纳滤浓缩纯化核酸酶P₁及生产核苷酸的方法

专利名称：：纳滤浓缩纯化核酸酶P₁及生产核苷酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸酶P,的纯化的方法以及用纯化的核酸酶P,生产核苷酸的方法。尤其是使用现代的分子量级分离技术(纳滤)，将具有降解核糖核酸成为5'核苷酸的核酸酶P,浓縮、纯化成为高活性、稳定性的液体酶；使用这种酶液制备了5'核苷酸溶液，并进一步使用分子量级分离技术(超滤和纳滤)纯化、浓縮5'核苷酸溶液，以生产5'核苷酸成品。
背景技术：
：5'核苷酸包含5'腺苷酸、5'鸟苷酸、5'胞苷酸、5'尿苷酸，它们不仅是基因工程中合成生命的遗传物质核糖核酸(RNA)和寡核苷酸的基本原料，而且是许多抗肿瘤、抗病毒药物的前体，在动物饲料中添加5'核苷酸具有提高免疫功能、促进生长、代谢的功能，在农业上喷洒、灌溉、浸种使用，具有促进植物生长、开花、结果增多的功效。从上世纪90年代后国外大量报导5'核苷酸是一类功能性辅助食品，具有显著的免疫功能，国内市场需求扩大，产量明显提咼°同时生产四种5'核苷酸只能使用专一性的酶(核酸酶P,)降解核糖核酸的方法。迄今为止，在工业生产上要获得核酸酶Pi只有两条途径第一是培养一种菌株在细胞外分泌核酸酶Pn第二是从麦芽中浸提此酶。从麦芽中浸提涉及麦芽资源的来源、保存、抽提体积庞大，工序繁复、酶活力不高，在工业生产中使用不是最佳方案。对于核酸酶Pi的使用，国际上已发展到固定化酶、固相化酶(干粉酶)及液体酶三种方式。以固定化酶及固体酶而言，不仅制备技术要求很高，而且生产成本也很高，以干粉核酸酶P,为例，进口价每公斤在2500元3000元人民币，用于生产5，核苷酸，它将占主要原料成本价的30%左右，不利于5'核苷酸的大规模生产。目前，用液体核酸酶P,生产5'核苷酸的方法都是直接用未经纯化的液体核酸酶Pt降解核糖核酸得到5'核苷酸溶液，然后再经过离子交换树脂的分离工艺进一步分离，去除杂质并得到5'腺苷酸、5'鸟苷酸、5'胞苷酸、5'尿苷酸单体。虽然产品纯度很高，可达到98%~102%，但是却存在着成本高、收率低的问题，也不利于5'核苷酸的大规模生产，尤其是对于不需要5'核苷酸单体且不需要高纯度5'核苷酸产品的生产，此种方法更不适用。
发明内容本发明是针对现有技术所存在的成本高、收率低、不适合大规模生产等问题，提供一种工序简单、收率高、成本低、质量稳定、适合大规模生产的纳滤浓縮纯化核酸酶p,及生产核苷酸的方法。本发明的技术解决方案是一种纳滤浓縮纯化核酸酶P,的方法，其特征在于按如下步骤进行a.选育高活性的桔青霉菌株M843，在培养基中经液体深层发酵得到核酸酶Pnb.用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶P,的上清液；c.纳滤膜透析除去部分水、无机盐及色素。所述a步骤是以葡萄糖2%~10%为碳源，蛋白胨0.3%~0.8%为氮源。所述a步骤的条件是培养基所含成分及重量百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2P040.05%、MgS040.04%、CaCl20.04%、ZnS040.02%;PH6.0;培养条件28°C30°C，通风搅拌培养，培养25hr。所述c步骤是经切割分子量为30010000道尔顿的纳滤膜透析。所述c步骤是加入无离子水反复进行，使酶液浓縮倍数为5~16倍。一种用前述方法得到的浓縮纯化核酸酶生产核苷酸的方法，其特征在于按如下步骤进行d.用浓縮纯化核酸酶Pi降解核糖核酸，底物核糖核酸质量浓度2%5%，浓縮核酸酶Pi的用量为总体积1.4°/。~4%，PH5.5~6.2，温度65'C7(TC，降解时间35小时得降解液；e.将降解液经过20nm50nm的陶瓷膜超滤；f.将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，加入总体积30%~50%的无离子水反复进行，纳滤除去无机盐、色素等杂物，浓縮并得到3~5倍的5'核苷酸溶液；g.将所得到的浓縮3~5倍的5'核苷酸溶液经升膜浓縮塔进一步浓縮，使固形物含量为35~45%，喷雾干燥或微波干燥制成5，核苷酸粉状产品。本发明是选育一株桔青霉菌株M843(Penicilliumcitrinum),在深层发酵中产生液体核酸酶P1，在发酵培养过程中细胞不结球，从而有高活力的酶表达，酶活力可达1150~1400单位/毫升；用纳滤法浓縮、纯化核酸酶P,，可除去部分水、无机盐及色素，浓縮后单位酶活力提高，易于保存、酶活稳定；用此浓縮、纯化核酸酶P!对核糖核酸进行有效的降解及所用的分子量级的超滤、纳滤分离技术，既可以除去杂蛋白、剩余核糖核酸、无机盐、色素等杂质，无需再用成本高的离子交换树脂的分离工艺，即可制备完全满足纯度要求的5'核苷酸混合体，具有工序简单、收率高、成本低、质量稳定、可大规模生产等优点。具体实施例方式实施例1:a.液体核酸酶P,的制备菌种桔青霉M843("'^7."腦)。培养基的成分及重量百分比葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HP040.05%、KH2PO40.05%、MgS040.04%、CaCl20.040/0、ZnSO40.02%，PH6.0。培养条件28°C~30°C，通风搅拌培养，培养25hr，酶活力1294U/ml。b.纳滤浓縮核酸酶Pp将已培养好的发酵液，用常规篮式离心机离心除菌丝体后得到含核酸酶的上清液；取2000ml上清液用10000道尔顿的纳滤膜进行透析，除去水分、无机盐及色素，每片膜面积0.02m2的膜包，控制进口压力0.15Mpa，出口压力0.05Mpa，经30分钟纳滤得浓縮酶液120ml，体积浓縮了16.7倍，浓縮前酶活力1188U/ml，浓縮后酶活力16740U/ml，酶活力每毫升是原酶活力的14.1倍。纳滤膜切割分子量应保证达到满意的酶活力回收，并且浓縮酶在常温下保存3个月酶活力保存在95%以上。最好是用切割分子量为30010000道尔顿的纳滤膜，为了达到纯化及浓縮目的可以加入适量无离子水继续纳滤，酶液浓縮倍数可控制在5-16倍范围内。用所制得的浓縮型核酸酶Pp可高效降解核糖核酸成为5'核苷酸。降解条件RNA溶液浓度2.5%，加酶量1.4%(V/V)，作用温度65。C70。C，作用PH5.5~6.2，降解时间4小时。降解液经HPLC分析测定，降解率为78.65%。实施例2:a.核酸酶Pi的制备菌种桔青霉M843培养基和培养条件同实施例l，培养23小时，酶活力1314U/ml。b.纳滤浓縮核酸酶P,将已培养好的发酵液，用常规篮式离心机离心除菌丝体后得到含核酸酶P,的上清液；取685L上清液用300道尔顿、膜面积为30m2的纳滤机进行纳滤。用时3小时，平均通量240L/hr，中途加纯水70L，控制压力l~1.2kg/cm2，电导800us/cm2，得纳滤液110L，体积浓縮了6.23倍，每毫升酶活力是原酶活力的5.9倍，达7776U/ml。浓縮酶在5'C2(TC贮藏，核酸酶Pt活力保存百分率如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果表明浓缩型该酸酶Pi在常温下贮藏三个月，活j5保存百分率大于95%。c.核糖核酸的降解用所得浓縮6.23倍的核酸酶Pi，加酶量为3.7%(V/V)，按实施例1降解条件，分四批降解，经HPLC分析，降解结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3:5'—核苷酸混合体产品的制取。a.核酸酶P,制备同实施例1;b.浓縮纯化核酸酶P,同实施例1或实施例2;c.核糖核酸(RNA)的降解折纯17.5kgRNA，溶解至674L，加浓縮纯化酶核酸酶P-6L(加量占总体积3.7%)，65。C70。C，PH5.5-6.2，降解4小时，升温至90°C~95°C，使酶失活，降温至30。C40。C，经HPLC分析，降解率82.87%。d.降解液的超滤降解液用膜面积为8t^的陶瓷膜(50nm)，除去残剩核酸及变性酶蛋白，超滤时控制进口压力为4kg/cm2，超滤后用400L纯水洗膜，平均通量137.5L/hrcm2，共得超滤液1100L，用时60分钟。e.纳滤超滤液再经300道尔顿，膜面积301112纳滤机进行纳滤，除去部分水、色素及无机盐，纳滤3hr，中途可加纯水500L，控制压力11.2kg/cm2，平均通量433L/hr，电导400us/cm，得纳滤液315L。f.进一步浓縮并干燥将所得到浓縮5'—核苷酸混合体溶液，用升膜浓縮塔，控制进汽压力0.3kg，收集罐溶液温度〈7(TC，用时5.5hr，将315L5，一核苷酸混合体溶液浓縮至42L，其固形物含量约40%，进喷雾干燥塔进行喷雾干燥，得粉状5'—核苷酸混合体16.8kg，经HPLC分析，含量77.71%，水分6.0%，纯收率70.13%。权利要求1.一种纳滤浓缩纯化核酸酶P1的方法，其特征在于按如下步骤进行a.选育高活性的桔青霉菌株M843，在培养基中经液体深层发酵得到核酸酶P1；b.用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶P1的上清液；c.纳滤膜透析除去部分水、无机盐及色素。2.根据权利要求1所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶&的方法，其特征在于所述a步骤是以葡萄糖2%10%为碳源，蛋白胨0.3%~0.8%为氮源。3.根据权利要求2所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶P,的方法，其特征在于所述a步骤的条件是培养基所含成分及重量百分比是葡萄糖5%、蛋白胨0.5%、K2HPO40.05%、KH2PO40.05%、MgS040.04%、CaCl20.04%、ZnS040.02%;PH6.0;培养条件28°C30°C，通风搅拌培养，培养25hr。4.根据权利要求2或3所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶P,的方法，其特征在于所述c步骤是经切割分子量为300~10000道尔顿的纳滤膜透析。5.根据权利要求4所述的一种纳滤浓縮纯化核酸酶Pi的方法，其特征在于所述c步骤是加入无离子水反复进行，使酶液浓縮倍数为516倍。6.—种用如权利要求1~5所述方法得到的浓縮纯化核酸酶Pi生产核苷酸的方法，其特征在于按如下步骤进行d.用浓縮纯化核酸酶降解核糖核酸，底物核糖核酸质量浓度2%5%，浓縮核酸酶P,的用量为总体积1.4%~4%,PH5.5~6.2，温度65r70。C，降解时间35小时得降解液；e.将降解液经过20nm50nm的陶瓷膜超滤；f.将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，加入总体积30%~50%的无离子水反复进行，纳滤除去无机盐、色素等杂物，浓縮并得到3~5倍的5'核苷酸溶液；g.将所得到浓縮3~5倍的5'核苷酸溶液经升膜浓縮塔进一步浓縮，使固形物含量为3545%，喷雾干燥或微波干燥制成5'核苷酸粉状产品。全文摘要本发明公开一种纳滤浓缩纯化核酸酶P₁的方法，是选育高活性的桔青霉菌株M843，在培养基中经液体深层发酵得到核酸酶P₁；用离心机除去菌体和培养基的固形物，得含核酸酶P₁的上清液；纳滤膜透析除去部分水、无机盐及色素。本发明还公开了用纳滤浓缩纯化核酸酶P₁生产核苷酸的方法，是用浓缩纯化核酸酶P₁降解核糖核酸；将降解液经过20nm～50nm的陶瓷膜超滤；将超滤液经切割分子量为300道尔顿的纳滤膜透析，除去无机盐、色素等杂物，得到浓缩的5’核苷酸溶液；将所得到浓缩的5’核苷酸溶液经升膜浓缩塔进一步浓缩，使固形物含量为35～45％，喷雾干燥或微波干燥制成5’核苷酸粉状产品。具有工序简单、收率高、成本低、质量稳定、可大规模生产等优点。文档编号C12N9/22GK101363016SQ200810013419公开日2009年2月11日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者乔宾福,俞慧君,霍旭辉申请人:大连珍奥生物技术股份有限公司