在变形菌降解整个植物材料过程中糖酶的表达的制作方法

专利名称：：在变形菌降解整个植物材料过程中糖酶的表达的制作方法在变形菌降解整个植物材料过程中糖酶的表达
背景技术：
：变形菌菌4朱2-40(在此表示为"S.degradans2-40")是能够降解复杂多聚津唐(CP)的新兴海洋细菌的代表。S.degradans保存在美国菌种4呆藏中心，"保藏编号为ATCC43961。S.degradans2-40是从腐烂的互花米草中分离出来的一种海洋？变形菌，互花米草是在切萨皮克湾流域的一种盐沼泽中的绳索草。与它从腐烂的植物原料中分离得到的相一致，S.degradans菌4朱2-40能够降解许多复杂的多聚糖，包括，纤维素，胶质，木聚糖，和壳质，这些都为高等才直物细月包壁的普遍组成部分。S.degradans菌4朱2-40也能够解聚海藻细月包壁组分。如，琼脂，琼脂寿唐，和海带多^f唐，以及，蛋白质，淀粉，出芽短梗孢糖和海藻酸。除了能降解这种过多的聚合体，S.degradans菌林2-40能够利用每种多聚糖作为唯一碳源。因此，S.degradans菌林2-40不仅是孩史生物降解不溶性复杂多糖(ICPs)的出色的模型，也能被用作完全代谢这些ICPS的范例。ICPs是聚合的糖类，用于构成在动物和植物中的形状和结构。他们是水不溶的，因此它们不容易被降解。S.degradans菌才朱2-40需要至少1%的海盐来维持生长，它能够忍受高达10%的盐浓度。S.degradans菌才朱2-40是需氧的，通常为棒状的，通过单一极性鞭毛运动的高多晶的革兰氏阴性菌。早先的工作已经确定2-40能够降解至少20种不同的碳水化合物聚合物(CP)，包括琼脂，壳质，褐藻酸，碳水化合物曱基纤维素(CMC),P-葡聚糖，海带多糖，胶质，出芽短梗孢糖、淀粉和木聚并唐。此夕卜，它能够合成正确的酪氨酸酶。16SrDNA分析表明2-40是变形菌门的第三亚纲的成员，有关于Microbulbiferhydrolyticus和Teridinobactersp，与4§虫且共生的能K解纤维素的固氮菌。琼脂水解酶、壳多津唐酶和褐藻酸酶体系已经^皮普遍了解了。酶i普活性凝月交表明这三种体系包含多种解聚酶且多种证据表明这些解聚酶中的至少一些粘附于细i包表面。活性实-睑表明大多邀:S.degradans酶活性在CP上的指数生长期间，存在于细'胞组分中，而在其后的生长阶^殳，大部分的活性存在于表面，而且细胞结合活性显著降低(Stotz1994)。在CP的生长也伴随在细胞形态上的显著变化。葡萄糖生长培养的51.degradans具有相对较统一的细胞大小和形状，而且通常4交平滑和具有无特;f正的细胞表面。然而，当在琼脂糖、藻朊酸盐、或几丁质上生长时，S.degradans细胞表现出异常的表面结构和特^正。这里需要确定酶系统，该酶系统能4吏用纤维素作为底物，<吏用适当的载体能够表达编码蛋白质的基因，鉴定和分离氨基酸产物(酶和非酶的产物)，并4吏用这些产物以及包含这些基因的生物体，以达到生产例如乙醇的目的。
发明内容本发明提供了生产降解植物材料的混合酶的方法。优选的，这种降解不需要对植物材冲牛进行化学预处理。这种方法包括在*合定植物材料存在的条件下，培育变形菌，接着检测在变形菌中酶的表达。在给定植物材料存在的条件下，酶的表达量将增加，这些酶将组合形成酶的复合物，以降解给定的植物原料。本发明也提供了一种改进的细菌，这种菌在给定才直物原料存在的条件下，在变形菌中的表达是上调的，而且这种改进的细菌能够以增长的速率，不受作用底物浓度的影响而快速合成。这种改进的细菌能够以比非改进细菌快^艮多的速率降解给定的植物原料。本发明也^是供了生产乙醇的方法，其中，4吏用一种细菌来降解一种或多种植物原并牛，源于降解过程的单寿唐与一种或多种才直物原泮+形成水混合物，在这种混合物中生成乙醇。本领i或普通^支术人员已知乙醇可以通过4艮多途径生成。在一种具体实施方案中，乙醇可以/人酵母菌的孩i生物降解产物中获得。这种菌可以是变形菌林2-40或是响应给定植物原料存在的条件下，在变形菌中酶的表达量4是高的一种改进菌种。在本发明的特定具体实施方案中，微生物的含水混合物和一种或多种植物原料包含至少1%盐和/或至多10%的盐。本发明的这些实施方案还可以用于生产#唐，通过省略步-骤将^f唐转化为乙醇。本发明也4是供了生产乙醇的方法，其中，混合酶一皮用于降解给定的才直物原料，在降解过程中生成的单并唐4皮用于生产乙醇。4吏用本领i或内已知的4壬意方法生产乙醇知道，乙醇可以通过多种途径生产。在一种具体实施方案中，乙醇通过酵母菌的孩丈生物降解产物中生成。混合酶为响应给定植物原料的存在而在变形菌抹2-40中表达量才是高的两种或更多种酶。这些酶可以通过在此领域熟知的任何方法从变形菌林2-40中获得。在本发明的特定具体实施方案中，蛋白质和一种或多种才直物原并牛的含水混合物包含至少1%盐和/或至多10%的盐。在其他特定具体实施方案中，变形菌林2-40在第一份植物原料中生长直到OD,值从大约0.3增加到大约0.5。在其他特定具体实施方案中，变形菌4朱2-40生长直到OD6oo值/人大约5增加到大约10。在其他特定具体实施方案中，变形菌林2-40生长直到OD,值大于10。这些具体实施方案可以通过不添力口酵母而用于生产并唐。在一皮用于降解*会定植物原并牛的混合酶的更多特定具体实施方案中，该发明包括含有Cel5H和Cel5I—种配方。在其他特定具体实施方案中，该发明包括含有Cel5H和Cel5F的配方。在一皮用于降解,会定才直物原并牛的混合酶的可^办4戈的具体实施方案中，该发明包括含有Cel5F，Cel5H,Cel51,Cep94A和Cep94B的配方。在更多特定的具体实施方案中，本发明包4舌进一步含有Cel6A,Bgl3C和Cel9B的配方。在更多特定的具体实施方案中，本发明包括进一步含有Cel5A、Cel5B、Cel5C、Cel5D、Cel5E、Cel5G、Cel5J、Cel9A、BgllA、BgHB、Ced3A和Ced3B的配方。在附加的具体实施方案中，本发明的组成物进一步包含酵母。在被用于降解给定植物原料的混合酶的可替代具体实施方案中，本发明包括含有Cel5E、Cel51、Cel9A、BgllA和Ced3B的配方。在更多特定具体实施方案中，本发明包括进一步含有Cel5B、Cep94A和Cep94B的配方。在附力口的具体实施方案中，本发明的组成物进一步含有酵母。在被用于降解给定植物原料的混合酶的可替代具体实施方案中，本发明包括含有Cel5F、Cel9A、BgllA和Ced3B的配方。在更多特定的具体实施方案中，本发明包括进一步含有Cel5B、Cel5E、Cel51、BgllB、BgBC、Cep94A和Cep94B的配方。在附加的具体实施方案中，本发明的组成物进一步包含酵母。在被用于降解给定植物原料的混合酶的可替代具体实施方案中，本发明包括含有Cel51、BgllA、BgllB、Ced3B和Cep94B的配方。在更多特定的具体实施方案中，本发明包括进一步含有Cel5A、Cel5G、Cel9A、Bgl3C和Cep94A的配方。在附加的具体实施方案中，本发明的组成物还进一步包括酵母。在被用于降解给定植物原料的混合酶的可替代具体实施方案中，9本发明包括含有Cel5E、Cel5F、Cel5H、Cel(3A和Cel9B的配方。在更多特定的具体实施方案中，本发明包凌舌进一步含有Cel51，Bgl3C和Cep94A的配方。在其4也特定具体实施方案中，本发明包4舌进一步含有Cel5C，Cel5D和Ced3A的配方。在附加的具体实施方案中，本发明的组成物进一步包括酵母。在一皮用于降解纟会定植物原料的混合酶的可替代具体实施方案中，本发明包括含有Xynl0a,Xynl0b和Xynlla的配方。在更多的特定具体实施方案中，本发明包4舌进一步含有XynlOD和XynllB的配方。在附加的具体实施方案中，本发明的组成物进一步包4舌酵母。图1为柱状图，显示在不同的底物下，S.degradans的生长率。图2表示从在0.1%大麦p-葡聚糖或者HE纤维素上生长的S.degradans中提取的蛋白质的SDS凝胶图，该凝胶图通过刚果红染色。图3显示的柱状图示在葡萄糖，谷类，艾维素和新闻纸存在的条件下培养的S.degradans中纤维素分解酶的相对表达量。柱形脱离图的比例尺寸，以它们上面的标号表示。图4是线形图，表示当在纤维素上超时生长时，在变形菌林2-40中cel5A,cel5H和cel51的表达倍-凄丈变化<直。图5为线性图，表示当在纤维糊精，纤维二糖,cellotraose和艾维素上生长时，在变形菌林2-40中cel5H的相对表达水平。图6为^主状图，表示在木聚并唐存在下i咅养的S.degradans中的hemicelIul水解酶的表达倍数变化值。图7为柱状图，表示在木聚糖存在的条件下，在不同时间上，在S.degradans中hemicellullytic酶的表达^f咅凄t变^HM直。具体实施例方式变形菌2-40是一种海洋细菌，能够使用分泌的和表面连接的酶降解存在于高等植物细J包壁的所有的聚合体。这种细菌具有特殊的能力能够在不做化学预处理的条件下糖基化所有植物原料。例如，这种细菌能够以如下原^H乍为p舉一碳源(在相同浓度下的细月包增代时间，h):葡萄外唐(2.6),艾维素(2.25),燕麦斯《風尔特小麦木聚糖(1.6),新闻纸(>6)，整体和粉石卒的谷类叶片(>6),和磨碎的黍属vigatum叶片(>6),这种细菌表明能够协同有效生产半纤维素酶，胶质酶，纤维素酶，和可能地木质素酶。基因组序列分析预测这种细菌能够生产至少12种内切葡聚糖酶，1种外切酶，2种纤维糊4青酶，3种纤维二4唐酶，7种木聚4唐酶，IO种"阿拉伯树胶酸酶"，5种甘露聚糖酶，和14种力交质酶。酶语分析和培养物的蛋白质组学分析表明这些酶的子集是在每种上述底物上生长期间一皮i秀导生成的。特定酶的i秀导生成通过qRT-PCR评定。这些特定酶的命名在美国专利申请号为11/121,154的申请中有进一步的详细解释，该专利于2005年4月4号递交，7>开号为2006/0105914，该申i青通过引i正在ot匕全部并入本文。S.degradans能有效的降解植物原料，因此，产物由植物原料构成。因而，在特殊植物原料存在下，在S.degradans中混合酶的诱导表达表明单个酶和酶的混合物在S.degradans存在的条件下，都能有效的降解植物原料。这个意思是指响应特定的植物原泮+,在SI.degradans中两种或多种酶的才是高的或维持不变的高表达，将^皮用于形成酶的混合物，用以降解才直物原并牛。通过S.degradans有效降解为单并唐的两种才直物原冲+类型为富含纤维素和半纤维素的才直物原冲+。降解这两种-友水4b合物的酶系统在下面僻:了更详细地描述。纤维素S.degradans2-40为了降解纤维素成单4唐而表达了许多酶。例如，在谷类叶片存在的条件下，纤维素分解酶列于表l中，下面是增加的。表1予贞观'JS.degradans菌才朱2-40白勺纟千纟t素酵和W十属酵，禾口支持他们鉴定的证据。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在谷类叶片存在的条件下，由S.degradans产生的表达量增加的酶可能是分解谷类叶片生成糖所必须的。因此，酶的表达量增加超过20倍，即，cel5F，cel5h在降解谷类叶片方面是有效的。进一步地，在表1中列出的所有或任4可4交少量的纤维素分解酶的混合物与表l中列出的表达量的增加成正比或反比，或与图3中的相对表达量成正比或反比，用于形成一种有岁文的酶复合物，以降解谷类叶片。使用表l提供的信息，针对葡萄糖，新闻纸或艾维素生成对应的混合物。更进一步的，降解其他才直物原并+的混合物的生成是通过暴露S.degradans于该一直物原^H得来的，通过检测降解酶的RNA,蛋白质或活性程度来测定降解酶的表达。此外，在表2中列出的酶是当暴露于化学纯形式的艾维素10个小时后，在S.degradans中"i秀导生成的酶。表2在艾维素上，S.degradans菌4朱2-40经过10个小时生长后，酶的倍凄t增加。在艾维素上生长10个小时后的倍数增加基础表达低中高(<5)(5-25)(>25)低(<1%GK)ce膨中(2-10%)，C高(>10%)，A，S看来好像cel5A、cel5G、cel9A、cel5B、ced3B、bgllA和cep94B在S.degradans2-40中不受底物;农度影响而#1表达。在艾维素上生长2个小时后，cel9A的表达增加。4妄着在4个小时后，cel5F表达增力。，在10个小时后cel5H和cel5I表达增加。在艾维素上培养24小时，Cel51将继续被过量表达。已经表明Cel51和Cel5H对降解纤维素尤为重要。当SI.degradans2-40暴露于纤维素(图4)时，Cel5I将"i秀导表达超过500倍，cel5H超过1004咅。ot匕夕卜，当S.degradans2画40暴露于纤维糊^f青，例如纤维二if唐，cellotraose和纤维糊^青(图5)时，cel5H表达超过500倍。因此，这些蛋白质的任何一个都能用来有效的降解纤维素生成单4唐。更进一步的，当暴露于特定的植物原料时，在S.degradans中高表达的降解作用酶可能不受底物浓度影响和/或在工程菌中过量表达，因此，可以制备一种工程菌，该菌能够有效的降解特定的植物原料。例如，在表l中的，在谷类叶片存在的条件下，在S.degradans中诱导生成的蛋白质混合物，可以被这种菌釆用，以便使它们能够不受底物浓度影响而被表达。这些蛋白质也可以被引入，所以它们能够高速的表达。这些工程菌可以用来降解植物原#牛，在这个例子中，为谷类叶片。在一种具体实施方案中，被工程化的菌为S.degradans。在另一种具体实施方案中，在大肠杆菌中，菌^皮工程化。半纤维素S.degradans2-40表达许多降解半纤维素生成单#唐的酶。半纤维素为糖单体的短分支链。组成半纤维素的糖包括戊醛糖，甘露糖，半乳糖，和/或阿拉伯糖。半纤维素与纤维素和果胶形成一系列的交^:,而形成坚固的细胞壁。不同于纤维素，半纤维素主要是无定形的，相对不牢固的和易发生水解的。S.degradans生产i午多半纤维素酶，该酶能够3皮用于降解半纤维素生成单糖。如图6所示，在包含半纤维素的木聚糖上生长的S.degradans2-40中的xynlOA、xynlOB、xynlOD、xynllA和xynllB的表达3皮omduced。此夕卜，如在图7中显示的，在木聚糖上培养S.degradans2-4010个小时后，将有xynlOA，xynlOB，xynlOD,xynllA禾口xynllB的表达。，然而，在2个小曰于，表达量i曾力口最大的为xynllA和xynllB，而在4个小时，在木聚糖上培养的S.degradans2-40中表达量i曾力口最大^i为xynlOA。因jt匕，XynlOa,XynlOb,XynlOd，Xynlla和Xynllb只于于降解半纤维素生成单#唐都是重要的。然而，需要特别重点强调的是XynlOa,XynlOb,Xynlla和Xynllb的重要性。S.degradans蛋白质在大肠菌中的克隆和表达基本的克隆和表达系统为，使用pET28B(Novagen)作为载体，大肠杆菌DH5a(invitrogen)作为克隆菌4朱，和大肠杆菌BL-21(DE3)ROSETTATM细胞(Novagen)作为蛋白表达菌才朱。这个系统允许克隆有毒或相当困难的基因，因为该载体在T7lac启动子控制下表达，在克隆冲朱DH5a缺失该启动子，,人而在质粒筛选和增殖期间，能够消除较低水平的表达。在通过蓝/白斑筛选后，质粒从DH5a纯化，并转染到宿主中表达。ROSETTATM菌4朱具有T7lac启动子，允许IPTG诱导表达载体编码的蛋白质，并缺失Lon和Omp蛋白酵。基因才莫型的核苷酸序列是,人DOEJGI'sS.degradans基因组网络服务器中获得，并且进入PRIMERQUESTTM设计工具。设计参数最佳Tm为60，最佳引物长度为20nt，最佳GC。/。50,选定产物大小范围，所以选择的引物在每个ORF的第一个和最后IOO个核苷酸之内，以4更能够尽量克隆出更多的基因。克隆和表达载体，pET28B，提供C末端6x组氨酸融合以及起始和终止蛋白质表达的密码子。因此，载体的设计要小心注意，当增力口5'限制酶切位点到PCR引物时，插入序列是需要的。形成的"加尾引物"要在26到30nt长之间，它们的序列要通过"有效的克隆"分析使用PDRAW程序包^皮核实。这一i殳计要允许载体和插入脱氧核糖核酸顺序能够净皮标准限制性内切酶切割和一皮连接在一起。检测目标序列的氨基酸翻译以便检测由于引物设计错误所造成的4壬<可读才匡移4立。通过才企测后，引净勿可以乂人Invitrogen购买(Frederick,Md.)。PCR反应的5(H效升反应体系包含10pMol的正反向引物，1孩i升的10mMDNTPs，1.5孩i升的100mMMgCl2，和1樣￡升PROOFPROPfu聚合酶和0.5孩丈升作为才莫一反的2-40基因组DNA。PCRs条件使用针对加尾引物的标准参数和PfuDNA聚合酶。PCR产物通过QIAGENQIAquickPCR纯化试剂盒而一皮纯化，通过0.8。/。琼脂糖凝胶7见察。在纯化和大小证实后，PCR产物和pET28B被适当的限制性内切酶消化，通常为Ascl和CIaI在37。C反应1到4小时，使用QIAquick试剂盒纯化，通过琼脂糖凝胶观察。纯化的消化物通过使用T4DNA连接酶在室温下的黑暗处连接反应至少2个小时。连接产物通过电穿孔的方式转化入大肠杆菌DH5a中。转化细胞在37'C非选择性的培养基中孵育1个小时，才妄着涂布于含有氨千青霉素和X-gal的LB琼脂上。作为pET28B载体，Ampr基因和插入物被克隆到lacZORF中，白色群体包含插入序列。白色菌落通过牙签^兆取，涂布在新的LB/Amp/X-gal平皿上，同时三个插入码菌落也被用于过夜接种到3ml的肉汤中。从对应于插入码菌落的肉汤中制备质粒，该菌落在过夜生长后然保持白色。这些质粒的制备通过适当的限制性内切酶各自地消化，通过琼脂^唐电泳进^f于大小确定。接着质粒^皮热激转化到ROSETTATm菌抹中。转化细胞在非选择性的拯救培养基中，37。C培养1个小时，接着涂布在含有Amp和Cm(ROSETTAi咅养基)的LB琼月旨上，37。Ci告养过夜。因此选择的任何菌落都应包含载体和插入物。这个通过插入三个菌落到ROSETTATM培养板中和过夜接种到对应3ml的肉汤中来16确定。次日早晨肉汤被用于接种到25ml的肉汤中，培养到OD600值大约为0.6(2-3个小时)。此时，从培养物中取出lml,离心和重悬于1/10体积IxSDS-PAGE上样緩沖液中。这种预处理的样品冻存于陽20°C中，以<更后来的Westernblots的4吏用。余下的肉汤加入1mMIPTG,37。Ci咅养4个小时。i秀导生成的沉淀才羊本以每小时间隔收集。这些样品和预诱导的空白样本同时经过标准SDS-PAGE凝胶分离，电转移到PVDF薄膜或硝化纤维薄膜上。这些薄膜4吏用1/5000稀释的小鼠a-HISTAG单克隆一抗进行免疫印迹反应，，接着与HRP标记的山羊a-小鼠IgG作为二抗进4亍杂交。条带通过使用BioRad'sOpti-4CN底物试剂盒进行显色。在诱导样品中存在His标记的条带，而在空白对照中没有相应条带，这将证明表达的成功，同时通过每小时的时点条带的比较来最佳化在随后大规模纯化中的诱导参数。重纟且蛋白质的生产和纯4匕表达菌4朱在500ml或1升ROSETTATM培养基的肉汤中生长至)JOD6o。为0.6至'J0.8。it匕日寸，3一"i秀导才羊口口口寻皮j]欠集，通过力口入100mMIPTG到余下的培养基中，使终浓度为1mM而进4亍诱导培养。诱导在37。C进行4个小时或者在25。C进行16个小时。培养物沉淀被收集，过夜冻存于-20。C储存，以便帮助细胞溶解。然后沉淀物在)水上解冻10分4中，转移到预称重的falcon离心管中，并称量重量。接着样品在4ml裂解液/湿粒料重量(g)中(8M尿素，100mMNaH2P04，25mMTris，pH8.0)中，25。C〉、昆悬1个小时。裂解物在15,000g条件下离心30分钟，除去细胞石争片。澄清的溶解产物(浮在表面的)吸入干净的falcon管中，其中，在每4ml澄清裂解物中加入1mlQIAGEN50%Nickel誦NTA树脂。这些混合物在室温下，轻轻搅动以促进N广2离子和重组体蛋白质的His标签之间的结合。结合完成后，悬浮液转移到一次性微型柱中，流过物(结合后余下的溶解产物)；陂收集，保存以便随后的评定。树脂通过裂解緩沖液洗两次，纟爰冲液的pH值要调到7.0;每次洗液的体积等于原始澄清裂解物的体积。两次清洗的流过物也要收集，用于后来的免疫印迹实验，来估计纯化效率。此时柱中包含相对纯化的重组体蛋白质，这些重组体蛋白质由它们C末端的His标签而被固定。这对于重折叠是理想状况，所以将柱子移入4。C的房间，并用一系列复性纟爰冲剂冲洗该柱，复性緩沖剂中含有不断降低浓度的尿素。复性緩冲剂包含变化量的尿素溶于25mMTrispH7.4,500mMNaCl和20%甘油。这种纟爰冲剂可制备包含6M,4M,2M和IM尿素的^f诸液。耳又出^f诸液的一部分4艮容易能混合形成5M和3M尿素溶液，因此能够以1M为梯度的，一系列降低浓度的尿素溶液。相当于原始裂解物体积的6M緩冲剂流洗过柱，接着为等体积的5M緩沖剂，然后再接着1M的緩沖剂，其中1M的緩冲剂冲洗两次，以保证在1M尿素中柱子的平衡。此时，重折叠蛋白经过8次1/10原始体积的抽才是液进4亍才是耳又，其中4由^是液为1M尿素，25mMTrispH7.4，500mMNaCl,20%甘油并包含250mM。米唑。。米唑用来断裂4臬离子和His标签的相互作用，从而释》文柱中的蛋白质。免疫印迹反应用来评估His标签蛋白质在消耗的裂解物，两次洗液，和4由才是组分中的量。如果重组体蛋白质在消一毛的裂解物和/或洗液中含量丰富时，那么就可能要重复上述过程从而得到更多的蛋白质。抽提液组分包含目的蛋白质，要将它们合并，富集并使用centricon离心超滤装置(Millipore),将它们保存于储存緩冲液中(20mMTrispH7.4,lOmMNaCl,10%甘油)。4妻着分出一部分，冻存于-80。C，以1更用于酶活性;险测试—验。实施例下列例子进一步的支持，并不是专门的展现本发明的较优选的具体实施方案。酶的电泳分布图流程所有活性凝月交都制备为标准SDS-PAGE;疑月交，并含有适当的CP底物，它们一起用分离凝胶分离。酶色谱使用8%聚丙烯酰胺浓度，底物溶于dH20和/或凝l交緩冲溶液，使终浓度为0.1%(HE-纤维素)，0.15%(大麦P-葡聚糖)，或0.2%(木聚糖)。样品溶于终浓度包含2%SDS和100mM二好^苏糖醇(DTT)的上样緩冲液中，并与95。C煮沸8分钟，接着凝月交按照Laemmli的程序，在非连续的条件下进行电泳分离。电泳完成后，凝胶在室温80ml的复性緩冲液中浸泡1小时，复性緩冲液为20mMPIPES緩沖剂pH6.8,其中包含2.5%TritonX國100,2mMDTT和2.5mMCaC12。钙离子用来帮助潜在的钙结合结构域的重折叠，例如LamlA的tsp3s。l个小时浸泡后，凝胶放于80ml的复性緩冲液中，4。C过夜并伴随温和震荡。次日早晨。凝"交在室温的条件下，；故于80ml的20mMPIPESpH6.8溶液中平衡1个小时，然后转入干净的容器中，用最少量的PIPES緩沖剂覆盖，37。C孵育4个小时。聘育完后，凝胶使用0.25。/。刚果红的水溶液(HE-纤维素，(3-葡聚糖和木聚糖)或者0.01曱苯胺蓝的7%乙酸溶液进行染色30分钟。对于刚果红染色，凝』交-使用1M的NaCl脱色，对于^f吏用曱苯胺蓝染色的凝月交，-使用dH20脱色，直到相对于背景色，能看见清楚的蛋白条带为止。19实施例1:基因型分型的方法在不同底物上培养的S.degradans的生长速率(图1)。基础培养基含有(2.3%速溶海盐，0.05%酵母抽提物，0.05%NH4C1,15mMTris,pH6.8)。对于葡萄并唐，戊醛#唐，纤维二糖，阿4立伯糖，木聚糖，艾维素，其中每种碳源的终浓度为0.2%,而对于新闻用纸，柳沖支牙菱，和谷类叶片终浓度为1.0%。S.degradans生长于所有它生长的才直物原并牛上。酶的电泳分布图的方法用于发现哪种葡聚糖酶在不同的细胞壁聚合体(图2)上会被诱导生成。细胞在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长到OD,为0.3-0.5,收获细胞，转移到含有同样体积的培养基中，该培养基包含指定的诱导物。在指定的时间收集样品，样品中的蛋白质规3各化到OD600,接着使用标准SDS-PAGE分离，其中在分离月交中含有0.1%大麦P-葡聚糖或HE纤维素。凝胶在复性緩沖液(20mMPIPES[哌。秦-N,N'-双(2-乙烷磺酸基酸)]緩冲剂[pH6.8]，2.5%TritonX誦100,2mM二碌b苏4唐醇,2.5mMCaCl2)中室温孵育1小时，冲妄着在4"C新鲜复性纟爰冲液中孵育过4艾。凝月交4妄着转入PIPES緩冲液中，37。C孵育，在0.25%刚果红中染色。计算分子量(kDa)在左边给出。使用不同植物原料或不同糖源的条件下，不同的葡聚糖酶被表达。在葡萄糖和细胞壁聚合体上生长时，纤维素水解酶的表达被确定(图3)。S.degradans在葡萄并唐上i咅养到OD60。0.3-0.4，收获细胞，转到包含指定底物的等体积培养基。10个小时后，使用RNAprotect菌i式剂(Qiagen)和RNEASYMiniKit(Qiagen)分离RNA。使用QIANTITECT反转录试剂盒合成cDNA。每种指定基因的120-200bp片,殳或者两个作为对照基因的鸟芬酸激酶和二氢叶酸还原酶4吏用SYBRGreen标准混合试剂盒(Roche)和LIGHTCYCLER480(Roche)进行扩增。在它们上面标有号码的柱图按照1/10比例显示。不同的纤维素分解酶通过不同的植物原料或糖源诱导表达。实施例2S.degradans在木聚并唐上生长时，XynlOA,XynlOB,XynllA和Xynl旧表达量增力口的测定为六个目标基因i殳计引物xynlOA-D和xynllA-B,和两个看家基因二氢叶酸还原酶和鸟苷酸激酶。S.degradans在葡萄糖培养基中培养直到OD,达到0.370-0.400。记为0小时点，培养物转移到木聚糖培养基中进行10小时的实验。秒计的培养物转移回来作为对照。从木聚糖和葡萄糖培养物中在0,2,4和10小时耳又才羊品。每个才羊品的RNA4吏用RNAprotect菌i式剂(Qiagen)禾口RneasyMiniKit进4亍4是纯。分离得到的mRNA4吏用QuantiTech反转录酶进4亍转4匕，4吏用LightCyclerPropRT-PCR分才斤表达图i普。如在图6中戶斤示，所有的xynlOA,xynlOB,xynlOD,xynllA禾口xynl旧在暴露于木聚糖2，4，和IO小时后，都有mRNA的高表达。xynlOAxynlOB,xynllA和xynl旧表达增加最多。如在图7中所示，S.degradans在木聚糖上培养，在2小时时，xynllA和xynUB具有最高的mRNA表达倍数变化。XynlOA在4小时时，达到最大表达倍数。在10个小时时，xynlOA,xynlOB，xynllA和xynUB都有较高的"i秀导表达4咅凄t。当培养物含有木聚糖时，S.degradans能够增加这些蛋白质的表达量，根据这些蛋白质的序列同源性可以知道它们为半纤维素酶基因，XynlOA,XynlOB，Xynl0D,XynllA和XynllB是功能性的半纤维素酶，能用于降解半纤维素。同等物和通过引i正并入本领域普通才支术人员能够但J又通过常*见实马全而识另'j或确定在此描述的特定多肽，核香酸，方法，试-睑和试剂的许多等同物。这些等同物^皮i人为包含于本发明的范畴内，这些等同物包含在下列的权利要求书中。本申请包括许多已知文本，发表的文章，和专利申请以及在u.s.发行和外国发行的专利的引证，所有这些引i正的全部内容通过引述在此全部并入本文。权利要求1.包含Cel5H和Cel5I的组合物。2.包含Cel5H和Cel5F的组合物。3.包含Cel5F、Cel5H、Cel51、Cep94A和Cep94B的组合物。4.根据权利要求3所述的组合物，进一步包含CelA,Bgl3C和Cel9B。5.根据权利要求4所述的组合物，进一步包含Cel5A、Cel5B、Cel5C、Cel5D、Cel5E、Cel5G、Cel5J、Cel9A、BgllA、Bgl旧、Ced3A和Ced3B。6.才艮据4又利要求3所述的组合物，进一步包含酵母菌。7.包含Cel5E、Cel51、Cel9A、BgllA和Ced3B的组合物。8.4艮据4又利要求7所述的组合物，进一步包含Cel5B、Cep94A和Cep94B。9.才艮据4又利要求7所述的组合物，进一步包含酵母菌。10.包含Cel5F、Cel9A、BgllA和Ced3B的组合物。11.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含Cel5B、Cel5E、Cel51、BgHB、Bgl3C、Cep94A和Cepp94B。12.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含酵母菌。13.包含Cel51,BgllA、Bgl旧、Ced3B和Cep94B的纟且合物。14.才艮据4又利要求13所述的组合物，包含Cel5A、Cel5G、Cel9A、Bgl3C和Cep94A。15.根据权利要求13所述的组合物，进一步包含酵母菌。16.包含Cel5E、Cel5F、Cel5H、CelA和Cel9B的组合物。17.才艮据权利要求16所述的组合物，进一步包含Cel51、BgBC和Cep94A。18.根据权利要求16所述的组合物，进一步包含Cel5C、Cel5D和Ced3A。19.才艮据4又利要求16所述的组合物，进一步包含酵母菌。20.包含Xynl0a、XynlOb和Xynlla的组合物21.根据权利要求20所述的组合物，进一步包含XynlOD和XynllB22.生产乙醇的方法，该方法包括-l是供变形菌一朱2_40;存在于水相混合物中的一种或多种才直物原坤+和酵母菌，/人而生产乙醇。23.根据权利要求22所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至少1%的盐。24.根据权利要求22所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至多10%的盐。25.生产糖的方法，包括纟是供变形菌4朱2_40;存在于水相混合物中的一种或多种才直物原料，乂人而生产并唐。26.根据权利要求25所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至少1%的盐。27.根据权利要求25所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至多10%的盐。28.从植物原料生产乙醇的方法，包括a.提供变形菌抹2-40;b.变形菌抹2-40生长在第一份的植物原料中；c.从变形菌抹2-40中提取蛋白质；和d.将蛋白质与第二份植物原料和酵母菌在J^容液中混合，乂人而生产乙醇。29.根据权利要求28所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至少1%的盐。30.根据权利要求28所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至多10%的31.根据权利要求28所述的方法，其中，变形菌株2-40在第一份植物原料中生长，直到OD綱从大约0.3增加到大约0.5。32.根据权利要求28所述的方法，其中，变形菌抹2-40在第一4分才直物原术+中生长，直到OD6卯乂人大约5增加到大约10。33.从植物原料生产糖的方法，包括a.提供变形菌林2-40;b.变形菌抹2-40生长在第一份的植物原料中;c.从变形菌林2-40中提取蛋白质；和d.将蛋白质与第二份植物原料在水溶液中〉、昆合，/人而生产#唐。34.根据权利要求33所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至少1%的盐。35.根据权利要求33所述的方法，其中，水相混合物进一步包含至多10%的36.^4居^L利要求33所述的方法，其中，变形菌4朱2-40在第一份植物原料中生长，直到OD6o。从大约0.3增加到大约0.5。37.才艮据4又利要求33所述的方法，其中，变形菌4朱2-40在第一份植物原料中生长，直到OD,从大约5增加到大约10。全文摘要本发明涉及细胞壁降解系统，尤其涉及到包含结合和/或解聚纤维素，半纤维素和其他碳水化合物的酶系统。这些系统已经有了许多的应用。文档编号C12N9/14GK101688189SQ200880022015公开日2010年3月31日申请日期2008年4月30日优先权日2007年4月30日发明者R·威内尔,S·赫特切桑,张海涛申请人:马里兰大学