落在含有100吗/ml氨千青霉素和1%葡萄糖的2xTY中37。C孵育过夜。将这种培养物的1/100稀释液接种于含100吗/ml氨千青霉素和0.1%葡萄糖的2xTY中37。C震荡培养直到OD600约为0.9。然后培养物经lmMIPTG在3(TC诱导过夜。通过离心去除细胞并用蛋白A或L琼脂糖纯化上清。Fab和半胱氨酸铰链二聚体在HB2152细胞中表达为周质蛋白。过夜培养物1:IOO稀释后接种到含有0.1%葡萄糖和适当的抗生素的2xTY中生长，30。C震荡培养直到OD6oo约为0.9。然后，培养物用lmMIPTG诱导3-4小时，温度25。C。通过离心收集细胞，沉淀重悬于周质制备緩冲液中(30mMTris-HClpH8.0,lmMEDTA,20。/。蔗糖)。保留离心后上清，沉淀重悬于5mMMgS04中。再次离心收集上清、汇集并纯化。1.6.2蛋白A/L的纯化对来自蛋白L琼脂糖(Affitech,Norway)或蛋白A琼脂糖(Sigma,UK)的二聚体蛋白的纯化的优化进行检测。用蠕动泵分批或柱洗脱蛋白。测试三种缓冲液0.1M磷酸盐-柠檬酸盐緩冲液pH2.6、0.2M甘氨酸pH2.5和0.1M甘氨酸pH2.5。最优化条件确定为在蠕动泵条件下采用0.1M甘氨酸pH2.5洗脱10个柱体积。从蛋白A中的纯化是在蠕动泵条件下采用O.IM甘氨酸pH2.5进行的。1.6.3FPIX纯化进一步纯化是采用AKTAExplorer100系统(AmershamBiosciencesLtd)通过FPLC分析进行的。通过阳离子交换层析(lmlResourceS-AmershamBiosciencesLtd)分级分离TAR1-5和TAR1-5-19二聚体，用50mM醋酸盐緩冲液(pH4)中0-1M浓度梯度的NaCl洗脱。铰链二聚体通过离子交换纯化(lmlResourceQAmershamBiosciencesLtd)用25mMTrisHClpH8,0中0-1MNaCl浓度梯度洗脱。通过大小排阻层析法纯化Fab,采用superose12柱(AmershamBiosciencesLtd)进4亍，含0.05%tween的PBS;克速为0.5ml/min。接下来用vivaspin5K截留(cutoff)浓缩器(VivascienceLtd)浓缩纯化的样品。2.0结果2.1TAR1-5二聚体6x96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。上清制备物的制备和分析是采用抗原和蛋白LELISA、BIAcore和受体分析进行的。在ELISA中，每种选择方法都鉴定到阳性结合克隆并且分布于3U、5U和7U库之间。然而，由于引导dAb—直存在，所以此法不能区别结合子(binder)亲和力的高低，故采用BIAcore分析。BIAcore分析采用2ml上清液。BIAcore分析显示与单体TAR1-5相比二聚体的Koff率大大改进。单体Koff率范围是10"M，二聚体Koff率范围是1(T3-10-4M。从3U、5U和7U库中选择出Koff率很低的16个克隆，并进行测序。此外，上清用于受体分析中中和人TNFcx能力的分析。对这些分析中有中和作用的6个领先克隆(leaddone)(下称dl-d6)进行测序分析，结果显示所得6个克隆中只有3个不同的第二dAb(dAbl、dAb2和dAb3)，但是在第二个dAb出现一次以上的地方，它们通过不同长度的接头连接。TARl-5dl:3U接头2nddAb=dAbl-lng/ml抗原免疫管过夜洗涤TARl-5d2:3U接头2nddAb=dAb2-lpg/ml抗原免疫管过夜洗涤TARl-5d3:5U接头2nddAb=dAb2-lpg/ml抗原免疫管过夜洗涤TARl-5d4:5U接头2nddAb=dAb3-20pg/ml抗原免疫管过夜洗涤TARl-5d5:5U接头2nddAb=dAbl-20pg/ml抗原免疫管过夜洗涤TARl-5d6:7U接头2nddAb=dAbl-Rl-lng/ml抗原免疫管过夜洗涤，R2-珠子。进一步测定6个领先克隆。用蛋白L琼脂糖纯化周质和上清液中的蛋白并用细胞和受体分析测定。中和作用水平是变化的(表1)。确定蛋白制备的优化条件。从HB2151细胞中制备的作为上清的蛋白产量最高(大约是10mgs/L培养物)。室温条件下将上清与蛋白L琼脂糖共同孵育2小时或4。C过夜。用PBS/NaCl清洗珠子并用蠕动泵上柱于FPLC柱上。用10倍柱体积的PBS/NaCl洗珠，再用0.1M甘氨酸pH2.5洗脱。一般情况下，二聚体蛋白在单体后洗脱下来。用FPLC纯化TARl-5dl-6二聚体。获得3个种类，用FPLC纯化并用SDS-PAGE鉴定。一类相当于单体，另两类相当于不同大小的二聚体。两类中较大的可能由于C末端标记的存在。用受体分析检测这些蛋白。表l中给出的数据代表从两个二聚体种类中获得的最优结果(图11)。二聚体对(即，dAbl、dAb2和dAb3)中的3个第二dAb作为单体被克隆并用ELISA和细胞和受体分析检测。所有3种dAb在抗原ELISA中能特异性结合TNF，不与塑料和BSA发生交叉反应。作为单体，在细胞或受体分析中无一种dAb具有中和作用。2.1.2TAR1-5-19二聚体用TAR1-5-19取代6个领先克隆中的TARl-5。用细胞和受体分析法分析所有TARl-5-19二聚体，采用的是完整蛋白(只蛋白L纯化)，除非另有说明(表2)。在细胞分析中，TARl-5-19d4和TARl-5-19d3具有最好的NDso(约5nM),这与受体分析结果一致，并且比TARl-5-19单体(ND5o约30nM)有改进。虽然纯化的TAR1-5二聚体在受体和细胞分析中结果是变化的，而TAR1-5-19二聚体的结果比较一致。变化表现在蛋白纯化中使用不同洗脱緩冲液时。用0.1M磷酸盐-柠檬酸盐緩沖液pH2.6或0.2M甘氨酸pH2.5緩冲液进行的洗脱尽管在多数情况下能从蛋白L琼脂糖中除去所有蛋白，但使蛋白功能降低。在发酵罐中表达TARl-5-19d4并用阳离子交换FPLC法纯化获得完全纯化的二聚体。用FPLC纯化获得3种TARl-5d4，相当于一种单体和两种二聚体。对二聚体进行氨基酸测序。用受体分析TARI-5-19单体和TARl-5-19d4,结果是单体IC50为30nM,二聚体IC50为8nM。TARl-5-19d4和TARl-5d4与TAR1-5-19单体比较的受体分析结果如图10显示。制备3U、5U和7U载体中的TAR1-5-19同型二聚体，表达并用蛋白L纯化。用细胞和受体分析法测定蛋白，测定值IC50(受体分析用)和冊50(细胞分析用)见表3和图12。2.2FabTAR1-5和TAR1-5-19二聚体也克隆进Fab形式(Fabformat)中，表达和用蛋白L琼脂糖纯化。用受体分析评估Fab(表4)。结果显示TAR1-5-19和TAR1-5二聚体的中和作用水平与其起源的初始Gly4Ser接头二聚体相似。表达展示在CH和CK上的TAR1-5-19的TAR1-5-19Fab，用蛋白L纯化并用受体分析评估。IC50结果约为lnM。2.3TAR1國27二聚体3x96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。制备2ml上清制备物以便用ELISA和生物分析法分析。抗原ELISA分析得到71个阳性克隆。粗制上清的受体分析得到42个具有抑制活性的克隆(TNF结合0-60%)。多数情况下抑制特性与强的ELISA信号相关。测定42个克隆的序列，其中39个有独特的第二dAb序列。进一步分析具有最好抑制活性的12种二聚体。12个中和作用的克隆表达在200ml上清制备物中，用蛋白L纯化。用蛋白L和抗原ELISA、BIAcore和受体分析评价。在所有情况下获得强阳性ELISA信号。BIAcore分析提示所有克隆具有快速K。n和K。ff率(fastonandoffrate)。与单体TAR1-27相比K。ff率有所改进，然而TAR1-27二聚体的K。ff率(K。ff率范围大约是10"-10^M)比先前测得的TARl-5二聚体快(K。ff率范围大约是10-3-104M)。纯化二聚体的稳定性令人怀疑，因此为了增加其稳定性，在两种TAR1-27二聚体(d2和dl6)的纯化过程中添加5%甘油、0.5%TritonX100或0.5%NP40(Sigma)。NP40或TritonX100的加入能使纯化物产量提高约2倍。用受体分析评价所述两种二聚体。在所有纯化条件下，TARl-27d2的IC5D为约30nM。TARl-27d16在不用稳定剂时纯化后无中和作用，但在稳定条件下纯化时，其ICso为约50nM。2.4TAR2-5二聚体3x96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。制备2ml上清制备物用于分析。对每块板进行蛋白A和抗原ELISA分析。采用BIAcore分析确定了30个感兴趣的克隆具有好的K。ff率(K。ff率范围介于10-M(^M之间)。对克隆测序分析确定了13个独特的二聚体。表l:TARl-5二聚体<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>*注意二聚体2和二聚体3具有相同的第二dAb(称为dAb2)，但具有不同长度的接头(d2-(Gly4Ser)3，d3=(Gly4Ser)3)。dAbl是二聚体l、5和6中的伴侣dAb。dAb3是二聚体4中的伴侣dAb。伴侣dAb单独无中和作用。除非另外说明，FPLC纯化是通过阳离子交换。经FPLC获得的每一二聚体的最佳二聚体种类通过这些分析决定。表2:TAR1-5-19二聚体<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>二聚体细胞类型纯化蛋白级分洗脱条件受体/细胞分析丁AR卜5CH/dAblCKHB2I51蛋白L总蛋白OJM柠檬酸盐PH2.6RA~90nMTAR卜5CH/dAb2CKHB2151蛋白L总蛋白O-IM甘氨酸pH2.5RA30nMCA-60nMdAb3CH/TAR1.5CKHB2151蛋白L总蛋白O-IM柠檬酸盐pH2.6RA10OnMTARi-5-19CH/dAblCKHB2151蛋白L总蛋白0.1M甘氨酸pH2.0RA6nMdAblCH/丁ARl-5-19CKHB2151蛋白L0.1M甘氨酸pH2.0Myc/标记RA-6nM丁AR卜5-19CH/d八b2CKHB2151蛋白L总蛋白(UM甘氨酸pH2.0RA—8nMCA12nM.TAR卜5-19CH/dAb3CKHB2151蛋白L总蛋白O-IM甘氨酸pH2.0RA3nMTARl-5-19CYS二聚体的PCR构建见实施例8描述的dAb三聚体。三聚体的制备方法产生单体、二聚体和三聚体的混合物。TAR1-5-19CYS二聚体的的表达和纯化用蛋白L琼脂糖捕获法从培养上清中纯化二聚体，如实施例8所述。从TAR1-5-19CYS二聚体中分离TAR1-5-19CYS单体按照厂商指南操作，阳离子交换之前，采用PD-10柱(AmershamPharmacia)将混合的单体/二聚体样品緩冲交换入50mM醋酸钠緩冲液pH4.0中。然后将样品应用于已用50mM醋酸钠溶液pH4.0平ff过的lmLResourceS阳离子交换柱中(AmershamPharmacia)。采用以下的50mM乙酸钠pH4.0中的盐浓度梯度分离单体和二聚体15个柱体积上的150-200mM氯化钠10个柱体积上的200-45OmM氯化钠15个柱体积上的450-1000mM氯化钠用SDS-PAGE鉴定只含有二聚体的级分，然后汇集，最后加入l/5体积的1MTrispH8.0将pH增加到8.0。体外的功能结合分析TNF受体分析和细胞分析采用TNF受体和细胞分析法确定二聚体对人TNFa的亲和力。受体分析中IC5o大约为0.3-0.8nM;细胞分析中的ND50大约为3-8nM。其它可能的TAR1-5-19CYS二聚体形式PEG二聚体和常规合成的马来酰亚胺二聚体Nektar(Shearwater)提供一系列双马来酰亚胺PEG[mPEG2-(MAL)2或mPEG-(MAL)2],其能使单体形成二聚体，二聚体具有一个小接头将dAb分开，两个dAb均连接在大小为5-40kDa的PEG上。在TNF受体分析中，已显示5kDa的mPEG-(MAL)2(即[TARl-5-19]-Cys-马来酰亚胺-PEGx2,其中马来酰亚胺在二聚体中被连接在一起)的亲和力为约1-3nM。同样也可采用TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)(Tris[2-maleimidoethyl]amine)(PierceBiotechnology)或其它双功能接头制备二聚体。化学偶连方法用2,2'-二硫二吡啶(SigmaAldrich)制备二硫化物二聚体和还原的单体也是可能的。在dAbC-末端加入多肽接头或铰链小接头可以是(Gly4Ser)n这里n=l-10,如，1，2,3，4,5,6或7，也可以是一种免疫球蛋白(如，IgG铰链区或随机肽序列(如，从随机肽序列库中筛选的)，能重组在dAb和末端半胱氨酸之间。这可用于制备上述二聚体。实施例8:dAb三聚作用概要为了dAb三聚化，在蛋白C末端需要游离的半胱氨酸。半胱氨酸残基一旦还原产生游离硫醇，那么能用于特异性地偶连蛋白形成三聚的马来酰亚胺分子，例如TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)。PCR构建TARl-5-19CYS下列寡核苷酸用于特异性PCR含Sail和BamHI位点的TAR1-5-19供克隆和引入C-末端半胱氨酸残基。TrpSerAlsSerThrAsp*lieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSe:rAlsSerVal1TGGAGCGCG丁CGACGGACA丁CCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTCTGTCTGCATCTGTAACCTCGCGCAGCTGCCTGTAGGTCTACTGGGTCAGAGGTAGGAGAGACAGiW3ACATGlyAspArgVal丁hrlieThrCysArsAlaSerGinSer工leAspSerTyr乂uHisTrp92"ggagaccgtgtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattgatagttatttacattggCC丁CTGGCACAGTGGTAGTGAACGGCCCGTTCAGTCTCGTAACTATCAATAAATGTAACCGinGinProGlyLysAlaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerGluLeuGin1:1CAGAAACCAGGGAAAGCCCC丁AAGC丁CCTGATCTATAGTGCATCCGAGTTGCAAa丁ggtcgtctttggtccctttcggggattcgaggactagatatcacgtaggc丁caacgt丁SerGlyVslProSerAi:gPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie二SlGGGGTCCCATCACG丁TTCAGTGGC'AGTTCTGGGGATTTCACTC丁CACCATCtcaCCCCAGGGTAG丁GCAAAGTCACCGTCACCTAGACCCTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinValValTrpArgPro2"AGTCTGCAACC丁GAAGATTTTGCTACGTACTACTGTCAGGTTGTGTGGCGTCCTTCGTCAGACGTTGGACTTCTAAAACGATGCATGATGACAGTTGTCCAACACACCGCAGGAPheThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArgCys*"*"GlySerGly301TTTACGTTCGGCCAAGGGAAGGTGGAAATCAAACGGTGCTAATAAGGATCCGGCAAATGCAAGCCGGTTCCCTGGTTCCACCTTTAGTTTGCCACGATTATTCCTAGGCCG(*TAR1-5-19CYS序列起始点)正向引物5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'反向引物5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3'PCR反应(50)ul体积)如下建立200jiMdNTPs,0.4pM的各种引物，5pL的10xpfbTurbo緩冲液(Stratagene),100ng的模板质粒(编码TARl-5-19)，1pL的PfuTurbo酶(Stratagene)，用无菌水调节反应体积为50pL。应用下列PCR条件初始变性步骤94°C2分钟，然后进行以下25个循环94°C30秒，64°C30秒和72。C30秒，还包括最后一步延伸72°C5分钟。纯化PCR产物并用Sail和BamHI消化后连接到经同样限制酶消化的载体上。采用DNA测序i正实正确克隆。TAR1-5-19CYS的表达和纯4匕按照操作指南将TAR1-5-19CYS载体转化入BL21(DE3)pLysS化学处理的感受态细胞(Novagen)。采用100吗/ml羧苄青霉素和37吗/ml氯霉素筛选携带dAb质粒的细胞。培养建立在一个含有500ml极好肉汤(Sigma-Aldrich)100(ig/ml羧千青霉素和37吗/ml氯霉素的2L带滤膜板的锥型瓶(baffledflask)中。30。C200rpm振荡培养直到00600为1-1.5,然后用lmMIPTG(异丙基-(3-D-硫代半乳吡喃糖苷，Melford实验室提供)诱导培养。允许dAb在3(TC条件下表达12-16小时。发现绝大多数dAb存在于培养基中。因此，离心(8,000xg，30分钟)分离培养基中的细胞，上清用于纯化dAb。在每升上清中加入30mL的蛋白L琼脂糖(Affitech)，允许dAb间歇搅拌结合2小时。然后，在吸出上清前允许树脂借重力沉淀1小时。然后将琼脂糖装入一个XK50的柱(AmershamPhamacia)中，用10倍体积的PBS洗柱。用100mM甘氨酸pH2.0洗脱结合的dAb,然后加入1/5体积的1MTrispH8.0中和蛋白所在级分。每升培养上清中分离出20mg纯蛋白，其中单体和二聚体的比例为50:50。TAR1-5-19CYS的三聚化用5mM二硫苏糖醇(DTT)还原2.5ml的100pMTAR1-5-19CYS,室温放置20分钟。然后用PD-10柱(AmershamPharmacia)緩沖交换。柱子已预先用5mMEDTA,50mM磷酸钠pH6.5平衡过，按照操作说明进行样品施加和洗脱。样品置于水上备用。TMEA(三[2-马来酰亚胺乙基]胺)购自PierceBiotechnology。20mMTMEA的储存液在100%DMSO(二曱基亚砜)中制备。研究发现TMEA浓度大于3:l(dAb:TMEA的摩尔比)时导致蛋白的快速沉淀和交^:。同时随着PH的增加，沉淀和交联率也升高。因此，用100(iM还原的TARl-5-19CYS，加入25pMTMEA使蛋白三聚化，反应在室温进行2小时。发现在偶联反应进行时加入添加剂如甘油或乙二醇至20。/。(v/v)能明显降低三聚体的沉淀。偶联反应后用SDS-PAGE分析显示在溶液中存在单体、二聚体和三聚体。TAR1-5-19CYS的三聚体的纯化每毫升TMEA-TARl-5-19cys反应物中加入40|iL40%水醋酸以使pH值降到约4。然后将样品应用于已用50mM醋酸钠液pH4.0平ff过的lmLResourceS阳离子交换柱中(AmershamPharmacia)。采用30个柱体积的50mM乙酸钠pH4.0中340-450mM盐浓度梯度的氯化钠部分分离二聚体和三聚体。只含有三聚体的级分用SDS-PAGE鉴定，然后汇集并加入1/5体积的1MTrispH8.0将pH增加到8。为防止在浓缩过程中三聚体发生沉淀(采用5K截留Viva螺转浓缩器；Vivascience),样品中加入10%甘油。体外功能的结合分析TNF受体分析和细胞分析采用TNF受体和细胞分析可测定三聚体与人TNFa的亲和力。受体分析中的IC50是0.3nM;细胞分析中的ND50范围在3-1OnM之间(例如，3nM)。其它可能的TAR1-5-19CYS三聚体形式TAR1-5-19CYS也可采用下列试剂形成三聚体PEG三聚体和常规合成的马来酰亚胺三聚体Nektar(Shearwater)提供一系列多臂PEG,其能化学修饰PEG末端。因此，采用一种在每个臂末端具有马来酰亚胺功能团的PEG三聚体使dAb发生三聚化，方式与前述的采用TMEA的方法相似。PEG还具有增加三聚体的可溶性的优点可防止三聚体的聚集。因此，可生成一种dAb三聚体，其中每个dAb具有连接在马来酰亚胺功能团上的C末端半胱氨酸，马来酰亚胺功能团连接到PEG三聚体上。在dAbC-末端加入多肽接头或铰链小接头可以是(Gly4Ser)n这里n=l-10,如1，2,3，4,5，6或7，也可以是一种免疫球蛋白(如，IgG铰链区或随机肽序列(如，从随机肽序列库中筛选的)，能重组在dAb和末端半胱氨酸之间。当用于制备多聚体(如，二聚体或三聚体)时，这还能在单个单体间引入更大的柔性和距离，这有助于改进对把的结合特性，例如如同人TNFa的多亚基靶。实施例9:针对人血清清蛋白(HSA)和小鼠血清清蛋白(MSA)的单域抗体(dAb)集合的篩选本实施例解释一种制备针对血清清蛋白的单域抗体(dAb)的方法。描述了针对小鼠血清清蛋白(MSA)和人血清清蛋白(HSA)二者的dAb的筛选方法。在实验中利用了三种人噬菌体展示抗体库，每一种基于单个人VH框架(见图13:基于V3-23/DP47和JH朴的模拟VH序列)或VK框架(见图15:基于ol2/o2/DPK9和Jkl的模拟VK序列)，互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)中掺入了NNK密码子编码的侧链多样性。库1(VH):多样性位于:H30,H31，H33,H35,H50，H52,H52a，H53,H55,H56,H58,H95,H97，H98.库大小6.2x109库2(VH):多样性位于H30,H31,H33,H35,H50,H52，H52a，H53,H55,H56,H58,H95,95H97,H98,H99,HI00，H100a,HlOOb.库大小4.3x109库3(Vk):多样性位于L30，L31,L32,L34,L50，L53,L91,L92，L93,L94，L96库大小2x109VH和VK库已通过各自结合蛋白A和蛋白L属类配体预筛选，因此未选择库中的大多数克隆是功能性的。上述库大小与预筛选后的大小一致。分别采用每一种库进行针对血清清蛋白的两轮筛选。每一轮筛选中，抗原在4mlPBS中配成100吗/ml的浓度用于包被免疫管(nunc)。第一轮选择中，3种库的每一种针对HSA(Sigma)和MSA(Sigma)分别淘选(panned)。在第二轮选择中，来自6个第一轮选择的每一个的噬菌体针对(i)相同抗原(如第一轮MSA,第二轮MSA)再一次被淘选和针对(ii)相互的抗原(如第一轮MSA，第二轮HSA)被淘选，导致总共12次第二轮筛选。在每种情况下，第二轮选择后，鉴定48个克隆结合HSA和MSA的特性。可溶性dAb片段的制备按照所述的scFv片段方法进行(Harrisonetal,MethodsEnzymol.1996;267:83-109)。标准ELISA方法依照(Hoogenboometal,(1991)NucleicAcidsRes.，19:4133)方法，只是用2%tweenPBS作为封闭緩冲液。结合的dAb的检测或者用蛋白L-HRP(Sigma)(对于Vk)或者用蛋白A-HRP(AmershamPharmaciaBiotech)(对于VH)。用不溶形式ELISA法测定超过背景的信号表明能结合MSA、HSA或它们二者的dAb是否只结合于板上，但全部是特异性针对血清清蛋白的。然后对所述克隆测序(见下表)提示确定了21个独特的dAb序列。筛选的VKdAb克隆之间最小相似度(氨基酸水平)为86.25%((69/80)x100;此是当所有多样化残基不同时的结果，例如克隆24和34)。筛选的VHdAb克隆之间最小相似度为94%((127/136)x100)。接下来，根据能从溶液中捕获生物素化抗原的能力测定血清清蛋白结合dAb。遵循上述ELISA方法，不同的只是用l吗/ml蛋白L(对于Vk克隆)和lpg/ml蛋白A(对于Vh克隆)包被ELISA板。方法中从溶液中捕获的是可溶性dAb,是用生物素化的MSA或HAS以及链霉亲合素HRP检测的。根据操作说明制备生物素化的MSA和HSA，以达到获得每个血清清蛋白分子平均2个生物素分子的目的。鉴定出24个克隆能在ELISA中从溶液中捕获生物素化的MSA。其中2个(以下的克隆2和38)也能捕获生物素化的HSA。接着，根据它们结合包被在CM5Biacore芯片上的MSA的能力检测dAb,发现8个克隆能结合Biacore芯片上的MSA。dAb(全部捕茨主物H素化的MSAJ或Vk库3模板(模拟):，4,7,",3S,XXXLX16，47,5:.S3，15KASTLOS30'35iy，23，PHYLAM，X33.W，K1.AASRLQS12'K18,16'21xKASTOOS27,孤SKLQSS5，HASQQTYRIPPTQOWYWPVTQQVAKVPRT。。VLYYPQTCJCJWYWPATOOVAi/STPKT在biacore捕获生物中结合MSA素^(匕的HSA所有4个都结合两个都结合、库l(和2)模板(模拟)36,QOVIUCVPRTQQWYWPVT在所有情况下，框架与相应模拟序列中的框架相同，在CDR中具有上表指出的多样性。能结合Biacore芯片上MSA的8个克隆中，选择两个能在大肠杆菌中高表达的克隆(克隆MSA16和MSA26)以备进一步研究(见例10)。图16中给出MSA16和26的核苷酸和氨基酸全长序列。实施例10:测定MSA结合dAbMSA16和MSA26的亲和力和在小鼠体内的血清半衰期dAbMSA16和MSA26表达在大肠杆菌周质中，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech,Norway)分批吸附法纯化，接着用pH2.2的甘氨酸洗脱。然后用Biacore抑制分析纯化的dAb以确定KJ直。简言之，测试纯化的MSA16和MSA26以确定能在包被有高密度MSA的CM5芯片上获得200RUs反应时所需dAb的浓度。一旦所需dAb浓度确定，在预期Kd值左右范围浓度的MSA抗原预先与dAb混合并孵育过夜。然后在3C^l/分钟的高流率(flow-rate)测量每份预混合物中结合到包被在BiaCore芯片上的MSA上的dAb。结果曲线用作生成Klotz图，给出估算的Kd值，MSA16为200nM,MSA26为70nM(图17A和B)。接着，将克隆MSA16和MSA26克隆入具有HA标记(核酸序列TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA和氨基酸序列YPYDVPDYA)的表达载体中，以2-10mg的量表达在大肠杆菌中，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech,Norway)纯化上清，并用pH2.2的甘氨酸洗脱。测定dAb在小鼠体内的血清半衰期。分别将大约1.5mg/kg剂量的MSA26和MSA16单次静脉注射到CD1小鼠体内。用山羊抗-HA(Abcam,UK)捕获和蛋白L-HRP(invitrogen)检测ELISA法分析血清水平，用4%Marve封闭，0.05%tweenPBS洗涤。用存在于lx小鼠血清中已知浓度的dAb建立标准曲线以保证与实验样品的可比性。用2区室模型(compartmentmodel)模拟显示MSA-26的tl/2a为0.16hr、tl/2|3为14.5hr、曲线下面积(AUC)为465hr.mg/ml(资料未提供)，MSA-16的tl/2a为0.98hr、tl/2卩为36.5hr、AUC为913hr.mg/ml(图18)。与HEL4(抗鸡卵白溶菌酶dAb,其tl/2a为0.06hr，t1/2(3为0.34hr)相比，两种抗-MSA克隆具有相当长的半衰期。实施例11:Vh-Vh和Vk-Vk双特弄性Fab样片段的制备本实施例描述一种制备Vh-Vh和Vk-Vk双特弄性Fab样片段的方法。在构建所述每种Fab样片段之前，结合所选靶的dAb先从类似于实施例9中描述的dAb库中选出。分离结合鸡卵溶菌酶(Sigma)的VHdAb即HEL4,同时分离结合TNFcx受体(RandDsystems)的第二VHdAb(TAR2h-5)。这些序列在序列列表中给出。通过筛选和亲和力成熟分离能结合TNFa(TARl-5-19)的VKdAb，其序列在序列列表中给出。本实验还应用在实施例9中描述的第二VKdAb(MSA26),其序列在图17B中。用Sail和NotI消化包含上述4种dAb的表达载体的DNA获得编码dAb的DNA。在琼脂糖凝胶电泳上分离消化产物纯化预期大小的条带(300-400bp)，切下这一条带，用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Qiagen,UK)进行凝胶纯化。然后将编码dAb的DNA插入Ch或Ck栽体中(固8和图9)如下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>HB2151细胞。另夕卜，用VkCh和vkck构建物共同转化HB2151细胞。每一共转染细胞系培养物过夜生长(含5%葡萄糖、10pg/ml氯霉素和100pg/ml氨千青霉素的2xTy，以维持对Ch和Ck质粒二者的抗生素选择)。过夜培养物用于接种新鲜培养基(2xTy,10pg/ml氯霉素和100|ig/ml氨苄青霉素)并孵育生长直到OD值为0.7-0.9,然后添加IPTG以诱导Ch和Qc构建物的表达。然后，用蛋白A纯化法(对于共同转化的VhCh和VhCJ和MSA亲和树脂纯化法(对于共同转化的VkCh和V,Q)从周质中纯化表达的Fab样片段。VH-VH双特异性用凝胶分离蛋白以鉴定VhCh和VH(^双特异性的表达。凝胶被吸附并且通过myc标记和flag标记的Western印迹方法^r测Fab片段预期大小的条带，表明Fab样片段的VhCh和VhCk部分都存在。接着，为了测定是否双特异性的两半存在于同一Fab样片段中，用含3mg/ml鸡卵溶菌酶(HEL)的碳酸氢钠緩沖液4。C过夜包被ELISA板，100ul/孔。然后，用2%tweenPBS封闭板孔(如实施例1中所述)，接着与VHCH/VHCK双特异性Fab样片段共同孵育。用9el0(—种结合myc标记的单克隆抗体，Roche)和抗小鼠IgG-HRP(AmershamPharmaciaBiotech)通过非关联链(noncognatechain)检测双特异性物质与HEL的结合。VHCWHCK双特异性Fab样片段的信号是0.154,而单独表达的VHQc链的背景信号是0.069。这说明Fab样片段对靶抗原具有结合特异性。Vk-Vk双特弄性在MSA亲和树脂上纯化共转化的vkch和vkck双特异性Fab样片段后，所得蛋白用于探查包被有l吗/mlTNFa的ELISA板和包被有10|ag/mlMSA的ELISA板。正如预期一样，当用蛋白L-HRP检测两块ELISA板时，出现高于背景的信号(数据未显示)。这表明蛋白级分能结合MSA(因此用MSA亲和柱纯化)，在接下来的ELISA中也能结合TNPa,从而确定了抗体片段的双特异性。这种蛋白级分后来用于两个后续实验。首先，用双特异性VKCH和VKQcFab样片段探查包被有lpg/mlTNFoc的ELISA板，同时用计算出能在ELISA上释放相似信号的浓度的TNFoc结合dAb作为对照。在有/无2mg/mlMSA时双特异性和对照dAb用于探查ELISA板。双特异孔中的信号减少大于50。/。，而dAb孔中的信号一点没有减少(见图19a)。同样蛋白用于有/无MSA的受体分析中，也显示了MSA竟争(见图19c)。这表明MSA与TNFcc竟争结合双特异性抗体片段。实施例12:具有对小鼠血清清蛋白和TNFa的双特异性的cys键合的VK-VK双特异抗体片段的制备本例描述了一种制备双特异性抗体片段的方法，该抗体是通过二硫键的化学偶联生成，特异性地针对小鼠血清清蛋白和TNFoc。MSA16(来自实施例l)和TAR1-5-19dAb被再克隆进入一个基于pET的有C末端半胱氨酸而无标记的载体中。两种dAb的表达水平为4-10mg，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitiech,Norway)从上清中纯化所述dAb。然后用二硫苏糖醇还原半胱氨酸标记的dAb。用二硫代二吡啶偶联TAR1-5-19dAb以阻止二硫键的重新形成，导致PEP1-5-19同二聚体的形成。混合两种不同的dAb(pH6.5)促进二硫键的形成并生成TAR1-5-19和MSA16cys键合的异二聚体。这种制备两种不同蛋白偶联物的方法最初由King等描述(KingTP,LiYKochoumianLBiochemistry.1978vol17:1499-506Preparationofproteinconjugatesviaintermoleculardisulfidebondformation)。异二聚体乂人单体中的分离是通过阳离子交换方法。分离物是通过在SDS凝胶中出现预期大小的条带而得到鉴定。用TNF受体分析鉴定所得异二聚体的种类，发现中和TNF的IC50大约为18nM。然后，用恒定浓度(18nM)的异二聚体和一系列稀释的MSA和HSA重复进行受体分析。一定浓度范围(直到2mg/ml)的HSA不能降低二聚体抑制TNFa的能力。然而。MSA的加入导致二聚体抑制TNFa的能力剂量依赖性地下降(图20)。这表明MSA和TNTFa竟争结合cys键合的TAR1-5-19/MSA16二聚体。数据总结在前述实施例的实验中所得数据在附录4中列出。本发明书提供的全部出版物和所述出版物中引用的参考文献在这里一并纳入本文作为参考。本发明所述方法以及体系的各种各样的修改和变更对本领域技术人员来说将是清楚的，未偏离发明范围和精神。尽管本发明描述了具体的优选实施方案，但应该明白权利要求的发明不应该过度局限于这些具体的实施方案。事实上，对完成本发明所述模式的各种修改对于分子生物学或相关领域中的技术人员而言是显而易见的，它们都在本发明权利要求的范围之内。附录l:增加体内半衰期的多肽al糖蛋白(血清类粘蛋白)(AAG)al抗胰凝乳蛋白酶(ACT)al抗胰蛋白酶(AAT)al微球蛋白(蛋白HC)(AIM)a2巨球蛋白(A2M).抗凝血酶III(ATIII)载脂蛋白A-l(ApoA-1)载脂蛋白B(ApoB)卩2-微球蛋白(p2M)血浆铜蓝蛋白(Cp)补体成分(C3)补体成分(C4)CI酯酶抑制物(C1INH)C-反应蛋白(CRP)半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)铁蛋白(FER)纤维蛋白原(FIB)纤连蛋白(FN)触珠蛋白(Hp)血红素结合蛋白(HPX)免疫球蛋白A(IgA)免疫球蛋白D(IgD)免疫球蛋白E(IgE)免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白M(IgM)免疫球蛋白轻链(K/0脂蛋白(a)[Lp(a)]甘露糖结合蛋白(MBP)肌球蛋白(Myo)101血纤维蛋白溶酶原(PSM)前清蛋白(甲状腺素运载蛋白)(PAL)视黄醇结合蛋白(RBP)类风湿因子(RF)血清淀粉状蛋白A(SAA)可溶性转铁蛋白受体(sTfR)转铁蛋白(Tf)附件2<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>IL陽l/IL-7在IL-1诱导的胸腺细胞增殖中IL-7是必需的。在GM-CSF或TNF与IL-1协同作用中的IL-7，//mww"o/.1992Jan148(1):99-105。IL-l/IL-8IL-1/IL-10IL-1/IL-11细胞因子协同诱导破骨细胞分化被永生或正常的颅顶细胞所支持，/尸/z",'o/CW/尸/yw'o/.2002Sep;283(3):C679-87.(骨损伤)。il-1/il-16风湿性关节炎患者中前炎症细胞因子与循环il-16之间的相关性，i^ewmato/o^KOxford).2001Apr;40(4):474-5.无摘要。IL-1/IL-17抑制IL-17TNFoc/可预防包氏螺旋体菌感染小鼠关节炎的发展，/"/ec"wm肌2003Jun;71(6):3437-42。il-17在骨关节炎中软骨破坏和滑膜损伤中的作用，OyteoaW/zn.^CaW/age.2002Oct;10(10):799-807。概括了IL-1、TNFa和IL-17协同上调人膝关节炎半月板移植体中NO和前列腺素e2的生成，爿w/zn'fei/^wTi2001Sep;44(9):2078-83。il-1/il-18风湿性关节炎病人膝关节滑膜组织中il-18的表达与il-1和TNFcc水平的增高相结合，J/Y/zn'fei/2ww.2003Feb;48(2):339画47。il-1/ifn-yIL-2/IL-3T细力包增殖B细胞增殖IL-2/IL-4B细胞增殖T细胞增殖(选择性诱导CD8和NK淋巴细胞的活化)IL-2R[3拮抗物Pl-30可协同IL-2、IL-4、IL-9和IL-15的作用:生物学和分子效应。J7画画/.2000Oct15;165(8):4312-8。IL-2/IL-5B细胞增殖/IgG分泌IL-5诱导B细胞上IL-2受体<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>IL-3/IFN-YIL-4与IFN-Y协同增加人小肠内皮细胞中全部多聚IgA受体水平。蛋白酪氨酸激酶的作用。J/mmw"o/.1996Jun15;156(12):480/-14。IL-3/GM-CSF细胞因子对人嗜酸性细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体a链表达的差别调节IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体a表达伴随着对IL-5反应的降低，但上调IL-3受体a表达，J/www"o/.2003Junl;170(11):5359-66.(过每文性炎症)。IL-4/IL-2IL-4协同增加IL-2或IL-12诱导小鼠NK细胞表达IFN-y，Blood.2003Mar13[Epub印刷前]。IL-4/IL-5增加肥大细胞对IgE反应时组胺等的分泌。类天疱疮中相关的Th2样细胞因子反应。IL-4和IL-5在发病中的作用。/wf//mmwwopaAo/尸/2(3wwco/.1999May-Aug;12(2):55-61。IL-4/IL-6IL-4/IL-10IL-4/IL-11维持小鼠初始造血干细胞增殖过程中IL-ll和IL-4之间的协同交互作用。祝ood1991Sep15;78(6):1448-51。IL-4/IL-12IL-4和IL-18对树突状细胞产生IL-12依赖性IFN-Y的协同效应。J/mmimo/.2000Jan1;164(1):64-71.(增加Thl/Th2区别)。il-4协同增加il-2或il-12诱导小鼠nk细胞表达ifn-y，Blood.2003Mar13[Epub印刷前]。IL-4/IL-13概括了IL-4和IL-13信号连接图。5We"ce.2003Jun6;300(5625):1527-8.(过敏、哞喘)。抑制IL-4/IL-13受体系统预防过敏敏感性而不影响过敏性津喘小鼠模型的建立。J力/w/wmmo/.2003Jun;111(6):1361-1369。IL-4/IL-16(哮喘)IL-4/IL-9和外源性IL-16诱导BEAS画2B细胞产生IL-16，BEAS-2B细胞是一种支气管上皮细胞系。CW//mww"o/.2001Feb1;207(2):75-80。108<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>附件4<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>序列表<110>多曼蒂斯有限公司(DomantisLimited)Winter,GregTomlinson，IanIgnatovich，OlgaHolt，LucyDeAngelis,Elena<120>免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体<130>P014435W0ATM<140〉PCT/GB03/02804<141>2003-06-30<150〉PCT/GB2002/003014<151>2002-06—28<150〉GB0230202.4051〉2002-12-27<160>240<170>Patentinversion3.1<210>1<211>360<212>腿<213>人工序列<220〉<223>HEL4<220><221>CDS<222>(360)<223><400>1gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggUcagcctgggggg48GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015tecctgcgtetctectgtgcagcctecggatttaggattagegatgagSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheArglieSerAspGlu20253096gatatgggctg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oSerArgPheSerGlySerGly151015SerGlyThrAspPheThrUuThrlieSerSerUuGinProGluAsp202530PheAlaThrTyrTyrCysGinGinAspSerGlyGlyProAsnThrPhe354045GlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg5055<2i0>67<211>324<212>画<213〉人工序列<220><223〉配偶体dAb单体存在于TAR1-27d36(7U连接子)<400〉67ccgtttgatttccaccttggtcccttggccgaacgUtUggacccccacutcctgug60acagtagtaccttcaggttgcagactgctgatggtgagagtgaaatctgt120CCC3g"CC3ctgccactgaascgtgatgggaccccactttgcaaaatgg環gatcaggagcUaggggctttccctggtUctgctggtaccacttUacttatccataat240gctctgacttgcccgg固gtg"ggtgacacggtctcctacagatgcagacagggagga300tggagactgggtcatctggatgtc324<210>68<211>324<212〉DMA<213〉人工序列<220><223>配偶体dAb单体存在于TAR1-27d37(7U连接子)<220><221〉CDS<222>(1)..(324)<223><權>68gacatecagatgacccagtctccatectecctgtctgcatctgtagga48AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015gaccgtgtcaccateacttgcegggcaagtcagageattgggaggaat96AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieGlyArgAsn202530ttagagtggUccagca_gaaaccagggaaagcccctaagetcctga_tc144150LeuGluTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045UtgatgcateccatttgcaaagtggggtcccateacgtUcagtggc192TyrAspAlaSerHisLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560agtggatctgggacagatttcactetcaccateageagtctgcaacct240SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580gaagattttgetacgUcUctgtcaacagtegcgttggcttcctcgt288GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerArgTrpLeuProArg859095acgttcggcC3agggaccaaggtggaaateaaaegg324ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg100105<210〉<211><212><213〉<220><223><400>69108PRT人工序列配偶体dAb单体存在于TARl-27d37(7U连接子)69Asp1lieGinMetThrGinSerPro5SerSerLeuSerAlaSerValGly1015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieGlyArgAsn202530UuGlu丁rpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAspAlaSerHisLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGly丁hrAspPhe丁hrLeu丁hrlieSerSerLeuGinPro6507580GluAspPheAUThrTyrTyrCysGinGinSerArgTrpLeuProArg859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg100105<210〉70<211〉324<212>腿<213>人工序列<220〉<223>配偶体dAb单体存在于TARl-27d37(7U连接子)<400〉70ccgtttgatttccaxcttggtcccttggccgaacgUcgaggaagccaaxgcgactgttg60acagtagtacgtagcaaaatcttcaggttgcagsctgetgatggtgagagtgaaatctgt120cccagatccactgccaxtgaaacgtgatgggaccccactttgc濕tgggatgcatcata_180gatcaggagcmggggctttccctggt11ctgctggtaccactctaaattcctcccaat240gctctgacttgcccggcsagtgatggtgacacggtctcctacagatgcsgtggagactgggtcatctggatgtc300324<210>71<211〉324<212>,<213〉人工序列<220><223〉配偶体dAb单体存在于TARl-27d39(7U连接子)<220〉<221〉<222><223>CDS(324)<400〉71gacatccagAsplieGin13tgMet3CCThr5cagGintctSerProtecSertecSer.10ctgLeutctSergcaAlatctSergtaggaValGly15gaccgtgtcaccstcacttgcegggcaagtcsgageattaggasgatgAspArgValThrlieThrCysArgAUSerGinSerlieArgLysMet202530ttagtttggtaccagcagaaaccaggga_aageccctaagetcctgateLeuValTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysUuUuUe354045utegggcatecutttgcaaagtggggtcccateacgtUcagtggcTyrArgAlaSerTyrLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560agtggatctgggacagatUcactetcaccateageagtctgcaacctSerGlySerGLyThrAspPheThrUuThrlieSerSerUuGinPro65707580ga_agatUtget汪cgUcUctgtcaacaggetttteggeggcctaggGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinAlaPheArgArgProArg859095axgttcggccaagggaccgtggaaateaaaeggThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg1001054896144192240288324<210>72<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>配偶体dAb单体存在于TAR1-27d39(7U连接子)<憎〉72SerSerLeuSerAla10Asp1lieGinMetThrGinSerPro5SerValGly15AspArgVaLThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieArgLysMet202530LeuValTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuUulie354045TyrArgAlaSerTyrLeuGinSerGlyVaLProSerArgPheSerGly505560<formula>formulaseeoriginaldocumentpage153</formula>gcgaasacgctggsggattttgacUctggggccsgggaaccctggtcAlaLysThrLeuGluAspPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110336accgtctegThrValSer345115<210〉75<211>115<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉丁AR2h-5<400>75GluValGinLeu11015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheAspLeuTyi202530AsnMetPheTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerPhelieSerGinThrGlyArgLeuThrTrpTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerAi"gAspAsnSerLysAsn丁hrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysThrLeuGluAspPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSer115<210>76<211>345<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>TAR2h-5<400〉76egagaeggtgaccagggUccctggccccagtagtcaaaatcctccagcgUUcgcaca60gUsUtaccgcggtgtcctcggcacgcaggctgttcatttgcagatacagcgtgUctt120ggmtgtcgegggagatggtgaaccggccettcaeggagtctgcgUccatgUagcct180accagtctgactaataaatgagacccactctagacccttccctggagcctggcggaccca240aaacatattaUaagatcaaaggtgaatccggaggctgeacaggagagacgcagggaccc300cccaggctgtaccaagcctcCCCC3g8CtCcaacagctgcacctc345<210><212>隱<213>人工序列<220><223>配偶体dAb单体存在于TAR2h-5dl(3U连接子)<220〉<221><222><223〉CDS(1).(357)<■>gag177gtgC3gValGinctgLeuttgLeu5gagGlutctSergggGlyggaGlyggcGly10LeuValC3gGincctProgggGly15gggGly48tecctgcgtetctectgtgc2gectecggattcacctttccgg"UtSerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheProValTyr202530atgatgggttgggtccgccaggetccagggaagggtcUgagtgggtcMetMetGlyTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045teategattgatgetcttggtgggeggacaggtUcgcagactecgtgSerSerlieAspAlaLeuGlyGlyArgThrGlyTyrAlaAspSerVal505560aagggceggttcaccateteccgcgac汪atteca_agsacacgctgUtLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580ctgcaaatgaacagectgcgtgecgaggscaccgcggtaUtUctgtLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys8590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ieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysSerTyrGlyAlaPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerThrAsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSer130135140AlaSerValGlyAspArgValThrILeThrCysArgAlaSerGinSer145150155160UeSerSerTyrLeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaPro165170175LysLeuLeulieTyrAUAlaSerSerLeuGinSerGlyValProSer180185190ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer195200205SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyr210215220SerThrProAsnThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg225230235240<210>125<211>332<212〉舰<213>人工序列<220><223〉存在于载体1和2中的可变区<220><221〉CDS<222〉(69).,(332)<223〉<彻>125caggaaacagcUtgaccatgattacgccaagcttgcatgcaaattctatttcaaggagacagtcaUatgaaatacetattgcctacggcagccgetggattgttattaMetLysTyrLeuLeuProThrXlaAlaAla6iyLeuLeuLeu151060110etcgcggcccagccggccatggccgaggtgtttgacUctggggccag158LeuAlaAlaGinProAlaMetAlaGluValPheAspTyrTrpGlyGin15202530ggaacectggtcaccgtctcgageggtggaggcggtteaggcggsggtGlyThrLeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly354045ggcageggcggtggcgggtcgacggacatecagatgacccaggcggccGlySerGlyGlyGlyGlySerThrAsplieGinMetThrGinAlaAla505560gc2gaacaasaaetcateteagaagaggatctga^tggggccgcaUgAlaGluGinLysLeulieSerGluGluAspLeuAsnGlyAlaAla657075206254302actThrgttValgaaGlu80agtSertgtUagcaCysLeuAlacctcatProHis332<210〉<211〉<212〉<213><220><223><400>12677PRT人工序列存在于栽体1和2中的可变区126MetLysTyrLeuLeuProThrAlaAlaAlaGlyLeuLeuLeuLeuAla151015AlaGinProAlaMetAlaGluValPheAspTyrTrpGlyGinGlyThr202530LeuValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer354045GlyGlyGlyGlySerThrAsplieGinMetThrGinAlaAlaAlaGlu505560GinLysLeulieSerGluGluAspLeuAsnGlyAlaAla6570'75<210〉127<211〉10<212>PRT<213>人工序列020〉<223〉存在于载体1和2中的可变区<400>127ThrValGluSerCysLeuAlaLysProHis110<210〉<211><212><213><220〉<223>12827腿人工序列仅在V区载体2插入<220〉178<221>CDS<222〉(1).,(27)<223><400>128catcatcatHisHisHis1caccatcacggggccgcaHisHisHisGlyAlaAla527<210><211><212〉<213〉<220〉<223><彻〉HisHi11299PRT人工序列仅在V区栽体2插入129sHisHisHisHisGlyAUAla<210〉<211〉<212><213〉130116PRT人工序列<220><223〉VH链K8<400>130GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyUuGluTrpVal354045SerHislieSerProTyrGlyAlaAsnThrArgTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVal丁yrTyrCys859095AlaLysGlyLeuArgAlaPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>131<211>116<212>PRT<213〉人工序列<220><223>VH链VH2<權>131Glu1ValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly1015SerLeuArgUuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAsplieGlyAlaThrGlySerLysThrGlyTyrAlaAspProVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaVaiTyrTyrCys859095AlaLysLysValLeuThrPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210><211><212〉<213>13255PRT人工序列<220〉<223>VH链VH4<400>132GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerUuArgLeuSerCysAlaAlaSer.GlyPheThrPheSerSerTyi2D2530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerArglieAsnGlyProGly5055<210〉133<211〉60<212>PRT<213>人工序列<220><223>VH链VH4<400>133AlaThrGlyTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrlieSerArg151015AspAsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGinlieAsnSerLeuArgAla202530GluAspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysHisGlyAlaProPheAsp354045丁yrTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer505560<210>134<211〉116<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>VH链VHCll<400〉134GluValGinLeuLeu151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerSerlieProAlaSerGlyLeuHis丁hrArgTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysProGlyLeuGlyPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>135<211>56<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223>VH链VHA10sd<400>135GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAsplieGluArgThrGlyTyr5055<210><211><212〉<213>13659PRT人工序列<220><223〉VH链VHAlOsd<權〉136ThrArgTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAsp151015AsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGlu202530AspThrAlaValTyrTyrCysAlaLysLysValUuValPheAspTyr354045TrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer5055<210〉137<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VH链VHAlsd<，>137GluValGinLeuLeu15GlyGlyLeuValGinProGlyGly1015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAUProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerGlulieSerAlaAsnGlySerLysThrGinTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgLeuThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysLysValLeuGinPheAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>138<211>55<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VH链vha5sd<400〉138GluValGinLeuLeu151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045Ser丁hrlieProAlaAsnGly5055<210〉<211><2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T<213>人工序列<220><223>多肽连接子<楊>163GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer2025<210>164<211〉30<212>PRT<213〉人工序列<220><223>多肽连接子<400>164GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer15101515GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer202530<210><211><212><213><220><223〉<400〉16535PR丁人工序列多肽连接子165GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly151015GlyGIyGly'SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly202530GlyGlySer35<210〉<211〉<212><213〉<220><223><400>16640PRT人工序列多肽连接子166GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly151015GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly202530GlyGlySerGlyGlyGlyGlySer3540<210><211〉<212〉<213〉16745PRT人工序列<220〉<223〉多肽连接子<400〉167GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly151015GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly202530GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer354045<210〉<211〉<212><213〉<220><223〉<400〉16850PRT人工序列多肽连接子168GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGly151015GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGly202530GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly354045GlySer50<210〉<211〉<212><213>16922陽人工序列<220><223>引物<400〉169cggccatggcgtcsacgg汪c"22<210〉170<211〉23<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>170atgtgcgctcgagcgtttgaut23<210>171<211〉15<212>PRT<213>人工序列<220><223〉人IgGCl铰链修饰形式<權〉171GluProLysSerGlyAspLysThrHisThrCysProProCysPro151015<210>172<211>357<212>腿<213〉人工序列<220〉<223>TAR1-5-19CYS<220〉<221>CDS<222>(357)<223〉<400〉172tggagegcgtcgacggacatecagatgacccagtctccatectctctg48TrpSerAlaSerThrAsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeu151015tctgcatctgtaggagaccgtgtcaccateacttgcegggcaagtcag96SerAUSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGin202530ageattgatagttatttacattggUccagcagaaaccagggaaagec144SerlieAspSerTyrLeuHisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAla354045cctaagetcctgatetatagtgcatecgagttgcaaagtggggtcccaProLysLeuLeulieTyrSerAlaSerGluLeuGinSerGlyValPro505560192teacgtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactetcaccateSerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie65707580240ageagtctgcaacctgaagattttgetaxgUctactgtcaacaggttSerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinVal859095288gtgtggcgtccttttacgUcggccaagggaccaaggtggaaateaaa336ValTrpArgProPheThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105110eggtgctaataaggatecggc357ArgCysGlySerGly115<210><211〉<212><213>173114PRT人工序列<220><223〉<400〉TAR卜5-19CYS173TrpSerAlaSerThrAsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeu151015SerAlaSerValGlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGin202530SerlieAspSerTyrLeuHisTrpTyrGinGinLysProGlyLysAla354045Prol>yslxuLeulieTyrSerAlaSerGluLeuGinSerGlyValPro505560SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie65707580SerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinVal859095ValTrpArgProPheThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLys100105110ArgCys<210>174<211>357<212>飄<213>人工序列<220><223〉丁AR1-5-19CYS<400〉174gccggatcctUtUgcaccgtttg3tttccaccttggtcccttggccgaacgtaaaaggacgccaxacaacctgttgacagUgUcgtagcaaaatcttcaggttgcagactgctgat120ggtgagagtgaaatctgtcccag"ccactgccactgaaacgtgatgggaccccactttg180caactcggatgcacUUgatcaggagcttaggggctttccctggtttctgctggtacca240atgtaaataactatcaatgctctgacttgcccggcaagtgatggtgacacggtctcctac300<210〉175<211〉39<212>DM<213>人工序列<220><223>引物<彻>175tggagcgcgtcgacggacatccagatgacccagtctxca39<210>176<211〉39<212>腿<213>人工序列<220><223>引物<400>176ttagcagccggatccttattagcaccgtttgatttccac39<210>177<211〉5<212>PRT<213>人工序列<220〉<223〉VkCDR1<楊>177SerSerTyrLeuAsn15<210>178agatgciigiicag，ggstgg，ctgggtcatctggatgtccgtcgacgcgctxca199<211〉5<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223>VkappaCDRl<400〉178PheLysSerLeuLys15<210〉179<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<>179TyrTyrHisLeuLys15<210〉180<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaC皿<權>180ArgArgTyrLeuLys15<210>181<211>5<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<權〉181TyrAsnTrpLeul>ys15<210>182<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<400>182LeuTrpHisLeuArg15<210>183<211〉5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<400〉183PheArgTyrLeuAla15<210〉184<211>5<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>VkappaCDRl<400〉184PheTyrHisLeuAla15<210〉185<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaC阻<400>185lieTrpHisLeuAsn15<210>186<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<400>186丁yrArgTyrLeuArg15<210>187<211>5<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaCDRl<400>187LeuLysTyrLeuLys15<210〉188<211>5<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>VkappaCDRl<400>188L>euArgTyrLeuArg15<210〉189<211〉5<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDRl<400>189LeuArgSerLeuLys15<210〉190<211〉5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaC隨<400>190PheArgHisLeuLys15<210>191<211〉5<212>PRT<213>人工序列<220〉<223〉VkappaCDRl<400>191ArgLysTyrLeuArg15<210>192<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDRl<400〉192ArgArgTyrLeuAsn15<210>193<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDRl<權>193IleLysHisLeuLys15<210>194<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR1<400>194TyrLysHisLeuLys15<210>195<211>6<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉VHCDR1<400>195丁rpValTyrGinMetAsp15<210>196<211〉6<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VHCDR1<400>196TrpSerTyrGinMetThr15<210>197<211>7<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉Vkappa冲莫拟CDR2<220><221>MISC-FEATURE<222>(1)<223>由rnik编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<220><221>MISC—FEATURE<222〉(4).,(4)<223>由nnk编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<權>197XaaAlaSerXaaLeuGinSer15<210>198<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<權〉198ArgAlaSerProLeuGinSer15<210>199<211>7<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>VkappaCDR2<400〉199AsnAlaSerTyrLeuGinSer15<210>200<211>7<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR2<400>200I>ysAlaSerThrLeuGinSer15<21D>201<211〉7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>201GinAlaSerValLeuGinSer15<210>202<211>7<212>PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>202ArgAlaSerSerLeuGinSer15<210>203<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>203HisAlaSerLeuLeuGinSer15<210>204<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR2<400>204HisAlaSerHisLeuGinSer15<210>205<211>7<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaC脂<400>205ProAlaSerLysLxuGinSer15<210>206<211〉7<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<楊>206ArgAlaSerArgLeuGinSer15<210>207<211〉7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>207LysAlaSerSerLeuGinSer15<210>208<211>7<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>208AsnAlaSerHisLeuGinSer15<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR2<400>209LysAlaSerTrpLeuGinSer15<210>210<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR2<400>210AlaAlaSerArgLeuGinSer15<210>211<211〉7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>211ThrAlaSerSerLeuGinSer15<210>212<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR2<400>212AlaAlaSerSerLeuGinSer15<210〉213<211>7<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉VkappaCDR2<400>213GlyAlaSerArgLeuGinSer15<210〉214<211>17<212>PRT206<213>人工序列<220〉<223>VH模拟CDR2<220><221>MISC扁FEA丁URE<222>(1)<223〉由nnk编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<220><221>MISC一FEAT匿<222〉(3)..(5)<223〉由rmk编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<220〉<221>MISC-FEATURE<222>(7),(8)<223〉由nnk编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<220〉<22]>MISC一FEATURE<222〉(10)..(10)<223〉由nnk编码的Xaa，nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<400>214XaalieXaaXaaXaaGlyXaaXaa15ThrXaaTyrAlaAspSerVall>ys1015Gly<210〉215<211〉17<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VHCDR2<400>215SerlieSerAlaPheGlyAlaLysThrLeuTyrAlaAspSerValLys151015Gly<210>216<211〉17<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VHC脂<400>216SerlieSerSerPheGlySerSerThrUuTyrAUAspSerValLys151015<210>217<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉Vkappa模拟CDR3<220><221>MISC一FEATURE<222〉(3)..(6)<223>由nnk编码的Xaa,nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<220><221>MISC-FEATURE<222>(8)..(8)<223〉由nnk编码的Xaa,nnk编码全部氨基酸以及TAG密码子<400>217GlnGlnXaaXaaXaaXaaProXaaThr15<210〉218<21》9<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR3<400>218GinGinThrTyrSerValProProThr15<210>219<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉VkappaCDR3<楊>219GinGinThrTyrArglieProProThr15<210>220<211〉9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223〉VkappaCDR3<400>220GinGinValValTyrTrpProValThr15<210〉221<211>9<212>PRT<213>人工序列208<220><223>VkappaCDR3<400>221GinGinValArgLysValProArgThr15<210>222<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR3<權>222GinGinGlyLeuTyrProProlieThr15<210>223<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223〉VkappaCDR3<400>223GLnGinAsnValVallieProArgThr15<210>224<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR3<锡>224GinGinSerAlaValTyrProLysThr15<210>225<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR3<400>225GinGinArgLeuLeuTyrProLys丁hr15<210〉226<211>9<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>VkappaCDR3<400>226GinGinArgAlaArgTrpProArgThr15<210>227<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223〉VkappaCDR3<400>227GinGinValAlaArgValProArgThr15<210>228<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaCDR3<400〉228GinGinTyrValGlyTyrProArgThr<210>229<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>229GinGinThrThrTyrTyrProlieThr15<210>230<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>230GLnGinValLeuTyrTyrProGinThr15<210>231<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>231GinGinValValTyrTrpProAlaThr15<210>232<211>9<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>232GinGinValAULeuTyrProLysThr15<210〉233<211>9<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>VkappaCDR3<彻〉233GinGinAsnLeuPheTrpProArg丁hr15<210〉234<211〉9<212>PRT<213〉人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>234GinGinMetLeuPheTyrProLysThr15<210>235<211〉9<212>PRT<213>人工序列<220><223>VkappaCDR3<400>235GinGinGlyAlaArg丁rpProGinThr15<210>236<211>9<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223>VkappaCDR3<400>236GinGinValGlyArgTyrProLysThr15<210>237<211>7<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>VHCDR3<400〉237LeuSerGlyLysPheAspTyr15<210>238<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>VHCDR3<400>238GlyArgAspHisAsnTyrSerLeuPheAspTyr1510<210〉239<211〉27<212>廳<213〉人工序列<220><223〉HA标记<400>239UtccmtgatgttcctgatUtgca27<210>240<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>HA.标记<400>240TyrProTyrAspValProAspTyrAla1521权利要求1.一种配体，其包含具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区和具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中所述第一和第二可变区之一或两者与血液中找到的延长配体体内半衰期的抗原结合，且所述可变区彼此不互补；前提条件是当所述第一和第二免疫球蛋白可变区是CamelidVHH区时，针对能延长配体体内半衰期的抗原特异性的VHH区不能结合猪胰腺α-淀粉酶、NmC-A或hcg。2.权利要求l中的配体，其中的第一和第二免疫球蛋白可变区是重链可交区(Vh)。3.权利要求1中的配体，其中的第一和第二免疫球蛋白可变区是轻链可变区(V。。4.前述任一项权利要求的配体，其中的第一和第二表位独立结合，致使双特异性配体可以同时结合第一和第二表位或抗原。5.权利要求4中的配体，其中的双特异性配体包含在溶液中均衡存在的第一种形式和第二种形式，其中的两种表位或抗原都独立地结合第一种形式，但竟争与第二种形式的结合。6.前述任一项权利要求的配体，其中的可变区源自针对所述表位或抗原的免疫球蛋白。7.前述任一项权利要求的配体，其中所述第一和第二表位存在于不同的抗原上。8.权利要求1-4中的任何一项权利要求的配体，其中所述第一和第二表位存在于相同的抗原上。9.前述任一项权利要求的配体，其包含源自单个抗体功能域库的可变区。10.权利要求9中的配体，其中所述库展示于丝状噬菌体表面，并且其中的单个抗体功能域是通过噬菌体库与抗原的结合而选出的。11.前述任一项权利要求的配体，其中至少一个可变区的序列经突变或DNA改组修饰过。12.前述任一项权利要求的双特异性配体，其中所述可变区是非共价结合的。13.权利要求1-11中的任何一项权利要求的双特异性配体，其中的可变区是共价结合的。14.权利要求13中的双特异性配体，其中的共价结合是通过二硫键介导的。15.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNFa特异性的dAb单体配体，其以50nM至20pM的解离常数(Kd)和5x10"至lxl(T7S"的K。ff速率常数与人TNFa解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。16.权利要求15中的配体，其中的dAb是Vk。17.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1(p55)特异性的dAb单体配体，其以50nM至20pM的解离常数(Kd)和5x10"至lxlO々S-'的K。ff速率常数与人TNF受体1解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。18.权利要求15-17中的任何一项权利要求的配体，其中的单体在标准细胞测定法中以500nM至50pM的ND50中和人TNFa或TNF受体1。19.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1(p55)特异性的dAb单体配体，其中的dAb在标准细胞测定法中以《100nM的ND50拮抗TNF受体1的活性，并且dAb在该测定法中在《10|iM的浓度刺激TNF受体1活性达《5%。20.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含血清清蛋白(SA)特异性的dAb单体配体，其以lnM至500pM的解离常数(Kd)与SA解离，这是通过表面等离子体共振测定得出的。21.权利要求20中的配体，其中的单体在标准配体结合测定法中以lnM至500pM的IC50结合SA。22.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR1-5-19的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。23.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR1-5的氨基酸序列或与其至少80%同源的^f寸。24.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNFa特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TARl-27的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。25.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-10的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。26.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-10的氨基酸序列或与其至少90%同源的序列。27.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-5的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。28.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含TNF受体1特异性的dAb单体配体，其中dAb包含TAR2-5的氨基酸序列或与其至少90%同源的序列。29.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含SA特异性的dAb单体配体，其中dAb包含MSA-16的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。30.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含SA特异性的dAb单体配体，其中dAb包含MSA-26的氨基酸序列或与其至少80%同源的序列。31.权利要求22-30中的任何一项权利要求的配体，其中TNFa、TNF受体1或SA是人源的形式。32.权利要求1-14中的任何一项权利要求的配体，其包含dAb单体，该dAb单体包含末端Cys残基。33.权利要求22-31中的任何一项权利要求的配体，其还包含末端Cys残基。34.权利要求1的配体，其是二聚体。35.权利要求1的配体，其包含抗人TNFadAb和抗SAdAb。36.权利要求1中的配体，其是三聚体。37.前述任一项权利要求的配体，其包含通用框架。38.权利要求37中的配体，其中的通用框架包含选自DP47、DP45和DP38的Vh框架；和/或Vl框架是DPK9。39.前述任一项权利要求的配体，其包含属类配体的结合位点。40.权利要求39中的配体，其中的属类配体结合位点选自蛋白A、蛋白L和蛋白G。41.前述任一项权利要求的配体，其中的配体包含具有一个或多个框架区的可变区，所述框架区包含与人种系抗体基因片段编码的相应框架区一样的氨基酸序列，或者所述一个或多个框架区的氨基酸序列整体包含多至5个不同于人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。42.权利要求1-41中的任何一项权利要求的配体，其中的配体包含可变区，其中FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列整体包含多至10个不同于所述人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列的氨基酸。43.权利要求41或42的配体，其包含含有FW1、FW2和FW3区域的抗体可变区，所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与人种系抗体基因片段编码的相应框架区的氨基酸序列相同。44.权利要求41-43任一项的配体，其中所述人种系抗体基因片段选自DP47、DP45、DP48和DPK9。45.前述任一项权利要求的配体，其包含Vh区，该区不是Camelid免疫^求蛋白可变区。46.权利要求45中的配体，其包含Vh区，接区不包含与人Vh区相比对Camelid免疫球蛋白可变区而言是特异的一个或多个氨基酸。47.—种制备权利要求l中的配体的方法，该配体包含具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和具有第二结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述结合特异性之一或两者是特异性针对血液中找到的能延长配体体内半衰期的蛋白质的，该方法包括如下步骤(a)根据能与第一表位结合的能力选择第一可变区，(b)根据能与第二表位结合的能力选择第二可变区，(c)组合这些可变区，并且(d)根据能与上述第一和第二表位结合的能力选择配体。48.权利要求47中的方法，其中所述第一可变区是根据互补可变区不存在时结合所述第一表位而选择的。49.权利要求47中的方法，其中所述第一可变区是根据第三互补可变区存在时结合所述第一表位而选择的，所述第三可变区不同于所述第二可变区。50.编码权利要求1-46中的任何一项权利要求的双特异性配体的核酸。51.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNFa特异性的，所述核酸包含TARl-5-19的核酸序列或与其至少70%同源的序列。52.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNFa特异性的，所述核酸包含TARl-5的核酸序列或与其至少70°/。同源的序列。53.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNFa特异性的，所述核酸包含TARl-27的核酸序列或与其至少70%同源的序列。54.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNF受体1特异性的，所述核酸包含TAR2-10的核酸序列或与其至少70%同源的序列。55.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNF受体1特异性的，所述核酸包含TAR2-10的核酸序列或与其至少80%同源的序列。56.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNF受体1特异性的，所述核酸包含TAR2h-5的核酸序列或与其至少70%同源的序列。57.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是TNF受体1特异性的，所述核酸包含TAR2h-5的核酸序列或与其至少80%同源的序列。58.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是SA特异性的，所述核酸包含MSA-16的核酸序列或与其至少70%同源的序列。59.权利要求50中编码配体的核酸，所述配体是SA特异性的，所述核酸包含MSA-26的核酸序列或与其至少70%同源的序列。60.—种载体，其包含权利要求50-59中的任何一项权利要求的核酸。61.权利要求60中的载体，其还包含表达双特异性配体所必需的成分。62.—种转染有权利要求61的载体的宿主细胞。63.权利要求1-46中的任何一项权利要求的配体，其用于治疗。64.—种药物组合物，其包含权利要求1-46中的任何一项权利要求的配体和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。全文摘要本发明提供了一种双特异性配体，其包含一个具有第一结合特异性的免疫球蛋白可变区和一个具有第二结合特异性的互补或非互补的免疫球蛋白可变区。文档编号C12N15/09GK101255196SQ20081000856公开日2008年9月3日申请日期2003年6月30日优先权日2002年6月28日发明者伊恩·汤姆林森,埃琳娜·德安杰利斯,奥尔加·伊格内托维奇,格雷格·温特,菲利普·琼斯,露西·霍尔特申请人:多曼蒂斯有限公司