专利名称：：双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体。
背景技术：
：含有两个或两个以上基因的转化载体在基因治疗以及获得优良性状转基因体应用中起着重要的作用。常见的表达一个以上基因的转基因载体包括多个启动子，内部核糖体进入位点元件(IRES)，拼接信号和融合蛋白。但使用多个启动子可能会存在两个启动子之间的相互作用、启动子沉默、载体重排或删除等问题。双向启动子能够调节两个下游的基因而受到极大的关注。通常，以头对头方式排列的两个基因，它们转录起始位点之间约有小于lOOObp的核苷酸，这种基因内部小于lkb长的核苷酸区域，两侧都含有转录起始位点TSS(基因正链一边有TSS，基因负链一边也有TSS)定义为双向启动子。双向启动子可以被简单地看成是两个单向启动子共用同一个基因组空间。双向启动子在低等生物大肠杆菌、青霉菌、曲霉菌、埃希氏菌、锥体虫以及高等生物植物、动物、人类中都有发现和应用。
发明内容本发明的目的是提供一种双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体。本发明所提供的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体是在出发载体的多克隆位点插入如下DNA分子的重组表达载体自5'末端依次含有fcoRI酶识别序列、NoS终止子、5acl酶识别序列、A如I酶识别序列、红色荧光蛋白基因、5i肪ll酶识别序列、5sMII酶识别序列、酶识别序列、双向启动子、i7olI酶识别序列、5/^I酶识别序列、绿色荧光蛋白、历'刀din酶识别序列、^al酶识别序列、fe7I酶识别序列、NoS终止子和67al酶识别序列；所述双向启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5'末端第5917-6834位。所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1自5'末端第4536-7858位。所述出发载体可以为各种从商业途径获得的表达载体，如酵母表达载体、植物表达载体或大肠杆菌表达载体等。所述重组表达载体的核苷酸序列可为序列表中的序列l。所述DNA分子也属于本发明的保护范围。含有所述DNA分子、所述重组表达载体的转基因细胞或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体具备通过直接酶切连接简单操作就可以用于融合功能基因的目的。本发明的双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体侵染烟草，获得转基因烟草植株，经过验证，两个方向的荧光报告基因^^和/^《ey得以表达，说明该载体双向启动子具有两个方向的转录活性，可以将外源基因通过酶切位点替换掉任意一个报告基因，从而便捷地进行重组表达载体构建，构建的重组表达载体能够同时表达目的蛋白和荧光蛋白，便于筛选。图1为AD的PCR电泳图。图2为pBD-AD-930酶切鉴定图。图3为通用型植物双向启动子表达载体图谱。图4为转基因烟草和对照中GFP和dsRed的表达结果。具体实施例方式下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。实施例1、构建通用型植物双向启动子表达载体构建通用型植物双向启动子表达载体在pBI121载体基础上，用^^基因换掉卵5基因得到的pl31质粒，以pl31质粒为模板，Dl、D2为引物PCR扩增Pmini至终止子的一段序列Dl:5，-AAGCTTGGTACCCCTTCGCAAGACCCTTC-3，，D2:5'-GAAGCTTGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3，。PCR扩增条件为预变性94。C5mins;94°C30s，67°C30s，72°Clmin，25循环；72°C10mins;4°C保存。将PCR产物回收，与pMD18T-Vector连接，构建克隆载体pT—MGN，在LB培养基上进行蓝白斑筛选。挑取几个白斑培养，提取质粒，HindIII酶切初步验证后，并送公司测序。HindIII酶切克隆载体pT—MGN再用，回收1.3kb目的片段，与HindIII酶切的pBI121质粒进行连接，构建双向双报告基因的植物二元表达载体pBDGG。设计引物a、b、c和d，它们的核苷酸序列如下a:5'-GGTCTAGACTCGAGAGGAGGGTCGACGTCCGCAAAAATCACCAGTC-3';b:5'-GTGACCATGATTACGCCAGGGTTGTCACTGGATTTTGG-3';c:5'-GCCAAAATCCAGTGACAACCCTGGCGTAATCATGGTCA-3，；d:5'-GGATCGATGGTTTCATTGGTGACG-3'。其中，引物a中带有JZalI、J力oll、5kH和noster的识别序列；弓l物b中含有突变的历"dIII位点(aggcct—agggtt);弓l物c与引物b是反向互补的两条引物；引物d中含有67sl酶识别序列。以a和b为引物，以载体pBDGG为模板，PCR扩增，得到的PCR产物命名为AB;反应体系为总体积100W，模板100ng、引物al5pmo1、引物bl5pmo1、10XPCR缓冲液IOW、10XdNTPIOW、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。以c和d为引物，以载体pBDGG为模板PCR扩增，得到的PCR产物命名为CD。反应体系为总体积100(4，模板100ng、引物cl5pmo1、引物dl5pmo1、10XPCR缓冲液10W、10XdNTP1014、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。AB和CD等量混和做模板，以a和d为引物PCR扩增，得到PCR产物命名为AD。反应体系为总体积100W，模板100ng、引物cl5pmo1、引物dl5pmo1、10XPCR缓冲液1(^1、10XdNTP10(4、Taq酶2.5U，其余为灭菌水。上述PCR反应程序94°C5min，退火温度分别为65°C、63°C、61°C、59°C、57°C、55。C和72。C，共30个循环，最后延伸10min。AD的电泳结果如图2所示，图2中，Ml:100bpDNALaber、2禾卩3:PCR产物AD、M2:15000分子量标准。经IteI和aal双酶切的AD和与同样双酶切的载体pBDGG连接，构建重组载体pBD-AD。fcoRI和feci双酶切载体pBDGG，回收2839bp的片段，与同样双酶切的载体pUC18连接，构建重组载体pUC-E-S。Ial和双酶切pUC-E-S，回收930bp的片段，与同样双酶切的pET30a连接，构建重组载体pET-930。将重组载体pET-930用勤力I，沿'/7dlII双切后，用乙醇沉淀回收，用T4DNAPolymerase和KlenowFragment处理，即消掉此2个酶切位点。勤/I，历Vdin双酶切体系100ul:质粒pET-930110ug，v^wl5ul，历'/dl113ul,10XMbuffer10ul，其余为灭菌水。37°C，3小时。向双酶切后体系中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)，再加入2倍体积的无水乙醇，-20°C，20min，12000rpm，离心10min，弃上清，再用70%乙醇漂洗沉淀后风干。将沉淀后的DNA用T4DNApolyraerase处理，25ul酶切体系如下腿4ug，10XT4DNApoly匿asebuffer2.5ul，0.1%BSA2.5ul，2.5mMdNTP2.5ul，T4DNApolymerase0.3ul其余为灭菌水。37。C，5min，苯酚/氯仿处理，乙醇沉淀回收，再用T4连接酶连接，转化JM109感受态，提取质粒。质粒用AVKini酶切，再用KlenowFragment处理，25ul体系如下质粒500ng，10Xbuffer2.5ul,dNTP终浓度0.lmM，klenowfragment0.5U，灭菌水补至25u1，，37。C，15min。苯酚/氯仿处理，乙醇沉淀回收，再用T4连接酶连接，转化JM109感受态，提取质粒。Pl:GCCCGGGATGAAGCTTGCCTCCTCCGA(含有SmaI识别序列)；P2:GGGAGCTCGGTACCCTAGGTTAGTGGTGGTGGTG(含有Kpnl和Sacl识别序列)；P3:GGCTCGAGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGG(含有Xhol和Spel识别序列)；P4:GGGTCGACGTTAACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC(含有HindiII、Hpal和Sail识别序列)。以pDsRed2-Cl(CLOTECH，USA)为模板，引物P1、P2用来扩增红色荧光基因dsRed;PCR反应程序为94。C变性30s，65。C退火30s，72。C延伸50s，共30个循环。以pEGFP-Nl(CLOTECH，USA)为模板，引物P3、P4用来扩增绿色荧光基因g/p。PCR反应程序为94。C变性30s，6(TC退火30s，72。C延伸50s，共30个循环。用0.8y。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，玻璃奶回收试剂盒回收的PCR产物，分别与pMD18-T载体连接，构建重组载体T-GFP和T-a^feASacl和Smal双酶切T-dsRed，回收735bp的片段，与同样双酶切的载体pBD-AD连接，得到载体pBD-AD-Red;和J力oLI双酶切pET-930，回收930bp的片段，并插入载体T-GFP，连接构建载体T-GFP-930;和双酶切切T-GFP-930和pBD-AD-Red，回收1726bp和12903bP的片段，将它们连接得到通用型植物双向启动子表达载体，其载体图谱如图3所示。2)通用型双向启动子表达载体转化烟草将通用型植物双向启动子表达载体电击转化农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入lmlYEB液体培养基28。C培养3小时，取200u1涂YEB抗性平板(卡那霉素50mg/l，利福平50mg/l)，28。C培养，获得的重组农杆菌用于烟草转化。方法参照《植物基因工程》。获得的转基因烟草用荧光显微镜(OLYMPUSBX-61)检测绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达。以野生型烟草作为对照。荧光显微镜结果如图4,在转基因烟草中绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白都有表达。说明本发明的通用型双向启动子表达载体能使外源基因在植物中表达。图4中A:对照；B:转基因烟草。序列表〈110〉北京林业大学<120>双向启动子双可视荧光蛋白报告基因植物表达载体〈160〉1〈210〉1<211〉14629<212>DNA〈213〉人工序列<220><230>〈400>1TGAGCGTCGCAAAGGCGCTCGGTCTTGCCTTGCTCGTCGGTGATGTACTTCACCAGCTCC60GCGAAGTCGCTCTTCTTGATGGAGCGCATGGGGACGTGCTTGGCAATCACGCGCACCCCC120CGGCCGTTTTAGCGGCTAAAAAAGTCATGGCTCTGCCCTCGGGCGGACCACGCCCATCAT180GACCTTGCCAAGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGATCTTCGCCAGCAGGGCGAGGATCGTGGC240ATCACCGAACCGCGCCGTGCGCGGGTCGTCGGTGAGCCAGAGTTTCAGCAGGCCGCCCAG300GCGGCCCAGGTCGCCATTGATGCGGGCCAGCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCC360CGTGATTTTGTAGCCCTGGCCGACGGCCAGCAGGTAGGCCGACAGGCTCATGCCGGCCGC420CGCCGCCTTTTCCTCAATCGCTCTTCGTTCGTCTGGAAGGCAGTACACCTTGATAGGTGG480GCTGCCCTTCCTGGTTGGCTTGGTTTCATCAGCCATCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCC540GGCGGTAGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGGATTCCCGTTGAGCACCGCCAGGTGCGAATA600AGGGACAGTGAAGAAGGAACACCCGCTCGCGGGTGGGCCTACTTCACCTATCCTGCCCGG660CTGACGCCGTTGGATACACCAAGGAAAGTCTACACGAACCCTTTGGCAAAATCCTGTATA720TCGTGCGAAAAAGGATGGATATACCGA嵐AATCGCTATAATGACCCCGAAGCAGGGTTA780TGCAGCGGAAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCG840GCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTT900ATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG960GGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTT1020GCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTA1080TTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGT1140CAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCAGAAGGCCGCCAGAGAGGCCGAGCGCGGCCGTG1200AGGCTTGGACGCTAGGGCAGGGCATGAAAAAGCCCGTAGCGGGCTGCTACGGGCGTCTGA1260CGCGGTGGAAAGGGGGAGGGGATGTTGTCTACATGGCTCTGCTGTAGTGAGTGGGTTGCG1320CTCCGGCAGCGGTCCTGATCAATCGTCACCCTTTCTCGGTCCTTCAACGTTCCTGACAAC1380GAGCCTCCTTTTCGCCAATCCATCGACAATCACCGCGAGTCCCTGCTCGAACGCTGCGTC1440CGGACCGGCTTCGTCGAAGGCGTCTATCGCGGCCCGCAACAGCGGCGAGAGCGGAGCCTG1500TTCAACGGTGCCGCCGCGCTCGCCGGCATCGCTGTCGCCGGCCTGCTCCTCAAGCACGGC1560CCCAACAGTGAAGTAGCTGATTGTCATCAGCGCATTGACGGCGTCCCCGGCCGAAAAACC1620CGCCTCGCAGAGGAAGCGAAGCTGCGCGTCGGCCGTTTCCATCTGCGGTGCGCCCGGTCG1680CGTGCCGGCATGGATGCGCGCGCCATCGCGGTAGGCGAGCAGCGCCTGCCTGAAGCTGCG1740GGCATTCCCGATCAGAAATGAGCGCCAGTCGTCGTCGGCTCTCGGCACCGAATGCGTATG1800ATTCTCCGCCAGCATGGCTTCGGCCAGTGCGTCGAGCAGCGCCCGCTTGTTCCTGAAGTGI860CCAGTAAAGCGCCGGCTGCTGAACCCCCAACCGTTCCGCCAGTTTGCGTGTCGTCAGACC1920GTCTACGCCGACCTCGTTCAACAGGTCCAGGGCGGCACGGATCACTGTATTCGGCTGCAA1980CTTTGTCATGCTTGACACTTTATCACTGATAAACATAATATGTCCACCAACTTATCAGTG2040ATAAAGAATCCGCGCGTTCAATCGGACCAGCGGAGGCTGGTCCGGAGGCCAGACGTGAAA2100CCCAACATACCCCTGATCGTAATTCTGAGCACTGTCGCGCTCGACGCTGTCGGCATCGGC2160CTGATTATGCCGGTGCTGCCGGGCCTCCTGCGCGATCTGGTTCACTCGAACGACGTCACC2220GCCCACTATGGCATTCTGCTGGCGCTGTATGCGTTGGTGCAATTTGCCTGCGCACCTGTG2280CTGGGCGCGCTGTCGGATCGTTTCGGGCGGCGGCCAATCTTGCTCGTCTCGCTGGCCGGC2340GCCAGATCTGGGGAACCCTGTGGTTGGCATGCACATACAAATGGACGAACGGATAAACCT2400TTTCACGCCCTTTTAAATATCCGATTATTCTAATAAACGCTCTTTTCTCTTAGGTTTACC2460CGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA2520TCATGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGACAAGCC2580GTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTCAGCCGCGGGTTTC2640TGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCC2700TAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCCACTGACGTTCCATAA27609ATTCCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCAATCCAAATAATCTGCACCG2820GATCTGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTT2880GGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG2940CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCG3000GTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCG3060TTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGG3120GCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCA3180TCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACC3240ACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATC3300AGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCA3360AGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGA3420ATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGG3480CGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCG3540AATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCG3600CCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGA3660CCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAG3720GTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCT3780CATGCTGGAGTTCTTCGCCCACGGGATCTCTGCGGAACAGGCGGTCGAAGGTGCCGATAT3840CATTACGACAGCAACGGCCGACAAGCACAACGCCACGATCCTGAGCGACAATATGATCGG3900GCCCGGCGTCCACATCAACGGCGTCGGCGGCGACTGCCCAGGCAAGACCGAGATGCACCG3960CGATATCTTGCTGCGTTCGGATATTTTCGTGGAGTTCCCGCCACAGACCCGGATGATCCC4020CGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC4080GATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATG4140CATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA4200CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAMCTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATC4260TATGTTACTAGATCGGGCCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTG4320GCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAG4380GCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTA4440ATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCA4500AACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTT4560CCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGG4620CTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTT4680CCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTGGCCCAATACGCAAACCGCCTC4740TCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAG4800CGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTT4860TACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACA4920CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGGGTTGTCACTGGATTTTGGTTTTAGGAAT4980TAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATA5040TGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAAGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCA5100CACATTATTCTGGAGAAAAATAGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTTT5160GCGGACGTCGACGTTAACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCC5220GGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCT5280CAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGAT5340GGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCG5400GATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTG5460GCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGAT5520GCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGT5580CTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCAT5640GGCGGACTTGAAGMGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCAC5700GCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCA5760GATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCT5820GAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAA5880CAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATACTAGTCTCGAGGTCCTCTCCAAATGAMTGAACTT5940CCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGGCAAGCTAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCA6000GATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGC6060AGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCC6120CAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAA6180AGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCA6240CAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAA6300GGCCATGGAGTCAAAGATTCAMTAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGA6360ACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGT6420GGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAG6480GGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCC6540AGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCA6600TCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA6660TGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAA6720GCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCC6780TTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGAC6840TCTAGAGGATCCCCCGGGATGAAGCTTGCCTCCTCCGAGAACGTCATCACCGAGTTCATG6900CGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAG6960GGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGC7020CCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTAC7080GTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAG7140TGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGCGACCGTGACCCAGGACTCCTCC7200CTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGAC7260GGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCC7320CGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGACCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCAC7380TACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTAC7440TACTACGTGGACGCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAG7500CAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGAGATCTCGAGCACCACCACCA7560CCACCACTAACCTAGGGTACCGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATA7620AAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTT7680GAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGT7740TTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCG7800CGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTCAC7860TGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCC7920TTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCC7980CTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT8040CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC8100CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGT8160AGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT8220AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTT8280GATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGG8340GGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATC8400AGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCCAGTACATTAAAAACGTCCGC8460AATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCTGCCACCA8520GCCAGCCAACAGCTCCCCGACCGGCAGCTCGGCACAAAATCACCACTCGATACAGGCAGC8580CCATCAGTCCGGGACGGCGTCAGCGGGAGAGCCGTTGTAAGGCGGCAGACTTTGCTCATG8640TTACCGATGCTATTCGGAAGAACGGCAACTAAGCTGCCGGGTTTGAAACACGGATGATCT8700CGCGGAGGGTAGCATGTTGATTGTAACGATGACAGAGCGTTGCTGCCTGTGATCAAATAT8760CATCTCCCTCGCAGAGATCCGAATTATCAGCCTTCTTATTCATTTCTCGCTTAACCGTGA8820CAGGCTGTCGATCTTGAGAACTATGCCGACATAATAGGAAATCGCTGGATAAAGCCGCTG8880AGGAAGCTGAGTGGCGCTATTTCTTTAGAAGTGAACGTTGACGATATCAACTCCCCTATC8940CATTGCTCACCGAATGGTACAGGTCGGGGACCCGAAGTTCCGACTGTCGGCCTGATGCAT9000CCCCGGCTGATCGACCCCAGATCTGGGGCTGAGAAAGCCCAGTAAGGAAACAACTGTAGG9060TTCGAGTCGCGAGATCCCCCGGAACCAAAGGAAGTAGGTTAAACCCGCTCCGATCAGGCC9120GAGCCACGCCAGGCCGAGAACATTGGTTCCTGTAGGCATCGGGATTGGCGGATCAAACAC9180TAAAGCTACTGGAACGAGCAGAAGTCCTCCGGCCGCCAGTTGCCAGGCGGTAAAGGTGAG9240CAGAGGCACGGGAGGTTGCCACTTGCGGGTCAGCACGGTTCCGAACGCCATGGAAACCGC9300CCCCGCCAGGCCCGCTGCGACGCCGACAGGATCTAGCGCTGCGTTTGGTGTCAACACCAA9360CAGCGCCACGCCCGCAGTTCCGCAAATAGCCCCCAGGACCGCCATCAATCGTATCGGGCT9420ACCTAGCAGAGCGGCAGAGATGAACACGACCATCAGCGGCTGCACAGCGCCTACCGTCGC9480CGCGACCCCGCCCGGCAGGCGGTAGACCGAAATAAACAACAAGCTCCAGAATAGCGAAAT9540ATTAAGTGCGCCGAGGATGAAGATGCGCATCCACCAGATTCCCGTTGGAATCTGTCGGAC9600GATCATCACGAGCAATAAACCCGCCGGCAACGCCCGCAGCAGCATACCGGCGACCCCTCG9660GCCTCGCTGTTCGGGCTCCACGAAAACGCCGGACAGATGCGCCTTGTGAGCGTCCTTGGG9720GCCGTCCTCCTGTTTGAAGACCGACAGCCCAATGATCTCGCCGTCGATGTAGGCGCCGAA9780TGCCACGGCATCTCGCAACCGTTCAGCGAACGCCTCCATGGGCTTTTTCTCCTCGTGCTC9840GTAAACGGACCCGAACATCTCTGGAGCTTTCTTCAGGGCCGACAATCGGATCTCGCGGAA9900ATCCTGCACGTCGGCCGCTCCAAGCCGTCGAATCTGAGCCTTAATCACAATTGTCAATTT996013TAATCCTCTGTTTATCGGCAGTTCGTAGAGCGCGCCGTGCGTCCCGAGCGATACTGAGCG10020AAGCAAGTGCGTCGAGCAGTGCCCGCTTGTTCCTGAAATGCCAGTAAAGCGCTGGCTGCT10080GAACCCCCAGCCGGAACTGACCCCACAAGGCCCTAGCGTTTGCAATGCACCAGGTCATCA10140TTGACCCAGGCGTGTTCCACCAGGCCGCTGCCTCGCAACTCTTCGCAGGCTTCGCCGACC10200TGCTCGCGCCACTTCTTCACGCGGGTGGAATCCGATCCGCACATGAGGCGGAAGGTTTCC10260AGCTTGAGCGGGTACGGCTCCCGGTGCGAGCTGAAATAGTCGAACATCCGTCGGGCCGTC10320GGCGACAGCTTGCGGTACTTCTCCCATATGAATTTCGTGTAGTGGTCGCCAGCAAACAGC10380ACGACGATTTCCTCGTCGATCAGGACCTGGCAACGGGACGTTTTCTTGCCACGGTCCAGG10440ACG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